不同产地花椒中多酚类物质的鉴定与差异性分析

刘洋洋，袁源，陈龙，李如一，奎杰，李积华*，廖良坤*

（1.中国热带农业科学院农产品加工研究所农业农村部热带作物产品加工重点实验室,广东湛江 524001；2.海南省果蔬贮藏与加工重点实验室,广东湛江 524001）

花椒（ZɑnthoxylumbungeɑnumMaxim.）是芸香科、花椒属植物的果皮,是典型的“药食同源”作物。全世界大约有260 种花椒,我国目前栽培约有39 种[1]。我国是花椒第一生产大国,主产区为河北、陕西、山西、四川、云南等地。最新研究表明,花椒中含有生物碱、香豆素、类固醇、萜类等化学成分,具有扩张血管、调节血脂、抑制单胺氧化酶等生物活性[2]。花椒中的麻味素是一类生物碱类化合物,作为一种潜在的α-葡萄糖苷酶抑制剂[3],能够改善小鼠的糖脂代谢紊乱,具有潜在的2-型糖尿病治疗作用[4]。

多酚是一类具有多元酚结构的化学物质的统称,广泛存在于植物体内。研究表明,多酚可以防止紫外线破坏胶原蛋白的合成,起到抗衰老的作用[5]。多酚是大量草本植物及植物果实的主要抗氧化活性物质[6],可以通过清除自由基,起到预防肿瘤、保护心脑血管、治疗或预防人体慢性疾病的作用。针对多酚、黄酮类化合物的分析和鉴定,是食品及中医药领域的热门方向之一。石青浩等[7]通过高效液相色谱电喷雾离子化串联质谱（high performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry,LC-ESI-MS/MS）方法鉴定鼠曲草乙醇提取物中含有11 种多酚类化合物,包括8 种黄酮类化合物和3 种酚酸类化合物。李帆等[8]采用代谢组学技术从铁皮石斛样品中分析出202 种黄酮类化合物。花椒中含有丰富的多酚类化合物,孟宪华等[2]通过分离纯化鉴定手段,鉴定出青花椒中12 种多酚糖苷类化合物,并发现其具有良好的抗氧化活性。

本文以河北石家庄、江苏徐州、陕西安康、陕西韩城、四川汶川、四川仪陇、湖北宜昌、云南昭通六省八地的大红袍花椒为原料,采用超高压液相色谱串联高分辨飞行时间质谱仪（ultra high performance liquid chromatography tandem triple TOF high resolution mass spectrometry,UPLC-Triple TOF MS/MS）方法,鉴定多酚类物质并进行定量分析。此外,通过主成分分析法对8 个产地花椒进行分类描述,进而从多酚含量角度,阐述不同产地花椒之间的差异性,以期为花椒加工综合利用,如花椒精油提取等企业的加工废弃物多层次开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大红袍花椒:江苏金椒鸿香料科技研究院有限公司,来源于石家庄、徐州、安康、韩城、汶川、仪陇、宜昌、昭通8 个基地。

金丝桃苷、绿原酸、槲皮苷、异鼠李素标准品:上海麦克林生化科技有限公司；咖啡酸、7-羟基香豆素、山奈酚、秦皮乙素、原花青素B2标准品:上海源叶生物科技有限公司；表儿茶素、阿魏酸、儿茶素、槲皮素、香草酸、没食子酸标准品:阿拉丁试剂（上海）有限公司；原儿茶酸、石吊兰素标准品:北京索莱宝科技有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）:美国Sigma 公司。除特殊标注外,所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Eksigent ekspert ultraLC 110-XL 超高效液相色谱仪、Triple TOFTM5600+电喷雾飞行时间高分辨质谱仪:美国SCIEX 公司；CPA225D 电子分析天平:德国赛多利斯公司；HAS-2000 型超声波清洗机:深圳市好顺超声设备有限公司；MJ-BL25B3 研磨机:九阳股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

干花椒去梗、去籽,研磨粉碎后过40 目筛。称取5 g 花椒粉末置于250 mL 具塞三角瓶中,加入50 mL 80%乙醇,超声辅助提取60 min,反复提取3 次。合并滤液并抽滤,60 ℃真空浓缩至5 mL。

1.3.2 标准品溶液的制备

称取绿原酸、咖啡酸、香草酸等17 种标准品各0.2 mg,用2 mL 50%甲醇溶液溶解。继续使用50%甲醇溶液对各标准品溶液进行梯度稀释至适当检测浓度。

1.3.3 液质联用分析

色谱条件:ZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱（100 mm×2.1 mm,1.8µm）；流动相:100% 乙腈（A）-0.05%甲酸水溶液（B）,梯度洗脱:0～3 min,5%～12%A；3～33 min,12%～20% A；33～48 min,20%～35% A；48～50 min,35%～80%A。采用自动进样器进样,进样量为5µL,柱温40 ℃。

质谱条件:通过全扫描获得一级谱图,并通过数据采集模式获得二级谱图。电喷雾离子源:负离子模式；质量扫描范围m/z 100～1 000；离子源雾化气:55 psi（1 psi=6 894.757 Pa）；辅助加热气:55 psi；气帘气:40 psi；辅助加热温度:550 ℃；喷雾电压:-4 500 V；去簇电压:-80 V；碰撞能一级-10 V,二级-35 eV；扩展碰撞能量:15 eV。

1.4 数据分析

采取3 次平行试验,Excel 进行数据整理分析；质谱数据导入Peak ViewTM2.0 谱图数据分析处理工作站进行处理,采用Multi QuantTM3.0 工作站进行标曲绘制及定量分析；采用SPSS 22.0 软件进行数据相关性及主成分分析；采用ChemDraw 绘制质谱裂解图。

2 结果与分析

2.1 多酚类物质的结构鉴定

通过对不同产地花椒的UPLC-Triple TOF MS/MS检测,并经过与标准品及相关文献等比对分析后,在8 个产地花椒中共检测出35 种多酚类物质,其中酚酸类物质10 种、黄酮类物质20 种、苯丙素类（香豆素类）物质4 种和1 种酚醛类物质,具体裂解规律如表1 所示。

表1 花椒中多酚类化合物的鉴定Table 1 Identification of phenolic compounds in Zanthoxylum bungeanum

由表1 可知,花椒中发现的酚酸类化合物主要为羟基苯甲酸类和苯丙酸类两类化合物。以化合物3 为例,其分子离子峰为m/z 315[M-H]-,其主要碎片离子有m/z 153[M-H-Glu]-、m/z 109[M-H-Glu-CO2]-、m/z 91[M-H-Glu-CO2-H2O]-,结合Zhong 等[9]研究结果,鉴定其为原儿茶酸-4-O-葡萄糖苷,其裂解途径如图1 所示。

图1 原儿茶酸-4-O-葡萄糖苷裂解途径Fig.1 Mass fragmentation pathways of protocatechuic acid 4-O-glucoside

花椒中20 种黄酮类化合物多以槲皮素和山奈酚衍生物为主,如化合物16,比对标准品被鉴定为槲皮苷。分子离子峰m/z 447 经断裂而失去一分子鼠李糖形成苷元碎片m/z 301。苷元碎片C 环的RDA 裂解可丢失中性片段—C7H2O4形成m/z 151 碎片；或在电离过程中失去CO,形成m/z 271[M-H-Rha-2H-CO]和255[MH-Rha-CO-OH]两个片段。

4 种香豆素类化合物（化合物31～34）秦皮乙素、7-羟基香豆素、6-羟基-7-甲氧基香豆素和8-羟基-6,7-二甲氧基香豆素,其分子结构类似,主体化学结构见图2。

图2 香豆素类化合物的化学结构Fig.2 Chemical structure of coumarins

质谱碎裂方式也类似。以秦皮乙素为例,具有最高丰度（100%）的分子离子峰m/z 177 [M-H]-片段,在连续脱离一分子CO,一分子CO2后形成碎片m/z 149和m/z 105。或者,分子离子峰m/z 177 连续断裂2 分子CO2而形成m/z 133 和m/z 89 片段,秦皮乙素裂解途径如图3 所示。

图3 秦皮乙素裂解途径Fig.3 Mass fragmentation pathways of esculetin

2.2 多酚类化合物的定量分析

花椒中多酚类化合物的定量分析见表2。

表2 花椒中多酚类化合物的定量分析Table 2 Quantitative analysis of phenolic compounds in Zanthoxylum bungeanum

由表2 可以看出,绿原酸、儿茶素、表儿茶素、槲皮苷、金丝桃苷、原花青素B2等多酚类化合物含量较高,其中绿原酸、槲皮苷和金丝桃苷含量最高,这与Yang等[20]的结果一致。

金丝桃苷是黄酮类物质中含量最为丰富的一类,在8 个产地花椒中均有较高分布,其中宜昌产花椒金丝桃苷量高达（3 787.8±8.7）µg/g。槲皮素、异鼠李素在结构上仅相差一个—OCH3,而在含量分布上,两者也比较相似,徐州、石家庄、韩城、宜昌四地样品中均检出。儿茶素和表儿茶素是一对同分异构体,是构成原花青素类物质的基本组成单位,在不同产地中均有较高分布,较高的儿茶素含量与原花青素含量具有正相关。在所有产地的花椒中,儿茶素的含量整体高于表儿茶素,并且基本维持在2∶1 的比例关系。

秦皮乙素和7-羟基香豆素是香豆素类衍生物。7-羟基香豆素也是唯一一种存在于所有8 个产地的香豆素类物质,其中徐州产地花椒含量最多,为（137.0±2.0）µg/g,秦皮乙素在石家庄和韩城两地样品中没有检出,与石吊兰素似乎有一种不相容的现象。在所有6 个产地中,秦皮乙素的含量分布差异最大,安康花椒几乎是昭通的15 倍,是含量汶川样品的2.7 倍。

综上,安康样品的多酚含量较高,在被定量的17 种物质中,原儿茶酸（212.9±10.4）µg/g、没食子酸（5.4±0.1）µg/g、秦皮乙素（1 208.0±35.7）µg/g、儿茶素（2 782.7±17.3）µg/g、表儿茶素（1 449.9±6.3）µg/g、槲皮苷（3 099.0±33.4）µg/g 和原花青素B2（2 432.5±37.3）µg/g 7 种物质含量最高。

2.3 花椒多酚相关性分析

将不同产地来源花椒的17 种多酚物质进行皮尔逊相关分析,结果见表3。

表3 花椒多酚间的皮尔逊相关性分析Table 3 Pearson correlation analysis of polyphenols in Zanthoxylum bungeanum

由表3 可知,原儿茶酸、没食子酸、儿茶素、表儿茶素、秦皮乙素、原花青素6 种物质相互之间存在极显著正相关（P<0.01）,与异鼠李素、槲皮素呈负相关。而咖啡酸、香草酸、羟基香豆素、金丝桃苷呈极显著正相关（P<0.01）,与异鼠李素和槲皮素呈显著正相关（P<0.05）。阿魏酸与其它16 种酚类物质无论在正向还是负向上均没有显著相关性,石吊兰素由于仅在韩城和石家庄样品中有所发现,因此与其它酚类物质相关性也不大。此外,绿原酸、山奈酚、槲皮苷3 种物质与其它酚类物质的相关性较小,这些物质对后续的主成分分析均有很大影响,因此没有被作为变量进行后续的主成分分析。

2.4 主成分分析及综合评价

根据多酚物质的相关性分析结果,将12 种相关性多酚物质作为指标,采用SPSS 22.0 软件进行主成分分析,结果见表4。

表4 旋转后的成分矩阵、特征值和方差贡献率Table 4 Rotated component matrix，eigenvalue and variance contribution rate

由表4 可知,特征值大于1 的主成分共有3 个,累计方差贡献率为92.696%,能够代替原有的12 个指标,达到降维目的。

表4 反映了各个指标作用,第一主成分代表槲皮素、异鼠李素、儿茶素、原花青素B2、表儿茶素5 种黄酮类物质,其方差贡献率为36.419%,其中槲皮素和异鼠李素与其它3 种化合物呈负相关；第二主成分主要代表没食子酸、秦皮乙素和原儿茶酸3 种物质,是以酚酸类物质为主导的多酚化合物,其方差贡献率为28.579%；第三主成分主要代表咖啡酸、香草酸和7-羟基香豆素,是以苯丙素为主体的多酚化合物,其方差贡献率为27.698%。根据得分系数矩阵中各个成分对应的得分系数为特征向量,构建主成分得分表达式如下。

F1=0.088X1-0.314X2-0.078X3-0.146X4-0.230X5-0.394X6+0.036X7+0.211X8+0.207X9-0.114X10+0.236X11。

F2=-0.043X1+0.195X2+0.157X3+0.398X4+0.468X5+0.225X6-0.044X7-0.016X8-0.012X9+0.355X10-0.046X11。

F3=0.338X1+0.113X2+0.314X3+0.067X4-0.007X5-0.063X6+0.308X7+0.024X8-0.005X9+0.007X10+0.035X11。

以方差贡献率为权重,构建花椒综合评价模型:Dn=36.419%F1+28.579%F2+27.698%F3,并计算综合得分,结果如表5 所示。

表5 各主成分综合得分Table 5 Comprehensive score of each principal component

3 结论

我国花椒产地较多,尤其以西南地区品质较佳。仪陇、韩城的大红袍等优质红椒产区均是建立在以香气浓郁、麻味醇厚的基础上,更符合调味品的分类方式。本文选取六省八地大红袍花椒,以多酚类活性物质为指标,对不同产地花椒进行评价发现,安康、宜昌、徐州的花椒多酚类物质总体含量较高,处于前三位置。尽管花椒生长并不需要大量水分,但三地优越的水文条件很有可能是酚类物质聚集的原因。而传统产区四川仪陇及汶川地区,花椒多酚产量居中,优于昭通、韩城、石家庄三地。

通过UPLC-Triple TOF MS/MS 定性定量分析发现,8 个产地花椒不仅在多酚种类分布上存在特异性,在含量上也有显著差别。被鉴定的35 种多酚类物质中,仅有18 种多酚分布在全部样品中,并且其中7 种为酚酸类物质。酚酸类物质在植物体内是构成木质素、细胞壁基本成分,因此在各种植物体内均有分布。在定量分析中发现,含量越高的物质,越倾向于更广的分布。槲皮苷和金丝桃苷是花椒中含量最为丰富的两种黄酮类化合物,在8 个产地中的分布较为均衡。而石吊兰素、异鼠李素、槲皮素等含量较低的酚类物质,分布较少,且集中分布在石家庄和韩城。定量结果发现,儿茶素和表儿茶素的含量,存在一个稳定的关系,这需要进一步的代谢机制分析。本文首次对大红袍花椒中的多酚类物质进行了较为系统的研究,并对其分布差异和含量差异做了总结分析,并以含量差异为指标,对花椒物质做了评价分析,为花椒产业深加工、提质增效提供数据支撑。