赵鹏鹏,高腾琪,唐海峰,陈金玲,刘欢,董春涛,杨杰,司鑫鑫*
(1.江苏海洋大学江苏省海洋生物资源与环境重点实验室,江苏省海洋生物技术重点实验室,江苏连云港 222005;2.江苏海洋大学药学院,江苏连云港 222000)
紫菜(Porphyrɑ)属红藻纲,红毛菜科,含有丰富的蛋白质、碳水化合物、不饱和脂肪酸、维生素和矿物质,具有很高的营养价值[1-3]。条斑紫菜(Porphyrɑyezoensis)是紫菜的代表性物种之一,具有特殊的挥发性风味,具有药食两用的特点[4],是我国最重要的经济型藻类之一。目前我国主要的条斑紫菜产品包括夹心海苔、汤用紫菜等,深受广大消费者青睐。然而,夹心海苔加工的过程中产生的大量边角料,目前尚未得到有效利用并造成一定的资源浪费。因此,如何有效利用海苔加工过程中产生的边角料成为研究的热点。
乳酸菌在食品发酵行业应用非常广泛,植物乳杆菌(Lɑctiplɑntibɑcillusplɑntɑrum)和干酪乳杆菌(Lɑcticɑseibɑcilluscɑsei)是食品发酵中常见的重要发酵剂[5],王小慧[6]利用戊糖片球菌(Pedlococcusperctosɑceus,)、干酪乳杆菌(L.cɑsei)、鼠李糖乳杆菌(Lɑctobɑcillus rhɑmnosus)和植物乳杆菌(L.plɑntɑrum)对比发酵末水坛紫菜酶解液,以感官品质和pH 值为指标,通过测定成品中乳酸菌总数和可溶性固形物含量,确定了植物乳杆菌更适合用于末水坛紫菜酶解液的发酵。王雪宁等[7]研究了短乳杆菌(Lɑctobɑcillusbrevis)、植物乳杆菌(L.plɑntɑrum)和干酪乳杆菌(L.cɑsei)以体积比分别为1∶1∶1、1∶1∶2 和1∶1∶3 混合发酵条斑紫菜发酵液理化因子的变化规律,发现体积比为1∶1∶2 的混合发酵液发酵效果最好。此外,乳酸杆菌发酵可以提高食品的营养价值和品质,并且能够赋予食品独特的风味[8],Yang 等[9]采用发酵乳杆菌(Lɑctobɑcillusfermentum)、干酪乳杆菌(L.cɑsei)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)以及三者混合组株(体积比1∶1∶1)对条斑紫菜酱进行发酵,发现发酵21 d 后,所有乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)生长良好,蛋白酶活力得到提高,随后采用气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技术考察了干酪乳杆菌和发酵乳杆菌发酵的条斑紫菜酱中的香味化合物,分别鉴定出42 种和41 种挥发性风味物质,包括醛类、醇类、碳氢化合物、酸类、酮类、酯类、吡嗪类、呋喃类和苯二氮卓类等,确定了醇类和酯类物质主要在发酵中期产生,碳氢化合物在发酵后期产生,确定干酪乳杆菌发酵的条斑紫菜酱风味和口感更好。因此,利用乳酸菌发酵海苔边脚料,并对其发酵样品的挥发性物质进行研究,不仅可以更好地了解其风味组成及变化,在资源利用的同时还可以提高海苔边脚料的营养价值,进一步提高紫菜产业的经济效益。
目前针对乳酸菌发酵藻类产品的风味研究相对较少,赵玲等[10]采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用(headspace solid-phase microextraction gas-mass spectrometry,SPME-GC-MS)技术对比分析了条斑紫菜在烤制前后挥发性风味物质的组成变化,结果表明,醛类、醇类、酮类和烷烃类构成了条斑紫菜的主体风味,烤制后吡嗪、甲基吡嗪、2,5-二甲基-吡嗪、2-乙基-5-甲基-吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪和2-乙基-6-甲基-吡嗪等物质含量显著增加。姚兴存等[11]利用筛选的蛋白酶酶解紫菜制备紫菜风味香精,采用GC-MS 测定了产物中的挥发性风味成分,发现醇类和醛酮等羰基化合物所具有的独特风味对紫菜风味香精良好风味的形成起到重要作用。曹荣等[12]采用电子舌(electronic tongue,ET)结合气相色谱-离子迁移(gas chromatograph-ion mobility spectroscopy,GC-IMS)技术评价了坛紫菜和条斑紫菜的风味特征,发现条斑紫菜气味物质的总体含量更高,明确苯乙醛、壬醛等醛类化合物对条斑紫菜的整体愉悦气味有较大贡献,丙醛对坛紫菜整体的气味有较大贡献。然而,目前鲜见相关文献报道利用不同的乳酸菌发酵夹心海苔边脚料制备条斑紫菜酱以探索不同发酵时间挥发性化合物的变化。因此,本研究使用3 株乳酸菌发酵夹心海苔边脚料,包括植物乳杆菌MMB-05、干酪乳杆菌FJAT-7928 和以上两株菌的混合组(体积比1∶1),以不接种菌发酵为对照组,系统研究其在发酵24 h 和48 h 的挥发性风味物质的变化并筛选出特征风味物质,以期为改进条斑紫菜酱加工方法和提高紫菜相关产业的经济效益提供理论依据。
夹心海苔下脚料:连云港文德食品有限公司;MRS液体培养基:北京路桥技术股份有限公司;植物乳杆菌MMB-05:保藏于江苏海洋大学海洋食品与生物工程学院微生物种质资源室;干酪乳杆菌FJAT-7928:保藏于福建省农业科学院。
TGL 20MW 台式高速冷冻离心机:湖南赫西仪器装备有限公司;78-1 磁力加热搅拌器:泰州市中泰教学设备有限公司;YXQ-LS-50S 立式压力蒸汽灭菌锅:上海博迅实业有限公司医疗设备厂;ZGX-300E 智能光照培养箱:杭州钱江仪器设备有限公司;7890A-5975C 气相-质谱联用仪:美国Agilent 公司;75µm CAR/PDMS固相微萃取针:美国Supelco 公司。
将MRS 液体培养基总量0.1% 的植物乳杆菌MMB-05 和干酪乳杆菌FJAT-7928 菌液从甘油管中接种到MRS 液体培养基,传代2 次后,培养至对数期;将植物乳杆菌MMB-05 和干酪乳杆菌FJAT-7928 菌液以体积比1∶1 混合设置混合组,同时设置对照组(未接菌)作为对比。
1.4.1 乳酸菌发酵紫菜酱
1.4.1.1 紫菜酱的制备
准确称取100 g 干燥的夹心海苔边脚料并加入150 mL 的蒸馏水配制成酱糊状。搅拌均匀后在121 ℃下高压灭菌30 min。冷却至室温后,向紫菜浆中添加浆料体积总量3%的植物乳杆菌MMB-05、干酪乳杆菌FJAT-7928 和混合组(植物乳杆菌MMB-05 与干酪乳杆菌FJAT-7928 体积比1∶1)菌液,并设置对照组进行发酵,发酵温度设置在37 ℃,静置发酵24 h 和48 h。
1.4.1.2 发酵液提取
称取10.0 g 样品(精确至0.1 g)至250 mL 烧杯中,加入50 mL 去离子水稀释混匀,磁力搅拌器搅拌30 min,10 000 r/min 离心15 min,重复两次,收集上清液。
1.4.2 HS-SPME-GC-MS 测定
参考张琦梦等[13]的方法,向25 mL 顶空瓶中加入5 mL 上清液和1.5 g NaCl,室温下搅拌20 min,45 ℃平衡30 min;将已活化好的固相微萃取纤维头(270 ℃老化30 min)在45 ℃顶空萃取30 min;于260 ℃解吸5 min,完成进样。
GC 条件:色谱柱为HP-INNOWaxTM聚乙二醇毛细管柱(60 m×0.25 mm×0.25µm),进样口温度为260 ℃,柱初始温度为35 ℃,保持5 min,以6 ℃/min 的速率上升至225 ℃并持续10 min;载气为氦气,柱流速为1 mL/min;分流比为10∶1。
MS 条件:电子电离(electron ionization,EI)源,离子源温度为230 ℃,电子能量70 eV,MS 四极杆温度为150 ℃;扫描范围:50~550 m/z。
1.4.3 气味活度值评价方法
参考Lin 等[14]的方法计算样品中关键挥发性风味,采用气味活度值(odor activity value,OAV)评价各化合物对样品总体风味的贡献,气味活度值(O)按照下列公式计算。
O=C/T
式中:C为挥发性香气成分的相对百分含量,%;T为挥发性香气成分感觉阈值,µg/L。
通过NIST 14.L 数据库检索,对挥发性物质进行定性分析,使用峰面积归一化法计算挥发性物质的相对含量。使用IBM SPSS 26.0 软件对数据进行显著性分析,p<0.05 表示差异显著。WPS 软件进行数据统计,结果以平均值±标准差表示。Origin 2021 软件进行主成分分析、热图分析及绘图。
植物乳杆菌MMB-05 组、干酪乳杆菌FJAT-7928组、混合组(植物乳杆菌MMB-05 与干酪乳杆菌FJAT-7928 体积比1∶1)和对照组发酵24 h 和48 h 的条斑紫菜酱产生的挥发性风味物质相对含量见表1。
表1 不同发酵时间4 组条斑紫菜酱挥发性风味物质相对含量Table 1 Relative contents of volatile flavor substances in four groups of Porphyra yezoensis sauce with different fermentation times
由表1 可知,发酵到48 h 时,从4 组发酵样品中共检出化合物57 种,包括醛类16 种、醚类1 种、酮类8 种、醇类10 种、烃类10 种、酯类4 种、酸类4 种、杂环类4 种。这些挥发性物质的产生与碳水化合物、蛋白质和脂质的代谢密切相关,共同造就了发酵紫菜酱的独特风味。
烷烃和烯烃由脂肪酸的自氧化生成[15]。烷烃类化合物通常认为不具有气味活性,故对条斑紫菜酱整体风味贡献不大。烯烃类化合物具有较低的阈值,并且大多带有果香味,如8-十七烯具有柑橘香味,因此能赋予紫菜酱清新和香甜味。在发酵前后,4 组发酵样品均检测到8-十七烯、5-十八烯、苯乙烯。与对照组相比,植物乳杆菌MMB-05 组8-十七烯含量明显提高,从13.99%提高至19.40%,明显增强了紫菜酱香甜味,丰富了紫菜酱的风味。
酮类化合物由不饱和脂肪酸氧化或降解、氨基酸降解或微生物氧化产生[16]。酮类物质性质稳定,具有水果香、奶香等令人愉快的香气,其中3-羟基-2-丁酮、2,3-戊二酮及2-壬酮均呈现奶香味,反-β-紫罗兰酮可令食品具有强烈的类紫罗兰香气,对紫菜的腥味有一定的加和作用[17]。在整个发酵过程中,所有组均检测出3-羟基-2-丁酮和反-β-紫罗兰酮,且植物乳杆菌MMB-05 组3-羟基-2-丁酮相对含量最高。同时,与其他组相比,植物乳杆菌MMB-05 组还检测出2-壬酮,在丰富紫菜酱风味的同时降低其鱼腥味。
醛类化合物主要通过多不饱和脂肪酸在微生物和酶的作用下氧化降解形成,是食品中重要的香气化合物,大多数具有令人愉快的气味,例如草味、麦芽味、水果味和奶酪味。其中苯乙醛具有水果味和甜味,苯甲醛具有杏仁味,己醛具有鱼腥味,壬醛具有油脂味,正辛醛具有水果香味,(Z)-2-癸烯醛具有甜香、柑橘味[18-19]。在发酵前后,所有发酵组均检测出苯甲醛、乙醛、壬醛、藏红花醛和(E,Z)-2,6-壬二烯醛,丰富了紫菜酱独特的风味。与干酪乳杆菌FJAT-7928 相比,植物乳杆菌MMB-05 组中己醛相对含量明显降低,说明植物乳杆菌MMB-05 发酵可以降低紫菜酱的鱼腥味。
醇类化合物主要是由脂肪氧化、氨基酸和碳水化合物的代谢产生,通常被认为是发酵产品中许多生化反应的前体[20]。醇类化合物的阈值高,对发酵酱的整体风味贡献较小,但一些不饱和醇的阈值低,具有蘑菇香味和类金属风味[21],对紫菜酱的整体特征风味有一定贡献。除对照组外,其他乳酸菌组在整个发酵过程中均检测出正己醇和苯甲醇。1-辛烯-3-醇由花生四烯酸氧化而成,具有蘑菇香味,并且在发酵前后的所有组中均被检测到,是条斑紫菜酱的一种重要的气味化合物。
酸类物质主要来源于氨基酸的分解代谢或脂肪酸的氧化,酸类物质具有果味、芝士味、脂肪味[22],能赋予发酵样品特殊的风味。除对照组外,在其他3 组乳酸菌在发酵24 h 时均检测出辛酸。另外,植物乳杆菌MMB-05 组在发酵后期检测出L-乳酸,且含量达15.62%,这与乳酸菌的产酸有关。同时,适宜的产酸量可以丰富紫菜酱的风味,使其爽口清甜。
酯类物质主要通过紫菜酱发酵过程中产生的酸与醇的酯化反应形成,酯类化合物大多具有水果香味。在所有组的发酵过程中均被检测到辛酸乙酯和二氢猕猴桃内酯。乙酸癸酯具有菠萝样底香的甜美香味[23],与其他组相比,植物乳杆菌MMB-05 组在48 h 检测出的乙酸癸酯含量最高,对紫菜酱的特征风味有一定影响。
所有样品中共检测出4 种杂环化合物,包括吡嗪、呋喃及其衍生物,这些化合物通常由美拉德反应或氨基酸分解形成。据报道,在杂环化合物中,吡嗪类化合物具有显著的坚果、烘焙以及烤面包味,呋喃类化合物会令发酵产品具有焦糖、甜味及烘焙风味[24]。在发酵前后,只有植物乳杆菌MMB-05 组中检测出2-乙酰基呋喃、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪,能够对紫菜酱贡献独特风味。
植物乳杆菌MMB-05、干酪乳杆菌FJAT-7928、混合组(植物乳杆菌MMB-05 与干酪乳杆菌FJAT-7928体积比1∶1)和对照组发酵24 h 和48 h 的条斑紫菜酱共检测出8 种挥发性风味物质,其类别数目与含量百分占比如图1。
图1 不同发酵时间4 组条斑紫菜酱挥发性组分类别数目与含量百分占比Fig.1 Number and percentage of volatile components in the four groups of P.yezoensis sauce with different fermentation times
由图1 可知,所有发酵组在相同发酵时间以及不同发酵时间的风味物质均存在差异,发酵24 h 时,植物乳杆菌MMB-05 组、干酪乳杆菌FJAT-7928 组、混合组和对照组中醛类化合物数量相比较其他种类化合物更多,分别为16、15、10 种和15 种,烃类化合物次之,除植物乳杆菌MMB-05 组和混合组外,其余组未检测出醚类化合物。
发酵48 h 时,所有发酵样品中挥发性物质种类发生明显变化。植物乳杆菌MMB-05 组和干酪乳杆菌FJAT-7928 组醛类物质的相对含量分别从27.32%、29.92% 减少到23.07%、20.76%。混合组烃类物质的相对含量变化最明显,从42.85% 减少到9.07%。此外,植物乳杆菌MMB-05 组新检测出大量酸类挥发性物质,这与乳酸菌的产酸有关。对照组中,醛类化合物相对含量变化最明显,从25.96%下降到5.61%。
挥发性物质含量并不能够完全反映该物质对香气的贡献度,为判断其对整体风味的影响程度,本研究通过气味活性值来确定影响风味较大的关键物质。OAV 值的大小通常与其香气贡献程度呈正相关,当组分的OAV≥1 时,该物质对于挥发性风味的贡献大,为主要香气成分;当0.1≤OAV<1 时,该成分起到风味修饰作用[25]。OAV 越大说明这种物质对样品的总体风味贡献也越大。4 组条斑紫菜酱挥发性物质的OAV 结果见表2。
表2 不同发酵时间4 组条斑紫菜酱挥发性物质的OAVTable 2 OAV of volatile flavor substances in four groups of P.yezoensis sauce with different fermentation times
由表2 可知,在OAV≥1 和0.1≤OAV<1 的区间内,共检测出20 种对风味有一定影响的挥发物,其中包括10 种醛、4 种酮、4 种醇、1 种酸和1 种酯。在发酵24 h时,植物乳杆菌MMB-05 组中(Z)-2-庚烯醛、正辛醛、(E)-2-辛烯醛、(E,Z)-2,6-壬二烯醛、β-环柠檬醛、3-羟基-2-丁酮和α-紫罗兰酮的OAV≥1,说明这些物质对其发酵紫菜酱的挥发性风味贡献大,发酵至48 h 时,原风味物质不变的情况下增加了L-乳酸(OAV>1)的关键风味成分,L-乳酸的微酸味能赋予紫菜酱爽口清甜的口感,同时也能丰富紫菜酱的整体风味。发酵24 h 时,干酪乳杆菌FJAT-7928 组中(Z)-2-庚烯醛、正辛醛、(E)-2-辛烯醛、(E,Z)-2,6-壬二烯醛、β-环柠檬醛、α-紫罗兰酮和辛酸乙酯的OAV≥1,但到发酵后期,出现了己醛0.1≤OAV<1,这使得紫菜酱本身的腥味又显露出来,影响了紫菜酱的整体风味。混合组在整个发酵过程中只有(Z)-2-庚烯醛、正辛醛和(E,Z)-2,6-壬二烯醛的OAV≥1,这3 种挥发性风味物质不能完全掩盖紫菜酱本身的腥味,同时也不足以丰富紫菜酱的独特风味,导致紫菜酱的整体风味不佳。而对照组在整个发酵过程中只有(E,Z)-2,6-壬二烯醛和α-紫罗兰酮的OAV≥1,其紫菜酱整体风味不如前三者。同时,在所有发酵组中壬醛、反-β-紫罗兰酮(0.1≤OAV<1)能够和关键风味成分形成协同作用,参与紫菜酱整体风味的修饰作用。整个发酵过程中,植物乳杆菌MMB-05 和混合组中OAV 值最大的挥发性物质相同,均为(Z)-2-庚烯醛,而α-紫罗兰酮是干酪乳杆菌FJAT-7928 组中OAV 值最大的物质,(Z)-2-庚烯醛具有脂肪香气,α-紫罗兰酮具有紫罗兰花香,均对紫菜酱独特风味的形成有重要贡献。综合来看,与其他组相比,植物乳杆菌MMB-05 组发酵的条斑紫菜酱风味成分更丰富,整体风味也更浓郁。这与Gao 等[26]的研究结果一致。
对4 组样品发酵24 h 和48 h 产生的挥发性物质进行主成分分析,得到3 个主成分,结果如图2 所示。
图2 不同发酵时间4 组条斑紫菜酱的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of four groups of P.yezoensis sauce with different fermentation times
由图2 可知,3 个主成分的挥发性风味物质贡献率分别为48.8%、22.8% 和16.6%,累计贡献率为88.2%,能够反映挥发性风味物质的大部分信息[27]。根据样品间的分布特征,可以了解不同发酵时间与风味物质间的关系。从图2A 可以看出,不同发酵组发酵的紫菜酱主要挥发性物质分布较为随机,主要在第2主成分上有差异,说明同一发酵组样品随发酵时间延长其挥发性物质变化不一致。植物乳杆菌MMB-05 组和混合组发酵前后的分布较分散,说明发酵24 h 和48 h 的紫菜酱的挥发性风味差异较大。植物乳杆菌MMB-05 组在发酵24 h 时的样品分布距离较其他组远,表明其挥发性物质组成有较大差异,这是因为醚类特征化合物将这组样品区分开来。样品的分布区域和某种挥发性风味物质的分布越接近,则说明该物质对此样品的风味贡献越大[28]。酯类和醛类与3 组乳酸菌发酵24 h 的样品分布较为接近,这说明酯类和醛类对3 组乳酸菌组条斑紫菜酱的香气起到主要贡献作用;48 h 时,酸类和醛类与3 组乳酸菌组发酵样品分布较为接近,醛类和酮类与对照组样品分布较为接近,这说明酸类和醛类化合物为3 组乳酸菌组紫菜酱香气起到主要贡献作用,而醛类和酮类对对照组样品的香气起到主要贡献作用。这与OVA 分析结果较为一致。
选取26 种对发酵24 h 和48 h 紫菜酱起主要贡献作用的主体风味物质,对其含量变化进行热图分析,结果如图3 所示。
图3 不同发酵时间4 组条斑紫菜酱挥发性物质含量变化热图Fig.3 Heatmap of changes in the contents of volatile substances in four groups of P.yezoensis sauce with different fermentation times
由图3 可知,各发酵组在24 h 和48 h 时的挥发性物质谱图有所差异,由于风味前体物质的分解代谢,挥发性物质谱图随时间而发生了改变,其中植物乳杆菌MMB-05 组在发酵前后,丙醛、丁酸、反-β-紫罗兰酮、壬醛、(Z)-2-癸烯醛、(E,Z)-2,6-壬二烯醛6 种物质均有所增加,说明这6 种化合物很大程度上影响了紫菜酱发酵过程中的风味,并且随着发酵时间延长,紫菜酱样品的气味趋于相似。干酪乳杆菌FJAT-7928 组在发酵前后,醛类、酮类、烃类和酯类化合物均随发酵时间延长含量有所增加,但样品在发酵前后气味不相似,挥发性风味发生了明显变化。混合组在发酵前后,(Z)-2-庚烯醛、(E)-2-辛烯醛、β-环柠檬醛这3 种物质含量随发酵时间延长得到了提高,说明这3 种化合物很大程度上影响了紫菜酱发酵过程中的风味,并且样品在发酵前后的气味不相似,挥发性风味物质发生了变化。
本研究采用HS-SPME-GC-MS 技术检测了不同乳酸菌及未添加乳酸菌发酵24 h 和48 h 的条斑紫菜酱挥发性风味物质的变化,共鉴定出57 种挥发性化合物。在发酵24 h 时,植物乳杆菌MMB-05 组3-羟基-2-丁酮相对含量最高,达到20.01%,对照组中8-十七烯相对含量最高,为20.76%。与发酵24 h 的样品相比,发酵48 h 后的紫菜酱样品中醛类和酯类相对百分含量明显减少,其中对照组醛类减少最明显,从25.96%减少到5.61%,酸类物质相对百分含量有所上升,尤其是植物乳杆菌MMB-05 组酸类物质上升最明显,从0.71% 上升到23.81%。然后采用OAV 法、主成分分析和热图分析发酵24 h 和48 h 各发酵样品的主体风味构成。结果表明,植物乳杆菌MMB-05 组中(Z)-2-庚烯醛、正辛醛、(E)-2-辛烯醛、(E,Z)-2,6-壬二烯醛、β-环柠檬醛、α-紫罗兰酮的OAV≥1,干酪乳杆菌FJAT-7928 组中(Z)-2-庚烯醛、正辛醛、(E)-2-辛烯醛、(E,Z)-2,6-壬二烯醛、α-紫罗兰酮和辛酸乙酯的OAV≥1,混合组中(Z)-2-庚烯醛、正辛醛和(E,Z)-2,6-壬二烯醛的OAV≥1,而对照组在发酵过程中均为(E,Z)-2,6-壬二烯醛和α-紫罗兰酮的OAV≥1,这些挥发性化合物成为各自发酵组的关键风味成分,而苯甲醛、壬醛、反-β-紫罗兰酮等物质(0.1≤OAV<1)能够和上述风味成分形成协同作用,对发酵紫菜酱的整体风味发挥着修饰作用。综合评价发现,植物乳杆菌MMB-05 更适合作为条斑紫菜酱的发酵剂,其发酵的紫菜酱相比于其他组风味成分更丰富,整体风味也更浓郁。
在后续的研究中,可以考虑使用溶剂辅助蒸发法与HS-SPME 法相结合,也可考虑采用内标法测得挥发性物质的具体含量,以得到更加全面的香味成分数据,进一步为发酵条斑紫菜酱风味品质的优化及深加工提供理论依据。