内质网应激在肾脏缺血再灌注和环孢素A损伤中的作用及研究进展

王倩++张玉芳++杨斌

摘要：肾脏缺血再灌注损伤为急性肾损伤最常见的病因之一，亦为肾移植手术中难以规避的损伤，其不仅延迟移植肾功能的恢复，而且会导致急、慢性免疫排斥反应和肾功能异常。环孢素A仍是肾移植术后预防免疫排斥反应的主要药物，长期使用会造成肾损害。内质网作为真核细胞生物中保持内环境稳定的重要细胞器，其稳态系统易受到许多因素如缺氧、氧化应激和药物刺激的影响而失衡，形成内质网应激。本文拟对内质网应激在肾脏缺血再灌注和环孢霉素A损伤中的作用及研究进展做一综述。

关键词：内质网应激；肾缺血再灌注；环孢素A；自噬；凋亡

1绪论

在真核细胞中，未折叠蛋白以及错误折叠蛋白的积聚引起内质网（endoplasmic reticulum，ER）一系列功能的紊乱，称为内质网应激（ER stress，ERS）[1]。ERS与多种疾病相关，如糖尿病、动脉粥样硬化及缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）等。由ERS诱导的细胞凋亡已被研究证实是IRI的重要发病机制[2]。肾脏IRI作为急性肾损伤的常见原因之一，可导致移植肾功能排异、炎症，最终引起慢性肾功能不全[3]。各种肾脏疾病可诱发ERS，包括肾小球肾炎、糖尿病肾病、IRI及环孢素A（Cyclosporine A，CsA）治疗引发的肾损伤。CsA作为钙调神经磷酸酶抑制剂之一，临床广泛应用于肾移植术后提高肾移植患者的存活率。然而CsA对肾脏、肝脏、以及神经系统均有潜在毒性，长期大剂量使用会加重肾损伤。因此，为寻找更安全有效的肾病治疗手段，越来越多的学者开始关注该类肾脏损伤机制的研究。已有研究发现多种细胞器的应激包括ERS、线粒体应激等与肾脏IR和CsA肾损伤密切相关，因此，深入研究细胞器的应激反应将有助于更详细地了解肾脏损伤的机制，为治疗疾病提供新的靶点和策略。

2 ERS

缺血缺氧、氧化应激、钙超载等因素均为ERS发生的重要环境刺激。机体针对这一应激反应所做出的适应性应答为未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），减轻蛋白错误折叠所带来的不良影响[1]。 细胞通过减少蛋白质合成，增加帮助蛋白质折叠的分子伴侣等方式缓解内质网压力，因而适度ERS是维持内质网稳态的一种保护机制[4]。当ERS强度过大，超过细胞自身的调节能力，进而激活凋亡信号快速去除受损细胞器，引起细胞凋亡[5]。

2.1 ERS的生存途径 RNA依赖的蛋白激酶样激酶（PKR like ER kinase， PERK）、肌醇需要性激酶（inositol requiring enzyme l，IRE1）和活化转录因子6（activating transcription factor 6， ATF6）这3种跨膜蛋白是ER腔内蛋白聚集的感受器。生理情况下跨膜蛋白分别与糖调节蛋白（glucose regulated protein78，GRP78）等伴侣分子结合而处于无活性状态，当ER腔内出现大量未折叠或错误折叠蛋白时，伴侣分子与跨膜蛋白解离，活化的PERK、IRE1及ATF6进一步触发UPR。PERK与GRP78解离后，活化的PERK使其mRNA的翻译受到抑制，并磷酸化下游真核起始转录因子2α（Eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）进而失活，从而衰减蛋白质的翻译过程[6]。IRE1解离后活能从X盒结合蛋白1（XBP-1）mRNA中特异性剪切核苷酸，编码转录因子XBP-1，进而与特异性UPR元件结合，诱导内质网的转录程序。ATF6在从内质网转移至高尔基体的过程中被跨膜蛋白酶所裂解，释放出活性ATF6并结合于内质网应激元件，激活ER分子伴侣基因的转录，见图1。

图1 ERS生存途径

2.2 ERS的自噬途径 自噬是由应激刺激（营养缺乏、ERS、氧化应激以及病毒感染等）而产生，通过溶酶体降解细胞自身的组成，在细胞生长发育、内环境稳态中发挥调节作用并维持合成与降解之间的平衡。在肾脏中自噬能降解错误蛋白的折叠，有利于急性肾损伤的恢复[7]。 Chandrika在体外培养的肾小管上皮细胞模型中发现，ERS诱导的自噬对细胞具有促存活作用。与野生型细胞相比，自噬缺陷的细胞在受到ERS刺激时会增强caspase-3的活化和细胞死亡，进一步支持了ERS诱导的自噬对细胞具有保护作用。同样在小鼠IR模型中， ERS诱导的自噬能明显改善肾脏IRI以及肾功能。在应激条件下，自噬通常被认为是促进细胞存活的适应性存在。然而过度ERS诱发的自噬反应可以导致细胞死亡[8]，进而加重肾脏IRI。

2.3 ERS的凋亡途径 作为ERS的重要信号分子，跨膜蛋白并没有直接参与，而是通过激活相应的下游的信号分子来完成凋亡程序。PERK激活下游的eIF2α和活化转录因子4（Activating transcription factor 4，ATF4），進而启动了C/EBP 同源蛋白（CHOP）的表达与转录，使得CHOP的表达量较生理情况下明显上调[9]。CHOP作为ERS凋亡的转录因子，在ERS反应中诱导细胞凋亡。被激活的IRE1招募接头分子，形成复合物后继续激活JNK。CHOP蛋白和JNK激酶均能下调Bcl-2的表达，诱导Bcl-2等发生构象变化，胞质内Ca2+浓度升高诱发凋亡。Caspase的特异性级联反应也是ER凋亡的重要途径之一，该通路中的凋亡信号是由位于ER外膜的caspase-12下传。在发生ERS时，钙依赖性蛋白酶将酶原形式的前体caspase-12直接剪切和激活，进而激活caspase-9，最终激活凋亡执行子caspase-3，见图2。

图2 ERS凋亡途径

3 ERS与肾脏IRI的相互作用

IR是组织器官在缺血所致损伤的基础上恢复血流灌注后组织损伤进一步加重，甚至发生不可逆性损伤的现象。IRI是导致急/慢性肾功能衰竭的一个重要原因，随着肾脏移植普遍应用于临床，IR作为移植中不可避免的过程，引起移植组织内的炎症反应引起以坏死性凋亡为主的细胞死亡。

3.1肾缺血再灌注诱导ERS反应 Intermedin（IMD）作为降钙素基因相关肽家族成员能下调GRP78、CHOP等ERSR中的重要调节分子，抑制ERSR改善肾脏IR损伤[10]。Lempiainen等研究发现，小鼠肾脏IRI模型可诱导ERS的发生，CHOP的表达增加[11]。CHOP敲除鼠的肾小管凋亡细胞数明显少于野生型小鼠，CHOP敲除鼠的肾脏形态和功能损伤程度明显轻于野生型小鼠。CHOP敲除鼠在前体Caspase 3裂解和Bax蛋白生成水平上均低于野生型小鼠。相反，Bcl-2的表达水平在CHOP敲除鼠均高于野生型小鼠[12]。这些结果表明，IR诱发ERS并激活CHOP相关细胞凋亡信号通路，如激活caspase-12、9、3的特异性级联反应[13]。

氧调节蛋白150（oxygen-regulated protein，ORPl50）作为可诱导ER分子伴侣的一种细胞保护剂，在急性肾衰病人的肾组织显著增高。ORP150 过表达转基因小鼠能够緩解肾IR导致的损伤，而ORP150表达下降的小鼠IRI更加严重[14]，由此显示ERS在肾脏IRI中起着关键的作用。

3.2过度ERS加重缺血再灌注损伤 Montie等发现细胞在应激情况下会通过eIF2α来抑制细胞的翻译过程。肾脏IR后在皮质以及髓质，特别是皮髓质交界区的小管上皮细胞中eIF2α的表达明显增加。eIF2α激活PERK产生UPR从而发生ERSR。UPR在IR的病理过程中具有重要作用，被激活而产生的UPR在一定程度上减轻了细胞损伤，然而随着IR的时间变长，ER中错误蛋白折叠率也相应上升。过度ERSR导致细胞内错误蛋白的累积和细胞凋亡，在IR基础上加重了组织损伤。IRI激活UPR，因此，在持续UPR的刺激下超过了细胞自身防御能力，启动细胞凋亡信号通路，使得肾IRI反而会加重[15]。

4 ERS与CsA肾损伤

CsA通过阻断T细胞活化成功发挥了抑制异体移植物免疫反应的作用，被广泛用于移植术后防止器官排斥反应的自体免疫治疗疾病。由于CsA会诱导肾小管细胞的凋亡，长期使用会导致一系列的副作用，在许多临床案例都有体现[16]。

4.1 CsA诱导ERS的产生 近来Ciechomska等[17]在环孢素诱导的人胶质瘤细胞中检测到p-PERK和IRE1α的表达证明了UPR的存在，同时也发现CHOP和ER分子伴侣BIP表达上调，从而推测CsA可以诱导ERS的产生。Liu等人[18]在慢性CsA肾病的大鼠模型中研究发现：由ERS引起的肾小管上皮细胞凋亡是CsA肾病的发病机制之一。Yong-Min Choi[19]等人在CsA诱导的HK-2（human embryonic kidney cell）细胞模型发现，CHOP mRNA的表达随时间推移而明显增加，证实了CsA的肾毒性作用诱发了ERSR。CsA长期治疗后CHOP的表达进一步升高，说明长期CsA治疗诱发ERS最终导致肾小管细胞凋亡。

4.2适度ERS抵抗CsA损伤 CsA长期低剂量使用诱导了机体产生UPR来作为一种防御机制，恢复ER中蛋白正确折叠，降低CsA诱发ERS的损伤[20]。以往的研究发现CsA诱导细胞自噬，在CsA的慢性治疗中会增加自噬体积累和减少自噬体清除。近期有研究发现在环孢素肾病中可通过诱导ERS发生自噬起到细胞的保护作用从而来减轻CsA的不良反应，其机制在于自噬能抑制ERS引起的细胞凋亡[21]。自噬作用也被认为是除凋亡与坏死外细胞死亡的第三种形式，而自噬作用与ERS的联系在肾脏疾病中的作用还有待进一步探讨。

5 ERS的检测、抑制及干扰

新的证据表明，ERS和扰乱ER蛋白平衡都将增加肾小球以及肾小管疾病的发生率[22]。若能早期检测到ERS的存在并对其进行干扰均会减少肾脏相关疾病的发病率。Yeawon Kim证明中脑星形胶质细胞源性神经营养因子（MANF）可以作为ERS的潜在尿生物标志物。早期发现和干预ERS进程和恢复ER平衡有利于ERS相关疾病治疗，其可行性高于逆转肾细胞损伤的治疗。这一发现将能通过尿中MANF寻找到具有较高的疾病进展风险的患者，有助于将肾脏相关疾病进行风险分层，预测疾病的进展，监测治疗反应。

近来RNA干扰（RNA interference ， RNAi）作为一种有效工具，能够以序列同源互补的mRNA为靶点，通过促使特定基因的mRNA降解，高效、特异地沉默体内特定基因的表达，诱发细胞呈现出特定基因缺失的表型[23]。ERS中跨膜蛋白、分子伴侣、凋亡转录因子等在ERS中起着极为关键的作用，若能将其与特定序列结合形成RNA沉默复合物，抑制其在ERS中表达，即可以达到缓解IR和CsA损伤的效果。

6结论

综上所述，任何细胞内外环境的改变如IR及CsA所致的肾损伤可诱导ERS的发生，越来越多的证据表明ERS在疾病的发生发展中起着非常重要的作用，包括肾小球和肾小管疾病。因此，随着ERS机制研究的深入，可为研究肾脏缺血再灌注和环孢素肾损伤的发病机制和预防策略提供新的思路。

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編辑/孙杰