黑茶水提物通过介导AMPK/mTOR信号通路调控自噬干预非酒精性脂肪肝的机制研究

李琳莉 夏旭婷 施敏 葛俊 毛彩薇 喻长红 刘富林

摘要：为探讨安化黑茶水提物对高脂高糖（HFHS）饮食诱导的非酒精性脂肪肝病（NAFLD）小鼠调控自噬改善脂肪变性的作用机制，将雄性C57BL/6J小鼠分为正常组、模型组、西药组（10 mg·kg-1）、黑茶低剂量组（0.75 g·kg-1）、中剂量组（1.5 g·kg-1）、高剂量组（3.0 g·kg-1）。采用HFHS饮食诱导小鼠NAFLD模型，造模的同時灌胃给药10周；试验结束后检测小鼠的肝指数、血脂、肝功能、肝脏病理指标、自噬指标及自噬相关信号通路表达水平。结果表明，与正常组相比，模型组小鼠肝指数和总胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）含量显著升高，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量明显降低；小鼠肝脏出现了脂肪变性的迹象，伴有大量大小不一的脂滴；微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）、Bcl-2相互作用蛋白1（Beclin1）、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶/腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK/AMPK）表达明显降低，隔离体蛋白1（p62）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR/mTOR）表达显著上升。与模型组相比，灌胃黑茶水提物可降低NAFLD小鼠肝指数和血清CHO、TG、LDL-C、AST、ALT水平，以及p62、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平，升高血清HDL-C含量，以及LC3B、Beclin1、p-AMPK/AMPK蛋白表达水平；组织染色结果和透射电镜观察均表明肝脏的病理状态得到了改善。综上所述，黑茶水提物可能通过激活AMPK/mTOR信号通路调控自噬，减轻小鼠肝脏脂肪变性，从而改善NAFLD。

关键词：非酒精性脂肪肝病；黑茶；AMPK/mTOR；自噬

中图分类号：S571.1；R972+.6               文献标识码：A              文章编号：1000-369X（2024）02-329-12

Mechanism of Dark Tea Water Extract in Regulating Autophagy in Non-Alcoholic Fatty Liver via the AMPK/mTOR Signaling Pathway

LI Linli1， XIA Xuting1， SHI Min1， GE Jun1， MAO Caiwei1， YU Changhong2*， LIU Fulin1*

1. Hunan University of Traditional Chinese Medicine， Changsha 410208， China;

2. The First Chinese Medicine Hospital of Changde， Changde 415000， China

Abstract： This study aimed to investigate the intricate mechanisms underlying the modulatory effects of Anhua dark tea on autophagy to ameliorate steatosis induced by a high-fat and high-sucrose diet （HFHS） in mice with non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD）. Male C57BL/6J mice were divided into different groups， including a normal group， a model group， a Western medicine group （10 mg·kg-1）， and various doses of dark tea groups （0.75， 1.5， 3.0 g·kg-1）. The therapeutic regimen was administered concurrently with the modeling process for a duration of 10 weeks using the HFHS-induced NAFLD model. At the end of the experiment， liver indices， blood lipids， liver function， liver pathology indicators， autophagy markers， and expression levels of key genes in the autophagy-related signaling pathway were assessed. Comparative analyses with the normal group revealed significant increases in liver index and levels of serum cholesterol （CHO）， triglycerides （TG）， low-density lipoprotein cholesterol （LDL-C）， aspartate aminotransferase （AST）， and alanine aminotransferase （ALT）， as well as a substantial reduction in high-density lipoprotein cholesterol （HDL-C） levels in the model group. The liver of the mice exhibits signs of  steatosis， characterized by an abundance of lipid droplets of different sizes. Protein expression analysis reveals a marked decrease in the levels of microtubule-associated protein light-chain-3B （LC3B）， Bcl-2-interacting coiled-coil protein 1 （Beclin1）， and phosphorylated adenosine monophosphate-activated protein kinase/adenosine monophosphate-activated protein kinase （p-AMPK/AMPK）. Conversely， there was a significant increase in the levels of sequestosome-1 （p62） and phosphorylated mammalian target of rapamycin/mammalian target of rapamycin （p-mTOR/mTOR）. Compared to the model group， gavage with dark tea decreased the liver index， serum levels of CHO， TG， LDL-C， AST， ALT， p62， and p-mTOR/mTOR in NAFLD mice， and increased serum HDL-C， along with LC3B， Beclin1， and p-AMPK/AMPK protein levels. The improvements were confirmed by tissue staining results and observations using transmission electron microscopy. In summary， our findings suggest that dark tea， by activating the AMPK/mTOR signaling pathway， may regulate autophagy， thereby alleviating hepatic steatosis and improving non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD）.

Keywords： nonalcoholic fatty liver disease， dark tea， AMPK/mTOR， autophagy

非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种以肝细胞内脂肪异常蓄积为主要特征的代谢性疾病，若不及时采取有效治疗，不仅容易引发肝脏相关疾病，还可能会导致心血管问题和慢性肾脏疾病等严重并发症[1-3]。NALFD与生活方式、遗传易感性、脂肪组织功能障碍、胰岛素抵抗、先天免疫调节异常，以及肠道微生物群紊乱等相关[4-6]，但具体发作的机制尚不明确。自噬是一种由溶酶体介导的细胞分解代谢过程，对维持肝脏的细胞和代谢稳态至关重要，因此调节自噬可能成为治疗NAFLD和其他肝脏疾病的潜在策略[7]。腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）作为自噬启动因子，可通过激活自噬清除脂滴[8]，还可通过抑制脂肪酸合成和促进脂肪酸氧化调节脂质代谢。研究表明，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）是治疗NAFLD的潜在新靶点，在NAFLD的发生和发展中，mTOR通路由于过度活化导致自噬水平下降，使得脂质在肝脏内过度沉积，从而引发NAFLD[9-10]。因此，通过调节AMPK/mTOR信号通路，可以促进自噬降解脂质，提高能量利用效率，从而对抗NAFLD引起的代谢紊乱。

黑茶作为一种经过特殊发酵处理的天然饮品，富含生物活性成分。现代研究表明，茶叶具有良好的降脂作用。Zhou等[11]研究发现，茶叶中的表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）能够通过促进自噬体的形成、增加溶酶体酸化，以及刺激肝细胞和体内的自噬通量来提高肝自噬水平，减少肝脂肪变性。其作用机制可能是通过增加自噬的主要调节因子AMPK的磷酸化，刺激肝自噬，从而增加脂质清除率，减少内脏肥胖[12]。此外，EGCG还能通过ROS/MAPK通路减少细胞凋亡、增加自噬，缓解高脂饮食诱导的NAFLD[13]。然而，EGCG多存在于绿茶多酚中，黑茶中的含量较少。对于黑茶是否也能通过调节自噬机制改善高脂高糖（High-fat high-sucrose，HFHS）饮食诱发的NAFLD仍有待明晰。因此，本研究以AMPK/mTOR自噬通路为切入点，采用HFHS饲料喂养建立NAFLD小鼠模型，旨在探讨黑茶对NAFLD小鼠的防治作用，为促进黑茶功效应用提供理论依据和试验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6～8周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠60只，體质量为（20±2） g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物质量合格证：430727231100273457。实验通过了湖南中医药大学伦理委员会审查，动物伦理批准号为LLBH-202210240005，实验单位使用许可证号为SYXK（湘）2019-0009。

1.2 材料与试剂

供试茶叶为2015年天茯茶（湖南省白沙溪茶厂股份有限公司，规格为1 kg，生产许可证编号为SC11443092300115，原料为天尖茶一级嫩叶），茶砖砖面平整，色泽黑褐，金花茂盛。取适量茶叶在蒸馏水中浸泡30 min，大火煮开后改小火煮一段时间，冷却后过滤，收集滤液，将滤渣加入蒸馏水再次煮沸过滤，合并两次滤液，小火浓缩至所需体积后离心，取上清液浓缩为0.3 g·mL-1的茶液，用纱布过滤后存放于离心管中低温保存，整个过程保持无菌操作。

阿托伐他汀药片购自福建东瑞制药有限公司；谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、总胆固醇（Cholesterol，CHO）、高密度脂蛋白胆固醇（High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）测定试剂盒购自深圳雷杜生命科学股份有限公司；微管相关蛋白1轻链3B（Microtubule-associated-protein light-chain-3B，LC3B）抗体购自英国Abcam公司；磷酸化AMPK（Phosphorylated-AMPK，p-AMPK）抗体购自美国Affinity Biosciences公司；隔离体蛋白1（Sequestosome-1，p62）、Bcl-2相互作用蛋白1（Bcl-2 interacting coiled-coil protein-1，Beclin1）、磷酸化mTOR（Phosphorylated-mTOR，p-mTOR）、AMPK、mTOR抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；油红O染色液购自武汉赛维尔生物科技有限公司；HE染色液购自珠海贝索生物技术有限公司；无蛋白快速封闭液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、羊抗兔/羊抗鼠二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司。高脂高糖饲料（基础饲料+10%猪油+20%蔗糖+2.5%胆固醇+0.5%胆酸钠）购自北京科澳协力饲料有限公司。

1.3 主要仪器

全自动生化分析仪，迈瑞医疗国际有限公司；透射电子显微镜，日本HITACHI公司；钻石切片机，湖南远湘生物科技有限公司；金属浴锅，杭州米欧仪器有限公司；恒温箱，日本三洋电机公司；高速冷冻离心机，大龙兴创实验仪器（北京）股份公司；电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司；超纯水仪，美国ICON公司。

1.4 动物分组、造模与预防性给药

经过1周的适应性饲养，60只C57BL/6雄性小鼠随机分配为正常组（普通饲料饲养）、模型组（HFHS）、西药组（HFHS+阿托伐他汀），以及黑茶低、中、高剂量组（HFHS+黑茶浓缩液），每组10只。成功建立NAFLD模型的标准是观察实验小鼠肝脏组织中的多项病理学特征，包括大小不一的脂滴、气球样变、细胞肿胀及炎症细胞浸润[14]。根据标准体重动物换算系数法计算剂量[15]，西药组剂量为10 mg·kg-1·d-1，黑茶低、中、高剂量分别为0.75、1.5、3.0 g·kg-1·d-1。黑茶剂量分别相当于人体推荐剂量的50%、1倍和2倍。为了确保试验结果准确，本研究采用灌胃方式，正常组和模型组则分别灌胃等体积的蒸馏水。每日灌胃体积为10 mL·kg-1，且根据定期测量的体重进行调整，连续灌胃10周。

1.5 标本收集与处理

处理结束后，采用氯胺酮（80 mg·kg-1）联和赛拉嗪（5 mg·kg-1）腹腔注射麻醉小鼠、取血、离心后置于﹣80 ℃保存，用于肝功能、血脂等检测；再将小鼠脱颈处死，迅速取下肝脏称重、漂洗，将一部分肝脏小叶置于4%多聚甲醛中固定，用于HE染色、油红O染色和免疫组织化学染色（Immunohistochemical staining，IHC）检测；用刀片切取1 mm×2 mm

×3 mm薄片状肝组织放于电镜液中室温避光固定2 h后，置于4 ℃冰箱保存，用于电镜检测；其余肝组织放于冻存管中干冰冷冻后存于﹣80 ℃冰箱以备蛋白免疫印迹检测。

由于课题经费有限，在进行各项指标检测时，为确保试验结果的科学性，根据体重参数对每组小鼠进行分层，以保持各组间的同质性；使用Excel软件生成的随机数序列将小鼠分配到不同的试验检测中；为尽量减少偏差，不同研究人员执行随机化与数据检测分析。

1.6 肝指数和血清生化检测

精确称量小鼠及其肝脏的湿质量，计算肝指数（肝指数=肝湿质量/体质量×100%）。

血清生化检测：将小鼠血液4 ℃静置2 h，12 000 r·m-1离心15 min，取上层血清，用于测量转氨酶及血脂各项指标。根据各试剂盒说明书检测血清CHO、TG、HDL-C、LDL-C、AST和ALT的含量。

1.7 组织病理分析肝脏脂质蓄积

HE染色：将保存于4%多聚甲醛中的肝脏组织取出，进行脱水、包埋、切片、染色、封片，观察结果。

油红O染色：将肝脏组织于4%多聚甲醛中固定24 h后，配制油红O工作液，将肝组织于冷冻切片机上切成8 μm左右的薄片后进行染色、分化、洗涤、封片，观察结果。

1.8 IHC观测自噬指标

将预制好的石蜡切片脱蜡、灭活、抗原修复、封闭、孵育一抗（LC3B、Beclin1、p62抗体），4 ℃过夜，二抗孵育，二氨基联苯胺显色，显微镜下观察显色情况。组织上出现棕黄色即为阳性。

1.9 透射电镜（TEM）观察肝脏自噬体和自噬溶酶体

肝脏组织先用电镜固定液4 ℃固定，再用OsO4·PB室温固定、漂洗、脱水、渗透、包埋、切片、染色、TEM成像分析。

1.10 蛋白免疫印迹法（Western blot）檢测

取﹣80 ℃保存的肝脏组织，每组随机选4只，分别用眼科剪取0.1 g组织用PBS洗涤3次后研磨、裂解、离心、金属浴、测定蛋白浓度；将提取的蛋白在5%与12% SDS-PAGE凝胶上分离，并电转移至PVDF膜，快速封闭液封闭，4 ℃孵育一抗过夜，37 ℃孵育对应二抗，再使用ECL化学发光试剂进行显影；用同一张膜上Beta-actin灰度值将不同蛋白表达水平标准化，Image J软件灰度值分析。试验重复4次。

1.11 统计学处理

应用软件GraphPad prism 9.0软件进行数据统计分析，通过单因素方差分析（One-way ANOVA），数据以平均数±标准差（ ±SD）表示，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 小鼠指数变化

与正常组相比，模型组小鼠肝指数显著增加（P<0.05）；与模型组相比，西药组、黑茶低、中、高剂量组小鼠肝指数均显著降低（P<0.05），其中高剂量组降低最多（图1A）。

2.2 小鼠血液中转氨酶和脂质水平变化

由图1可知，与正常组相比，模型组小鼠血清中肝功能（ALT、AST）和血脂（CHO、TG、LDL-C）含量显著升高（P<0.01），HDL-C含量显著降低（P<0.01）；与模型组相比，各用药组ALT、AST、CHO、TG、LDL-C均显著降低（P<0.05），其中高剂量组降低最为显著（P<0.01）；西药组ALT、AST、TG、CHO、LDL-C水平均高于高剂量组；各用药组HDL-C含量较模型组均显著升高（P<0.01），其中高剂量组HDL-C水平最高。

2.3 小鼠肝脏的病理学改变

HE染色结果显示（图2），在正常组的小鼠肝脏组织中，镜下结构呈正常状态，肝细胞大小均匀，形态结构清晰。而在模型组小鼠肝脏中，肝细胞结构混乱，存在大量大小不一

的脂肪空泡，肝索排列无序，肝血窦狭窄或完全消失。然而，在高剂量处理的小鼠肝脏中，脂肪空泡显著减少，细胞排列更加有序，形态结构更加清晰。

2.4 小鼠肝脏中脂质沉积水平变化

油红O染色显示（图3），正常组小鼠肝脏中未见明显红色的脂滴，可见清晰的蓝色细胞核；而模型组小鼠肝脏可见大量的红色脂滴，细胞核不明显。黑茶干预后脂滴数减少，其中黑茶高剂量组较模型组相比，红色脂滴明显减少，细胞核较为清晰。

2.5 小鼠肝脏LC3B、p62、Beclin1蛋白表达情况

由图4可知，正常组小鼠肝组织p62、LC3B、Beclin1表达较低；与正常组相比，模型组小鼠肝组织LC3B、Beclin1无明显阳性表达，p62表达显著增加（P＜0.05）；与模型组

相比，各用药组小鼠肝组织LC3B、Beclin1表达增加，p62表达显著降低（P＜0.05），其中高剂量组小鼠改变最为明显（P＜0.01）。

2.6 小鼠自噬体和自噬溶酶体的变化

正常组小鼠肝细胞组织结构完好，胞内脂滴数量较少，可见自噬泡、自噬小体、自噬溶酶体；模型组胞质稀疏、肿胀，周围的自噬空泡数量显著减少，脂滴数量明显增多，并出现脂滴融合；各用药组较模型组呈现自噬空泡增多，脂滴数量减少等不同程度的好转，并可见少量自噬小体和自噬溶酶体（图5）。

2.7 小鼠肝脏自噬水平的变化

Western blot结果显示（图6），与正常组小鼠相比，模型组小鼠肝脏组织中LC3B和Beclin1等自噬相关蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），p62表达水平显著升高（P<0.01）。各用药组与模型组相比较LC3B和Beclin1蛋白表达水平明显升高（P<0.01），p62表达水平明显降低（P＜0.05），其中黑茶高剂量组降低最为明显（P<0.01）。

2.8 小鼠肝脏AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR水平的变化

Western blot结果显示（图7），与正常组小鼠相比，模型组小鼠肝脏中p-AMPK蛋白表达水平降低（P<0.05），p-mTOR蛋白表达水平升高（P<0.05）。各用药组与模型组相比p-AMPK蛋白表达水平增加，p-mTOR蛋白表达水平降低，其中高剂量组变化最为明显（P<0.01）。

3 讨论

NAFLD是全球最常见的肝脏疾病之一，近十亿人受其影响，且患病率持续上升[16]。迄今为止，尚无获得美国食品和药物管理局（FDA）批准的有效药物或治疗方法用于NAFLD[17]。一些常见的替代药物包括维生素E、利拉鲁肽、吡格列酮和己酮可可碱等目前被用于NAFLD治疗。然而，这些化学药物具有潜在的毒副作用，患者长期使用会导致严重的毒性，甚至可能加重病情[18]。因此，从天然产品中寻找高效、低毒的缓解NAFLD的有效候选药物已迫在眉睫。

黑茶作为中国传统茶类之一，加工工艺复杂。在加工过程中，通过微生物的发酵作用，茶叶中的儿茶素及其没食子酸酯衍生物被氧化成复杂的酚类茶色素，包括茶黄素（TF）、茶红素（TR）和茶褐素（TB）[19]。其中，TB是黑茶的特征成分，具有调节脂质代谢、减缓体重增加、减轻糖尿病、减轻NAFLD和预防肿瘤等多种健康促进作用[20]。Huang等[21]研究发现，TB可以增加回肠结合胆汁酸的水平，进而抑制肠道FXR-FGF1信号通路，加速肝脏胆固醇的排泄，并减少脂肪生成；亦或通过抑制胰脂肪酶和胆固醇酯酶的活性降低脂质水平，同时抑制肠道脂质消化和吸收[22]。研究发现，从各类黑茶中提取的TB可降低高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠的体重增加，使脂质紊乱正常化，并改善葡萄糖耐量和胰岛素敏感性[23-24]。此外，黑茶中的优势菌冠突散囊菌可以增加小鼠肠道中产生乙酸和丁酸的细菌总量，从而缓解肥胖[25]。黑茶黄烷醇、黄酮酰基苷及其衍生物也可以起到预防高脂血症的作用[19]。

研究发现，黑茶中TB和多糖含量高于其他五大茶类，在HFD诱导的NAFLD小鼠中，TB和多糖组合在降低肝脂质水平和减轻NAFLD表型方面比单独使用TB或多糖显示出更强的作用，表明它们对减轻NAFLD具有协同作用[26]。因此，针对黑茶在防治NAFLD方面发挥的作用，黑茶TB和多糖的复合作用可能优于各自单独的效果。张文将等[27-28]研究发现，黑茶可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-kB通路，同时抑制肝脂合成和减少肝脏氧化应激损伤，实现逆转早期NAFLD的效果。此外，黑茶还通过抑制HMGCR、SCD-1和PPAR-γ的mRNA表达来减少脂类物质合成，并通过抗氧化作用减少氧化损伤和保护肝细胞，从而达到防治NAFLD的效果[29]。与上述结果相似，本研究结果表明，黑茶的应用能有效恢复NAFLD小鼠的血脂调节能力，降低小鼠肝脏脂肪组织质量增加量，改善肝索紊乱和肝细胞肿胀等病理变化，并通过调节AST和ALT水平来改善肝脏损伤。但是，目前黑茶对NAFLD预防作用的研究主要集中在抗炎、抗氧化、改善肠道菌群进而抑制肝脂合成等方面，缺乏对自噬相关机制的探讨与分析。

自噬是一种通过溶酶体介导，吞噬并降解细胞内受损的或衰老的细胞器的再循环过程，是细胞加速新陈代谢的重要手段，在真核细胞中普遍存在，在维持肝脏代谢稳态中具有至关重要的作用，自噬流的恢复可以延缓NAFLD进展[30-32]。研究表明，激活自噬可以降低HFD小鼠肝脏中脂质的变性和炎症程度；相反，如果自噬受到抑制，将导致肝细胞内脂质的积累增加[33-34]。因此，通过激活细胞内的自噬机制，对于缓解和预防肝脏脂质变性具有重要的生物学作用。

AMPK/mTOR信号通路是自噬的关键调控途径。在这个信号通路中，AMPK充当细胞能量传感器和肝脏脂质代谢的重要调控因子，通过抑制脂肪酸合成和促进脂肪酸氧化来调节脂质代谢[35]。此外，AMPK的活化还能减少在肝脏中导致脂质沉积和甘油三酯积累的酶活性，从而减轻NAFLD的病情[35]。AMPK是与肝脏中的正性脂质调节相关的主要能量代謝开关，同时也是NAFLD的治疗靶标，在自噬调控中起到正调节作用[36-37]。另一方面，mTOR是调节细胞生长、存活、代谢和免疫的蛋白激酶，主要以mTORC1和mTORC2的2种复合物形式存在[10]。其中，mTORC1在脂质代谢过程中发挥重要作用，它介导的信号通路有助于肝脏脂肪生成，同时抑制脂肪吞噬，因此在自噬调控中起到负调节作用[38]。故而，研究AMPK/mTOR信号通路对自噬的调节机制对深入了解代谢性疾病具有重要意义。在自噬过程中，LC3B-Ⅰ转化为LC3B-Ⅱ标志着自噬体的形成[39]；同时，p62作为自噬的降解底物，在自噬障碍时会在细胞质中积累，因此其表达水平与自噬活性呈负相关[40]。此外，Beclin1作为自噬启动的核心蛋白，在自噬体形成初始阶段起到了重要作用，增加Beclin1表达水平的化合物有望增加细胞自噬，故其表达水平与自噬活性呈正相关[41-42]。本研究发现，模型组小鼠的肝脏中LC3B、Beclin1和p-AMPK蛋白的表达水平相较于正常组显著下降，而p62和p-mTOR蛋白的表达水平显著上升，自噬泡明显减少，这表明模型组小鼠的自噬水平受到抑制。与模型组相比，黑茶干预能够上调LC3B、Beclin1和p-AMPK蛋白的表达水平，同时下调p62和p-mTOR蛋白的表达水平，这表明黑茶可能通过调节AMPK/mTOR信号通路在体内诱导自噬，从而减轻肝脏脂肪变性。

綜上所述，黑茶可能通过调节AMPK/mTOR途径，促进自噬标志物LC3B和Beclin1蛋白的表达，抑制p62蛋白的表达，增强NAFLD模型小鼠肝脏的自噬水平，减轻肝脏损伤，改善脂肪变性，从而起到保护肝脏的作用。

此外，本研究仍存在一些局限性和不足之处。例如，关于自噬再激活与肝脂质变性减少之间的关联，数据支持尚不充分；未使用AMPK和mTOR的特异性抑制剂进行干预；未能排除黑茶在炎症细胞等其他非肝细胞中的直接作用等。今后将继续开展深入研究，探究黑茶治疗NAFLD的有效性及其作用机理。

参考文献

[1] Chalasani N， Younossi Z， Lavine J E， et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease： practice guidance from the American Association for the study of liver diseases [J]. Hepatology， 2018， 67（1）： 328-357.

[2] Liu H Y， Niu Q H， Wang T， et al. Lipotoxic hepatocytes promote nonalcoholic fatty liver disease progression by delivering microRNA-9-5p and activating macrophages [J]. International Journal of Biological Sciences， 2021， 17（14）： 3745-3759.

[3] 樊亚东， 贾建伟， 张晓雨， 等. 非酒精性脂肪性肝病发病机制和临床治疗研究进展[J]. 中西医结合肝病杂志， 2020， 30（1）： 93-96.

Fan Y D， Jia J W， Zhang X Y， et al. Advances in the pathogenesis and clinical treatment of non-alcoholic fatty liver disease [J]. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine on Liver Diseases， 2020， 30（1）： 93-96.

[4] Tilg H， Moschen A R. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease： the multiple parallel hits hypothesis [J]. Hepatology， 2010， 52（5）： 1836-1846.

[5] Haas J T， Francque S， Staels B. Pathophysiology and mechanisms of nonalcoholic fatty liver disease [J]. Annual Review of Physiology， 2016， 78： 181-205.

[6] Takaki A， Kawai D， Yamamoto K. Multiple hits， including oxidative stress， as pathogenesis and treatment target in non-alcoholic steatohepatitis （NASH） [J]. International Journal of Molecular Sciences， 2013， 14（10）： 20704-20728.

[7] Qian H， Chao X J， Williams J， et al. Autophagy in liver diseases： a review [J]. Molecular Aspects of Medicine， 2021， 82： 100973. doi： 10.1016/j.mam.2021.100973.

[8] Chen C L， Lin Y C. Autophagy dysregulation in metabolic associated fatty liver disease： a new therapeutic target [J]. International Journal of Molecular Sciences， 2022， 23（17）： 10055. doi： 10.3390/ijms231710055.

[9] Feng J Y， Qiu S T， Zhou S P， et al. mTOR： a potential new target in nonalcoholic fatty liver disease [J]. International Journal of Molecular Sciences， 2022， 23（16）： 9196. doi： 10.3390/ijms23169196.

[10] Marcondes-de-Castro I A， Reis-Barbosa P H， Marinho T S， et al. AMPK/mTOR pathway significance in healthy liver and non-alcoholic fatty liver disease and its progression [J]. Journal of Gastroenterol and Hepatol， 2023， 38（11）： 1868-1876.

[11] Zhou J， Farah B L， Sinha R A， et al. Epigallocatechin-3-gallate （EGCG）， a green tea polyphenol， stimulates hepatic autophagy and lipid clearance [J]. Plos One， 2014， 9（1）： e87161. doi： 10.1371/journal.pone.0087161.

[12] Choi C， Song H D， Son Y， et al. Epigallocatechin-3-gallate reduces visceral adiposity partly through the regulation of Beclin1-dependent autophagy in white adipose tissues [J]. Nutrients， 2020， 12（10）： 3072. doi： 10.3390/nu12103072.

[13] Wu D D， Liu Z G， Wang Y Z， et al. Epigallocatechin-3-gallate alleviates high-fat diet-induced nonalcoholic fatty liver disease via inhibition of apoptosis and promotion of autophagy through the ROS/MAPK signaling pathway [J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity， 2021， 2021： 5599997. doi： 10.1155/2021/5599997.

[14] 趙维良， 王治霞， 喇登海， 等. 血管生成抑制剂ZM 306416对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病小鼠的保护作用[J]. 中国肝脏病杂志（电子版）， 2023， 15（2）： 36-46.

Zhao W L， Wang Z X， La D H， et al. Protective effects of angiogenesis inhibitor ZM 306416 on non-alcoholicfatty liver disease induced by high-fat diet in mice[J]. Chinese Journal of Liver Diseases （ElectronicVersion）， 2023， 15（2）： 36-46.

[15] 赵伟， 孙国志. 不同种实验动物间用药量换算[J]. 畜牧兽医科技信息， 2010（5）： 52-53.

Zhao W， Sun G Z. Conversion of medication dosage among different experimental animals [J]. Animal Husbandry and Veterinary Science and Technology Information， 2010（5）： 52-53.

[16] Zeigerer A. NAFLD： a rising metabolic disease [J]. Molecular Metabolism， 2021， 50： 101274. doi： 10.1016/j.molmet.2021.101274.

[17] Suk F M， Hsu F Y， Hsu M H， et al. Treatment with a new barbituric acid derivative suppresses diet-induced metabolic dysfunction and non-alcoholic fatty liver disease in mice [J]. Life Sciences， 2024， 336： 122327. doi： 10.1016/j.lfs.2023.122327.

[18] Trevi?o L S， Katz T A. Endocrine disruptors and developmental origins of nonalcoholic fatty liver disease [J]. Endocrinology， 2018， 159（1）： 20-31. doi： 10.1210/en.2017-

00887.

[19] Chen G， Peng Y， Xie M， et al. A critical review of Fuzhuan brick tea： processing， chemical constituents， health benefits and potential risk [J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2023， 63（22）： 5447-5464.

[20] Cheng L Z， Wei Y， Peng L L， et al. State-of-the-art review of theabrownins： from preparation， structural characterization to health-promoting benefits [J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2023： 1-20. doi： 10.1080/10408398.2023.2236701.

[21] Huang F J， Zheng X J， Ma X H， et al. Theabrownin from Pu-erh tea attenuates hypercholesterolemia via modulation of gut microbiota and bile acid metabolism [J]. Nature Communications， 2019， 10（1）： 4971. doi： 10.1038/s41467-019-12896-x.

[22] Xiao Y， Huang Y N， Long F W， et al. Insight into structural characteristics of theabrownin from Pingwu Fuzhuan brick tea and its hypolipidemic activity based on the in vivo zebrafish and in vitro lipid digestion and absorption models [J]. Food Chemistry， 2023， 404： 134382. doi： 10.1016/j.foodchem.2022.134382.

[23] Wang Y， Zhao A Q， Du H P， et al. Theabrownin from Fu brick tea exhibits the thermogenic function of adipocytes in high-fat-diet-induced obesity [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2021， 69（40）： 11900-11911.

[24] Deng X J， Zhang N， Wang Q， et al. Theabrownin of raw and ripened pu-erh tea varies in the alleviation of HFD-induced obesity via the regulation of gut microbiota [J]. European Journal of Nutrition， 2023， 62（5）： 2177-2194.

[25] Lin F J， Wei X L， Liu H Y， et al. State-of-the-art review of dark tea： from chemistry to health benefits [J]. Trends in Food Science & Technology， 2021， 109： 126-138. doi： 10.1016/j.tifs.2021.01.030.

[26] Wang J Y， Zheng D， Huang F J， et al. Theabrownin and Poria cocos polysaccharide improve lipid metabolism via modulation of bile acid and fatty acid metabolism [J]. Frontiers in Pharmacology， 2022， 13： 875549. doi： 10.3389/fphar.2022.875549.

[27] 張文将， 段丽芳， 孟涛， 等. 基于TLR4/MyD88/NF-κB通路探讨茯砖茶改善ApoE-/-小鼠非酒精性脂肪肝的作用[J]. 中成药， 2023， 45（10）： 3429-3432.

Zhang W J， Duan L F， Meng T， et al. Exploring the effect of Fuzhuan tea on improving non-alcoholic fatty liver disease in ApoE-/- mice based on TLR4/MyD88/NF-κB pathway [J]. Chinese Traditional Patent Medicine， 2023， 45（10）： 3429-3432.

[28] 张文将， 刘圆月， 范文涛， 等. 茯砖茶对APOE-/-小鼠肝脂合成和氧化应激影响[J]. 食品与生物技术学报， 2021， 40（3）： 103-111.

Zhang W J， Liu Y Y， Fan W T， et al. Effect of fu brick tea on hepatic lipid synthesis and oxidative stress in APOE-/- mice with non-alcoholic fatty liver [J]. Journal of Food and Biotechnology， 2021， 40（3）： 103-111.

[29] 张文将， 刘圆月， 易健， 等. 安化黑茶减轻高脂诱导的ApoE-/-小鼠非酒精性脂肪肝[J]. 中国病理生理杂志， 2020， 36（7）： 1274-1280.

Zhang W J， Liu Y Y， Yi J， et al. Effects of Anhua dark tea on ApoE-/- mice with non-alcoholic fatty liver induced by high-fat diet [J]. Chinese Journal of Pathophysiology， 2020， 36（7）： 1274-1280.

[30] Frietze K K， Brown A M， Das D， et al. Lipotoxicity reduces DDX58/Rig-1 expression and activity leading to impaired autophagy and cell death [J]. Autophagy， 2022， 18（1）： 142-160.

[31] Moore M P， Cunningham R P， Meers G M， et al. Compromised hepatic mitochondrial fatty acid oxidation and reduced markers of mitochondrial turnover in human NAFLD [J]. Hepatology， 2022， 76（5）： 1452-1465.

[32] Park H S， Song J W， Park J H， et al. TXNIP/VDUP1 attenuates steatohepatitis via autophagy and fatty acid oxidation [J]. Autophagy， 2021， 17（9）： 2549-2564.

[33] Chen R， Wang Q X， Song S H， et al. Protective role of autophagy in methionine-choline deficient diet-induced advanced nonalcoholic steatohepatitis in mice [J]. European Journal of Pharmacology， 2016， 770： 126-133. doi： 10.1016/j.ejphar.2015.11.012.

[34] Lin C W， Zhang H， Li M， et al. Pharmacological promotion of autophagy alleviates steatosis and injury in alcoholic and non-alcoholic fatty liver conditions in mice [J]. Journal of Hepatology， 2013， 58（5）： 993-999.

[35] Naito Y， Ushiroda C， Mizushima K， et al. Epigallocatechin-3-gallate （EGCG） attenuates non-alcoholic fatty liver disease via modulating the interaction between gut microbiota and bile acids [J]. Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition， 2020， 67（1）： 2-9.

[36] Chyau C C， Wang H F， Zhang W J， et al. Antrodan alleviates high-fat and high-fructose diet-induced fatty liver disease in C57BL/6 mice model via AMPK/Sirt1/SREBP-1c/PPARγ pathway [J]. International Journal of Molecular Sciences， 2020， 21（1）： 360. doi： 10.3390/ijms21010360.

[37] Qin G H， Ma J， Huang Q S， et al. Isoquercetin Improves Hepatic Lipid Accumulation by Activating AMPK pathway and suppressing TGF-β signaling on an HFD-induced nonalcoholic fatty liver disease rat model [J]. International Journal of Molecular Sciences， 2018， 19（12）： 4126. doi： 10.3390/ijms19124126.

[38] Li T， Weng J， Zhang Y， et al. mTOR direct crosstalk with STAT5 promotes de novo lipid synthesis and induces hepatocellular carcinoma [J]. Cell Death and Disease， 2019， 10（8）： 619. doi： 10.1038/s41419-019-1828-2.

[39] Vuji? N， Bradi? I， Goeritzer M， et al. ATG7 is dispensable for LC3-PE conjugation in thioglycolate-elicited mouse peritoneal macrophages [J]. Autophagy， 2021， 17（11）： 3402-3407.

[40] Klionsky D J， Abdelmohsen K， Abe A， et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy （3rd edition） [J]. Autophagy， 2016， 12（1）： 1-222. doi： 10.1080/15548627.2015.1100356.

[41] Levine B， Liu R， Dong X， et al. Beclin orthologs： integrative hubs of cell signaling， membranetrafficking，and physiology [J]. Trends in Cell Biology， 2015， 25（9）： 533-544.

[42] Fernández ? F， Sebti S， Wei Y， et al. Disruption of the beclin 1-BCL2 autophagy regulatory complex promotes longevity in mice [J]. Nature， 2018， 558（7708）： 136-140.