重复分批发酵与泡沫分离耦合生产多粘菌素E

2024-05-06 14:10李思雨孟之超郑辉杰
食品研究与开发 2024年8期
关键词:多粘菌素吐温效价

李思雨,孟之超,郑辉杰

(河北工业大学化工学院,天津 300401)

随着生活水平的不断提高,人们对食品健康安全越来越重视。在畜牧养殖业中,抗生素被大量应用于畜禽生病治疗和提高抗病能力上,当这些畜禽被制作成食品时,就要考虑这些食品被食用后,畜禽类体内残留的抗生素是否会影响到人类健康。多粘菌素E 是一种对革兰氏阴性菌有很强抗菌作用的多肽类抗生素[1],其所含毒性不大,安全性较高,多粘菌素E 不易被人体肠道吸收,但能被畜禽吸收降解,作为饲料添加剂能够促进畜禽生长,且在体内的药物残留率低。现今多粘菌素E 作为一种安全的添加剂用于食用的畜禽的饲料中,提高了多粘菌素E 的需求量。因此,为满足市场需求,提高多粘菌素E 产量变得尤为重要[2-3]。

近年来,人们在提高多粘菌素E 产量上进行了许多研究:1)利用高通量策略筛选多粘菌素E 高产菌株[4];2)优化发酵培养基[5],如Yu 等[6]用淀粉代替葡萄糖,优化多粘菌素E 发酵培养基,通过影响多粘菌素E生物合成的相关基因表达促进了多粘菌素E 的产生和多粘类芽孢杆菌的生长;3)改变发酵方式[7],如董凯等[8]采用分批补料的方式进行生产,提高了多粘菌素E的产量。而重复分批发酵的方式还未应用于多粘菌素E 的生产上,重复分批发酵通过定期去除发酵液并添加新鲜培养基的方式,来提高产物产量[9]。此发酵方法可缩短发酵的前期准备时间,延长发酵中产物的生产时间[10]。

发酵液的大量置换,会减少培养基中的菌种含量进而影响生产,故应选取合适的分离方法将发酵液中的菌种与产物分离,使含有菌种的部分发酵液重新进入重复分批发酵中。常用分离方法有色谱分离法[11]、大孔树脂吸附法[12]、萃取分离法[13]和沉淀分离法[14],但是这些分离方法大多会对菌体造成损伤且难以与发酵耦合,分离出的菌体无法继续应用于发酵生产。泡沫分离是在物质具有表面活性的基础上,通过通气产生气泡,使需分离的物质吸附在气液界面随泡沫吹出,从而达到浓缩分离产物的目的。此分离方法具有分离条件温和、设备机械部件少、易于工业放大等优点[15-16]。使用泡沫分离方法分离产物,对发酵液内的菌种伤害较小,且设备装置简单,易与发酵结合,泡沫分离法应用的前提是分离物质需为具有表面活性的物质,而多粘菌素E 具有表面活性可应用泡沫分离进行产物分离[17]。故可将重复分批发酵与泡沫分离耦合应用于生产分离多粘菌素E。

本研究的目的是通过重复分批发酵与泡沫分离耦合提高多粘菌素E 的产量并从发酵液中浓缩富集多粘菌素E。在发酵过程中加入非离子表面活性剂吐温80,有试验证明吐温80 可以提高细菌素的产量,表面活性剂的添加也能够提高起泡性和泡沫稳定性[18-19]。本文对发酵液的置换时间和置换比例进行优化,在此基础上优化吐温80 的添加时间和添加量,并确定气体体积流量对多粘菌素E 分离的影响。在最优条件下将重复分批发酵与泡沫分离耦合,以细胞干重和多粘菌素E 效价为指标,探究耦合发酵分离方法对多粘菌素E 产量的影响。本文采用重复补料分批发酵和泡沫分离耦合的方法生产多粘菌素E,以解除产物抑制,简化分离工序,促进多粘菌素E 生产,以期为多粘菌素E 的生产分离工艺提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

多粘菌素E 生产菌多粘类芽孢杆菌(Bɑcilluspolymyxɑ)由河北工业大学生物工程系菌种保藏室提供;磷酸二氢钾、蛋白胨、葡萄糖(均为分析纯):上海阿拉丁生化科技股份有限公司;无水硫酸钠、氯化钠、氨水(均为分析纯)、乙腈(色谱纯):天津市科密欧化学试剂有限公司;吐温80(分析纯):上海麦克林生化科技有限公司;硫酸铵、硫酸亚铁(均为分析纯):天津市风船化学试剂科技有限公司;酵母浸粉(分析纯):北京奥博星生物技术有限责任公司;硫酸多粘菌素E 标准品(分析纯):河北圣雪大成制药有限责任公司。

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计(UV-1100):上海美谱达仪器有限公司;恒温加热磁力搅拌器(85-2A):杭州仪表电机有限公司;高效液相色谱仪(LC-20A):岛津企业管理(中国)有限公司;发酵设备:河北工业大学发酵与生物分离工程实验室自制;台式高速离心机(3K18):美国Sigma 公司。

1.3 方法

1.3.1 培养基的制备

多粘类芽孢杆菌活化培养基:葡萄糖10 g/L,酵母浸粉10 g/L,蛋白胨1 g/L,氯化钠1 g/L。氨水调节pH值至7.0,121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

多粘类芽孢杆菌种子培养基:葡萄糖20 g/L,酵母浸粉40 g/L,氯化钠1 g/L,磷酸二氢钾0.5 g/L。氨水调节pH 值至6.8,121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

多粘类芽孢杆菌发酵培养基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨10 g/L,硫酸铵10 g/L,氯化钠1 g/L,硫酸亚铁0.1 g/L,磷酸二氢钾0.1 g/L。氨水调节pH 值至7.0,121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.3.2 检测方法

1.3.2.1 多粘类芽孢杆菌细胞干重测定

生物量与吸光值(OD600)的标准曲线绘制:在32 ℃、200 r/min 条件下摇瓶培养多粘类芽孢杆菌发酵液,从发酵开始到发酵结束,每1 h 取两份发酵液样品,待发酵液OD600值不再增大后停止取样。一份样品进行适当稀释,在波长600 nm 下,测定吸光值。另一份样品取5 mL 放入10 mL 已称重的干燥离心管中,离心管质量为m1,放入高速离心机中,10 000 r/min 离心10 min 后取出上清液,再加入适当生理盐水洗涤,同样方法离心两次后放入烘箱中在100 ℃条件下至完全干燥,称重,质量记为m2。样品的干重(dry cell weight,DCW)m=m2-m1。

细胞干重(y)与吸光值(x)的关系:y=12.43x+0.03,R2=0.998。通过测定600 nm 波长下的吸光值得到相应的细胞干重。

1.3.2.2 多粘菌素E 效价测定

利用高效液相色谱法定量检测多粘菌素E 效价,使用色谱柱C18(160 mm×4.6 mm×3.5µm),流动相为乙腈-无水硫酸钠溶液,取多粘菌素E 标准品用稀硫酸稀释至合适的浓度梯度,在波长215 nm、流速1 mL/min 条件下测定峰面积,将多粘菌素E 效价与其对应峰面积拟合标准曲线,得到多粘菌素E 效价(Y)与峰面积(X)的关系:Y=3.76X+393.01,R2=0.996。

1.3.2.3 泡沫分离性能评价

多粘菌素E 的泡沫分离效率用富集比(F)和回收率(R,%)评价,计算公式如下。

F=Tf/Ti

R=TfVf/TiVi

式中:Tf为泡沫液中多粘菌素E 效价,U/mL;Ti为发酵原液中多粘菌素E 效价,U/mL;Vf为泡沫液的体积,mL;Vi为发酵原液的体积,mL。

1.3.3 重复分批发酵条件的选择

1.3.3.1 多粘类芽孢杆菌发酵

刮取斜面中的多粘类芽孢杆菌菌种接种于种子液中,在33 ℃、200 r/min 的摇床中培养24 h 后,将种子液以10%(体积比)的比例加入发酵液中,在32 ℃、200 r/min 的条件下摇床培养72 h,每4 h 取样测定细胞干重和多粘菌素E 效价,绘制多粘类芽孢杆菌发酵生长曲线,初步选定重复分批发酵的置换时间。

1.3.3.2 重复分批发酵置换时间的确定

将300 mL 发酵液置于500 mL 摇瓶中发酵确定发酵液置换时间点分别为第24、36、48 小时,发酵置换比例设定为70%,发酵72 h,每6 h 从发酵液中取1 次样,测定多粘菌素E 效价,探究发酵液置换时间对多粘菌素E 产量的影响。

1.3.3.3 重复分批发酵置换比例的确定

将300 mL 发酵液置于500 mL 摇瓶中,在32 ℃、200 r/min 的条件下进行发酵培养,在发酵的第36 小时进行发酵液置换,置换比例分别为50%、60%、70%、80%。每12 h 从发酵液中取1 次样,测定多粘菌素E效价和多粘类芽孢杆菌细胞干重,探究发酵液置换比例对多粘菌素E 产量的影响。

1.3.3.4 吐温80 添加时间的确定

将300 mL 发酵液置于500 mL 摇瓶中,在32 ℃、200 r/min 的条件下进行发酵培养,吐温80 添加时间设定为第1 次发酵的第0、8、16、24、32 小时和置换后的第0、3、6、9 小时,吐温80 添加量为0.15%。以不添加吐温80 的发酵液作为对照组,分别在发酵液第1 次置换的第36 小时和置换后的第12 小时取样,测定多粘菌素E 效价和细胞干重,探究吐温80 添加时间对多粘菌素E 产量的影响。

1.3.3.5 吐温80 添加量的确定

将300 mL 发酵液置于500 mL 摇瓶中,在32 ℃、200 r/min 的条件下进行发酵培养,在发酵的第24 小时添加吐温80,吐温80 添加量分别为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%,在第36 小时取样,测定多粘菌素E 的效价和多粘类芽孢杆菌的细胞干重,探究吐温80 添加量对多粘菌素E 产量的影响。

1.3.4 泡沫分离气体体积流量的选择

将置换出的含有吐温80 的发酵液导入泡沫分离塔中,气体体积流量分别为40、60、80、100、120 mL/min,进行泡沫分离并测定富集比和回收率,探究气体体积流量对多粘菌素E 分离效率的影响。

1.3.5 重复分批发酵与泡沫分离耦合装置的构建

构建重复分批发酵与泡沫分离耦合装置如图1 所示,发酵罐的体积为1 L,装液量为900 mL,将发酵罐与泡沫分离塔用蠕动泵连接,形成循环回流密闭装置生产多粘菌素E,并在发酵罐上连接装有新鲜发酵液的锥形瓶用于补充培养基,发酵罐上含有进料口、发酵液泵出口、残液回流口和取样口,以满足试验中发酵液置换、补料和取样的要求。将发酵罐放在恒温加热磁力搅拌器上,发酵罐中放入转子,发酵罐具有温度检测、pH 值检测装置放置处,以满足发酵条件检测需求,设置条件:温度32 ℃、pH7、转速200 r/min。及时补加氨水调节pH 值,将种子液以10%(体积比)的添加量加入发酵液中培养,在第36 小时进行耦合操作,首先将发酵液通过蠕动泵泵入泡沫分离塔中进行泡沫分离;在泡沫分离结束后,将残液泵回发酵罐中,并将新鲜发酵液泵入发酵罐使发酵罐内发酵液含量至最初装液量;然后继续进行发酵至下次置换,并重复以上操作直至发酵结束。

图1 重复分批发酵与泡沫分离耦合装置图Fig.1 Installation diagram of repeated batch fermentation coupled with foam fractionation

1.3.6 重复分批发酵与泡沫分离耦合操作方法

在发酵培养的第24 小时和每次发酵液置换后的第6 小时向发酵罐中加入0.15%的吐温80,并在发酵培养的第36 小时和每次发酵液置换后的第12 小时进行泡沫分离,在80 mL/min 的气体体积流量下分离1 h后,将残液泵回发酵罐中并添加新鲜培养基至初始容积,发酵过程中每12 h 测定1 次多粘菌素E 效价和细胞干重。

1.4 数据处理

所有试验重复3 次,用Origin2023 进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 多粘类芽孢杆菌发酵结果

多粘类芽孢杆菌发酵过程见图2。

图2 多粘类芽孢杆菌发酵过程Fig.2 Fermentation process of Bacillus polymyxa

多粘类芽孢杆菌的发酵周期一般为48~72 h,由图2 可知,在0~4 h 为多粘类芽孢杆菌细胞生长延滞期,细胞生长缓慢,多粘菌素E 产量也较低,在4~24 h为多粘类芽孢杆菌细胞生长对数期,此周期细胞生长迅速,但多粘菌素E 产量仍然较低;在24~40 h 为稳定期,此时菌体繁殖速度减弱,趋于平稳,在36 h 时多粘菌素E 产量大幅度上升至最高水平;在40 h 后菌体进入衰亡期,菌体停止生长并开始死亡,多粘菌素E 产量不再提高。多粘类芽孢杆菌发酵过程分为3 个不同时期:菌体繁殖期、分泌期和芽孢形成期[20],初步选定这3 个时期为发酵液置换时间点,即在发酵的第24、36、48 小时进行置换。

2.2 发酵液置换时间对多粘菌素E 效价的影响

表1 为不同发酵液置换时间点的多粘菌素E 效价,由于66、72 h 时的数据波动较小,故未列出。

表1 不同发酵液置换时间点的多粘菌素E 效价Table 1 Polymyxin E titer at different time points of fermentation broth replacement U/mL

由表1 可知,在3 个时间点进行置换,置换后效价都在置换后的第12 小时达到最高值,这是由于置换时发酵液中的多粘类芽孢杆菌含量远高于初次接种量,并没有明显的生长延滞期,而是快速繁殖,分泌多粘菌素E。因此置换后选择在第12 小时进行下次发酵液置换。在第36 小时进行发酵液置换,得到最高的多粘菌素E 产量为17 929.8 U/mL。这是因为在24 h 时处于多粘类芽孢杆菌发酵的菌体繁殖期,更换新的发酵液后,细菌不能快速适应新的环境,无法快速大量分泌多粘菌素E,且在此时期培养基内的营养物质还比较充足,置换培养基对发酵影响并不大。在48 h 时处于多粘类芽孢杆菌的芽孢形成期,此时菌体开始走向衰老,活性减小,不能很好地适应新的培养环境,此时置换发酵液会造成菌体的大量死亡,以致产量大大降低,所以置换后产量较其他置换时间点偏低。在36 h 时处于多粘类芽孢杆菌发酵的分泌期,即大多处于多粘类芽孢杆菌的稳定期,此时多粘菌素E 产量达到最高,且发酵液中营养物质被大量利用。此时更换发酵液,稳定期的细菌快速适应新的培养环境,细菌开始下一批生长繁殖,在稳定期进行置换时发酵罐中处于稳定期的细胞多于对数期和衰亡期,更有利于大量分泌多粘菌素E。故选择在36 h 进行第1 次置换,之后每12 小时置换一次,直至多粘菌素E 产量降低。

2.3 发酵液置换比例对多粘菌素E 效价和细胞干重的影响

发酵液置换比例对多粘菌素E 效价和细胞干重的影响见图3。

图3 发酵液置换比例对多粘菌素E 效价和细胞干重的影响Fig.3 Effect of replacement ratio of fermentation broth on polymyxin E titer and cell dry weight

由图3A 可知,当置换比例为50%时,置换后多粘菌素E 产量均低于初始发酵中多粘菌素E 产量,在4 次循环后产量更是大大减小。且多粘类芽孢杆菌细胞浓度也逐渐下降,第3 次循环时得到置换中的最高细胞干重为5.63 g/L,远低于第1 次发酵液中多粘类芽孢杆菌浓度(10.21 g/L)。这是因为多粘菌素E 的大量积累对多粘类芽孢杆菌造成产物抑制[21],而置换比例为50%时,置换后的发酵液中多粘菌素E 含量仍较高,产物抑制并没有得到很大缓解,抑制了多粘菌素E 产量的增加。由图3B 可知,当置换比例为60%时,置换后多粘菌素E 产量比置换比例50%时有所提高,在4 次循环后产量也大幅下降。由图3C 可知,当置换比例为70%时,置换后多粘菌素E 产量在前5 次循环时都较为稳定且较高,分别为19 272.64、19 242.5、19 749.9、21 698.5、18 131.5 U/mL。第6 次循环时多粘菌素E 产量为17 023.5 U/mL 较前几次循环的多粘菌素E 虽有所降低,但仍高于50%、60%时的多粘菌素E 产量。多粘类芽孢杆菌细胞干重分别为10.32、10.30、10.25、10.45、9.96、8.59 g/L,可知细胞能很快适应新的培养环境,快速繁殖。由图3D 可知,置换比例为80%时,6 次循环的多粘菌素E 产量分别为18 624.2、16 388.6、16 384.2、17 096.4、15 510.3、14 987.2 U/mL,多粘类芽孢杆菌细胞干重分别为10.45、9.59、9.77、9.84、8.70、8.09 g/L,相较于置换比例为70%时,多粘菌素E 浓度和菌种含量均有所下降,这是因为置换比例变高后,新置换的发酵液内菌种含量减少,与置换比例70%相比,发酵液内稳定期的细菌含量以及对新培养环境的适应能力均降低。在置换比例为70%,最高的多粘菌素E产量出现在第4 次循环,之后产量开始逐渐降低,在第6 次循环后多粘类芽孢杆菌发酵能力开始出现明显下降。综上,多粘类芽孢杆菌重复分批发酵可稳定循环6 次,置换比例为70%时效果最好。故选择发酵液置换比例为70%,重复分批发酵循环6 次后终止。

2.4 吐温80 添加时间对多粘菌素E 效价和细胞干重的影响

吐温80 添加时间对多粘菌素E 效价和细胞干重的影响见图4。

图4 吐温80 添加时间对多粘菌素E 效价和细胞干重的影响Fig.4 Effect of addition time of Tween 80 on polymyxin E titer and cell dry weight

由图4A 可知,不添加吐温80 的对照组的多粘菌素E 效价为17 879.9 U/mL,细胞干重为9.99 g/L。在发酵液置换前的第0、8、16、24、32 小时加入吐温80 所获得的多粘菌素E 效价分别为16 095.9、20 109.6、20 449.2、22 952.1、22 384.6 U/mL,细胞干重分别为6.35、7.53、7.54、9.62、9.77 g/L。Reese 等[22]研究表明吐温80 加入发酵液中可提高细菌素产物的产量,而多粘菌素E 为氨基酸构成的多肽[23],也应在发酵液中加入吐温80,以提高其产量。且与对照组相比,在发酵液置换前0 h添加吐温80 的多黏菌素E 产量却大大减少,且添加吐温80 后的细菌含量均低于对照组的细胞干重,这是因为吐温80 添加时细菌所处的生长时期不同,吐温80 的加入可以增加细胞膜的通透性,这可以增加多粘菌素E 向胞外分泌,提高多粘菌素E 产量,但在发酵初期多粘类芽孢杆菌处于生长的延滞期,细菌受外界环境影响较其他时期更大,使菌体的生长受到抑制,从而使产量大大减小,发酵液置换前8、16 h 时处于细菌生长的对数期,也会影响菌体的生长,此时产量虽然得到了提高,但会不利于进一步的重复分批发酵。而在发酵液置换前24、32 h 时,细菌生长已经进入了稳定期,吐温80 的加入对多粘类芽孢杆菌的繁殖存活影响很小,且产量大大增加。故选择发酵液置换前24 h 作为吐温80 添加时间。同理,由图4B 可知,应选择发酵液置换后第6 小时作为吐温80 添加时间。

2.5 吐温80 添加量对多粘菌素E 效价和细胞干重的影响

吐温80 添加量对多粘菌素E 效价和细胞干重的影响见图5。

图5 吐温80 添加量对多粘菌素E 效价和细胞干重的影响Fig.5 Effect of Tween 80 addition on polymyxin E titer and cell dry weight

由图5 可知,随着吐温80 添加量从0.05%增加到0.15%时,多粘类芽孢杆菌的细胞膜通透性逐渐增强,促进多粘菌素E 向胞外分泌,提高了多粘菌素E 的产量。吐温80 添加量为0.15%~0.30%时,吐温80 在培养基中的占比过多,使培养基过于黏稠,不利于营养物质被吸收利用,从而影响多粘菌素E 的生产。因此本研究中最佳吐温80 添加量为0.15%。

2.6 气体体积流量对泡沫分离的影响

气体体积流量对多粘菌素E 富集比和回收率的影响见图6。

图6 气体体积流量对多粘菌素E 富集比和回收率的影响Fig.6 Effect of gas volumetric flow rate on enrichment ratio and recovery rate of polymyxin E

由图6 可知,气体体积流量从40 mL/min 增加到120 mL/min,多粘菌素E 的回收率从42.7% 增加至82.5%,多粘菌素E 的富集比从5.98 下降至3.66。在通气后,发酵液中产生大量气泡,而多粘菌素E 吸附在气液界面,在浮力的作用下,这些吸附着多粘菌素E的气泡不断聚集上升,在液相表面形成泡沫,而泡沫中的各个气泡以多面体形式相互堆叠,每个气泡的接合处有着很薄的液体薄膜,这层薄膜和气泡中含有液体,这些液体通常被称为普朗特边界层,这些液体会向着气泡交界处的压力最低点,即普朗特边界层的交界处流动,使平面液膜变薄。当气体体积流量逐渐增大,会使气泡在泡沫分离塔的时间变短,泡沫排液时间变短,普朗特边界层中的液体流失减少,气泡间的夹带液体增多[24]。且气体体积流量的增大,产生了更多的气泡,提供了更多的气液界面,增大了多粘菌素E 的吸附面积。故增大气体体积流量会增加泡沫中持液率,即回收率增大。气体体积流量越大,消泡液的体积增大,消泡液中多粘菌素E 浓度相对减小,富集比减小,回收率增大。气体体积流量越小,泡沫的停留时间越长,小气泡不断破碎形成大气泡,气液界面减少,排液时间变长,持液率减小,消泡液中多粘菌素E 浓度变大,富集比变大,回收率减小。当气体体积流量为80 mL/min时,富集比为4.77,回收率为77.1%。进一步提高气体体积流量,回收率增加变缓,而富集比仍然下降较快,故选择气体体积流量为80 mL/min 进行泡沫分离。

2.7 重复分批发酵耦合泡沫分离对多粘菌素E 细胞干重和效价的影响

重复分批发酵耦合泡沫分离对多粘菌素E 细胞干重的影响见图7。

图7 重复分批发酵耦合泡沫分离对多粘菌素E 细胞干重的影响Fig.7 Effect of repeated batch fermentation coupled with foam fractionation on the dry weight of polymyxin E cells

由图7 可知,在耦合组和对照组的细胞在重复分批发酵过程中每批次的生长趋势相同,但耦合组细胞干重大于对照组。这是因为耦合组将泡沫分离残液泵回了发酵罐中,残液中含有一定量的多粘类芽孢杆菌,使耦合组中多粘类芽孢杆菌含量大于对照组,使其更能充分利用新加入的新鲜培养基,进行细胞传代。发酵批次在第4 次时细胞干重达到最高,细胞干重为11.21 g/L。比对照组的细胞干重提高了16.4%。第4 批次后细胞干重开始下降,在第6 批次细胞干重大幅降低,这是因为在多次重复培养后,培养基中一些具有毒性的产物积聚,使细菌生长受到影响或产生表型变异,细菌无法一直保持快速增殖状态,随着细胞干重的逐渐降低,在发酵的6 批次后,已不适于再次进行置换发酵。

重复分批发酵耦合泡沫分离对多粘菌素E 效价的影响见图8。

图8 重复分批发酵耦合泡沫分离对多粘菌素E 效价的影响Fig.8 Effect of repeated batch fermentation coupled with foam fractionation on the titer of polymyxin E

由图8 可知,耦合组置换后发酵液中的多粘菌素E 效价均高于对照组,在产量最高的第4 批次,耦合组的多粘菌素E 效价为28 034.4 U/mL,与对照组(21 768.8 U/mL)相比提高了28.8%。这是因为耦合组中的细胞含量高于对照组,处于分泌期的细胞含量较多,且更换的培养基相较于对照组较少,细胞更易适应新培养环境,减少因环境改变而发生的细胞表型变异。在第6 批次时,多粘菌素E 产量大大减少甚至远低于第1 次发酵,是因为细胞含量减少,且部分细胞在多次传代中生产活性降低。发酵罐内衰老菌体积累,芽孢逐渐增加,pH 值开始快速升高,不易控制,环境逐渐不利于产物合成。综上,重复分批发酵在第6 批次时细胞干重和多粘菌素E 效价均大大降低,较对照组分别减少了7.5%和9.1%,在第6 批次后终止发酵。

6 个批次的对照组发酵液、耦合组发酵液和消泡液中多粘菌素E 效价对比见图9。耦合组泡沫分离的富集比和回收率见表2。

表2 耦合组泡沫分离的富集比和回收率Table 2 Enrichment ratio and recovery rate of foam fractionation in coupling group

图9 耦合组、对照组和消泡液中多粘菌素E 效价Fig.9 Titer of polymyxin E in coupling group,control group,and defoamer

由图9 可知,在产量最高的第4 批次对照组中的多粘菌素E 效价为21 768.8 U/mL,耦合组中多粘菌素E效价为28 034.4 U/mL,消泡液中多粘菌素E 效价为133 706.1 U/mL。由表2 可知,在第4 批次多粘菌素E的富集比为4.77,回收率为82.5%。第1、2 批次与第6 批次之间,第4 批次与第5 批次之间不存在显著差异,其余批次间均存在显著差异,不同批次富集比较为接近,在第5 批次达到最高值。不同批次回收率较为接近,其中第1、2 批次与第6 批次之间无显著差异,第3 批次与第4 批次之间差异显著(P<0.05),回收率在第4 批次达到最高。重复分批发酵耦合泡沫分离不仅提高了多粘菌素E 的产量还对多粘菌素E 进行了初步浓缩,有利于多粘菌素E 的分离利用。

3 结论

本文开发了重复分批发酵与泡沫分离相结合生产多粘菌素E 的工艺,并考察了吐温80 的加入对多粘菌素E 效价和细胞干重的影响。对操作参数进行优化,试验结果表明,发酵液最适置换比例为70%,置换时间分别为初次发酵的第36 小时和置换后发酵的第12 小时,置换后发酵时间缩短为初次发酵的三分之一。吐温80 的最适添加量为0.15%,添加时间分别为初次发酵的第24 小时和置换后发酵的第6 小时,多粘菌素E效价为21 245.3 U/mL,较对照组(19 123.1 U/mL)提高了11%。泡沫分离的最适气体体积流量为80 mL/min。将重复分批发酵与泡沫分离耦合在最佳条件下,可发酵6 个批次,多粘菌素E 效价分别为19 397.43、21 599.1、25 446.1、28 034.4、20 449.2、17 638.0 U/mL,均高于对照组,在耦合过程中富集比和回收率分别保持在4.7 和80%左右。结果表明,重复分批发酵与泡沫分离相结合生产多粘菌素E,既提高了产率又达到了多粘菌素E 的浓缩分离。重复分批发酵与泡沫分离相结合生产多粘菌素E 有利于长期生产性能的提高,对多粘菌素E 的工业化生产具有重要意义。

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