果酒生产中甲醇控制技术的研究进展

彭寅啸，俸斌，黄智，杭方学，李凯，牛德宝，*

（1.广西大学轻工与食品工程学院,广西南宁 530004；2.广西大学甘蔗与制糖产业学院,广西南宁 530004；3.广西广业贵糖糖业集团有限公司,广西贵港 537100）

以水果或水果汁液为原料,通过微生物（如酿酒酵母）发酵得到的产品被称为果酒[1]；酒精浓度按体积计算一般在1.2%～14%[2]。果酒是传统的酒精饮料,其中最为盛行的是葡萄酒[3-5]。果酒具有很高的功能价值,如促进身体新陈代谢、调整胆固醇水平、促进人体血液循环、延缓衰老等,同时因其具有果香浓郁、外观清亮、口感独特清新、营养丰富等优点,深受新时代广大消费者的喜爱[6-7]。

甲醇是果酒酿造中产生的一种有害化学物质,严重威胁着消费者的身体健康。摄入过量的甲醇会导致受害者出现多种症状,包括意识丧失、呼吸困难、视力模糊甚至失明、腹痛、恶心、腹泻和呕吐等,严重的还会危及生命[8]。甲醇中毒最常见的原因是饮用甲醇超标的酒精饮料,甲醇在人体中被迅速吸收和扩散,其毒性作用在初次摄入后的12～24 h 即可发生[9-10]。受害者通常错误的认为是摄入了过多的乙醇,而没有及时就诊,导致中毒进一步加剧。甲醇在人体内大部分通过肝脏代谢为甲酸或甲酸盐而清除,只有2%～5% 经肾脏排泄[11]。成年人每日安全耐受甲醇的剂量为2 g,毒性剂量为8 g[12]。可见,即使少量的甲醇摄入也会对人体造成损害。因此,严格控制果酒中甲醇的含量对消费者的健康有着重要意义。

1 果酒中甲醇产生的过程及机理

1.1 果胶与内源果胶酶酶解

果胶是果酒中甲醇的主要前体物质,它是一种普遍存在于高等植物细胞壁的多糖[13-14]。果胶中约70%的成分为半乳糖醛酸,其相互连接形成半乳糖醛酸链[13]（见图1）。果胶酯酶可以使半乳糖醛酸脱酯产生甲醇与果胶酸[15-16]。果胶酯酶广泛分布于高等植物中,它们在一些水果的自然成熟过程中参与果胶的修饰[17]。果胶的酶促降解反应发生在果酒酿造的各个阶段:在发酵之前[18],原料汁液中的内源果胶酯酶开始降解果胶,人工添加的商业果胶酶则会促进反应的发生；发酵过程中,微生物产生的果胶酶也会进一步加快该反应的进行[19]。几乎所有的酒精饮料都含有甲醇,其中葡萄酒和蒸馏酒中甲醇的含量相对较高,啤酒和谷物酒中的甲醇含量则非常少[20-21]。

图1 半乳糖醛酸链Fig.1 Galacturonic acid chain

1.2 微生物与甘氨酸途径

在传统的发酵酒精饮料中,部分果胶酯酶是由微生物在发酵过程中产生的。包括果胶酶在内的植物细胞壁降解酶在病原体、腐生细菌和真菌中普遍存在[9]。另有研究报道,在酿酒过程中,微生物也可利用甘氨酸生成一定量的甲醇[22]。张香等[23]认为这是在酒精发酵时,酵母通过脱氨脱羧酶分解甘氨酸时生成了甲醇,或酵母通过甘氨酸裂解酶分解甘氨酸时生成了甲胺并进一步与亚硝酸反应生成甲醇。Liang 等[24]的研究表明甘蔗烈酒里的甲醇含量随着甘氨酸含量的增加而增加,甘氨酸转化为甲醇的转化率为24.56%。

2 果酒中甲醇产生的影响因素

2.1 发酵温度

发酵温度会影响成品酒中甲醇的含量,在适宜酵母生长的温度范围内,甲醇含量随着温度的升高而增加。例如,张香[25]的研究中发现,主发酵温度为25 ℃的柑橘酒相比于主发酵温度10 ℃的柑橘酒中甲醇质量浓度要高出40 mg/L。此外,有关香蕉酒[26]和刺葡萄酒[27]的研究结果均表明在适宜酵母菌生长的温度范围内,甲醇的含量随温度的升高呈现上升的趋势。相比于26 ℃,在30 ℃发酵的刺葡萄酒甲醇质量浓度增长了约100 mg/L。有研究者认为,这是因为温度适度升高,酵母菌以及相关酶的活性都有所提高,有利于果胶的分解,从而产生更多的甲醇[28]。

2.2 酿酒酵母的种属

发酵过程中的微生物包括酵母也会对甲醇的含量产生影响,这些微生物会在发酵过程中通过一些复杂的代谢途径持续产生甲醇。例如Joshi 等[29]分别使用4 种酵母（来自美国加州戴维斯大学分校,编码分别为UCD 595、UCD 522、UCD 505 和W）进行苹果酒发酵研究,其中酿酒酵母的局部分离株——W 菌株发酵的苹果酒相较于UCD595 菌株甲醇含量高出23%。蒋成等[30]分别使用5 种商业酵母（菌株KD、D254、EC1118、X16、BO213）进行无花果酒发酵研究,其中菌株KD 发酵的甲醇含量显著低于其它菌株（p<0.05）,仅为297.19 mg/L,菌株D254 发酵的无花果酒中甲醇含量也与其它菌株存在显著差异,达390.54 mg/L（p<0.05）,而其他3 组样品甲醇质量浓度均超过500 mg/L。类似地,董文娟[31]分别使用5 种酿酒酵母（SIHA、LALVIN 71B、LALVIN K1、LALVIN R-HST 和贝酵母LALVIN EC1118）进行了冰苹果酒和山楂酒的发酵研究,其中冰苹果酒有两组样品甲醇含量与其他样品存在显著差异,山楂酒5 组样品彼此均存在显著差异。Satora 等[32]在研究中也发现了这种酵母种属带来的差异,他们认为这是由于不同酵母产生的果胶酯酶的活性不同导致的。

2.3 原料成分

包括果胶在内的原料成分对果酒中甲醇的含量也会产生影响。多项关于果胶的研究[33-35]表明,各类水果的果胶含量及酯化程度存在显著差异。例如,双子叶植物中的果胶含量相对较高；番茄类水果表皮中果胶的酯化程度相对较高等。很多研究者[36-37]认为酿酒原料的果胶含量和果胶酯化程度直接影响着果酒中的甲醇含量。Zhang 等[38]使用不同的原料（李子压榨汁与李子带渣混合汁）进行对比试验,发现在相同发酵条件下压榨汁组的甲醇含量远低于带渣汁组,3 个品种（来自纽约手指湖水果种植区的Geneva Mirabelle、French Damson和Pozegaca）压榨汁组甲醇均比带渣汁组低15%以上。

2.4 果胶酶

原料中果胶酶的活性也会影响果酒中甲醇的含量。果胶酯酶作用于原料中的果胶,引发酶解反应,导致半乳糖醛酸脱酯,从而生成甲醇[23]。Han 等[39]研究了3 种苹果酒（添加氯化钙的并接种0.2 g/L 酵母的样品、只接种0.2 g/L 酵母的样品和自发酵样品）中甲醇含量和果胶酶活性的关系。研究结果揭示,这3 组样品的甲醇含量与发酵过程中的果胶酯酶活性和果胶裂解酶活性呈正相关。此外,有研究指出葡萄酒中的大部分甲醇是由葡萄原料中的内源性果胶酶分解葡萄果胶产生的[17]。Rollero 等[40]在葡萄酒的研究中发现,添加了商业果胶酶（包括半乳糖醛酸酶、果胶酯酶和果胶裂解酶）的样品中甲醇含量是未添加商业果胶酶的样品的1.5 倍。这表明商业果胶酶的添加也影响着果酒中的甲醇含量。

3 传统甲醇控制方法

许多研究报道了利用传统手段降低果酒中甲醇含量的方法（见表1）,主要包括热处理、酿酒酵母改良、外源物质添加以及蒸馏4 个类型。尽管传统方法在技术层面相对成熟,但仍存在损害酒品质、应用范围受限等局限性。

表1 果酒中甲醇的传统控制方法Table 1 Traditional control method of methanol in fruit wine

3.1 热处理

在果酒生产过程中,除了通过调整温度以简单控制果酒发酵外,加热处理也是一种传统且常见的甲醇控制方法。主要方法是在酿造前,对酿造原料进行加热处理,例如浸沸、蒸煮和巴氏消毒等。通过加热使果胶分解,不再酶解为甲醇,同时使原料中含有的果胶酶失活从而降低果胶酶对果胶的酶解作用,进而降低成品中的甲醇含量[41]。

吕佳玮等[42]在酿造柿子酒前对原料进行蒸煮处理,研究结果证明这种方式降低了成品中30%左右的甲醇。李桂林[41]对红枣进行10～25 min 的浸沸处理后,发酵得到的红枣白兰地中甲醇质量浓度显著降低,相比对照组下降了0.2 g/L。此外,经过巴氏杀菌后的苹果蒸馏酒样品中甲醇质量浓度为217 mg/100 mL,而未经巴氏杀菌处理的对照组中为400 mg/100 mL[43]。超声作用对于酶的失活和甲醇的作用不明显,但热超声的效果显著[44]。热超声的降甲醇效果明显高于单纯热处理,在50 ℃和60 ℃的温度下超声处理原料果渣5～15 min,李子酒中甲醇质量浓度分别下降了15%和22%。然而,该方法处理会损害李子酒的风味。热微波可以有效降低甲醇的含量,在85 ℃、1 min 处理条件下,甲醇降低了60%。同时微波在高温下所需的处理时间较短,对风味的损害远低于热处理和热超声[44]。

然而,酿酒原料的加热处理存在较大弊端,可能导致原料中原有的营养物质（比如多酚、维生素等热敏成分）受到破坏,同时影响产品的风味和感官色泽[45-47],极大降低果酒的品质。此外,酿酒原料自带的果胶酶受热失活会使果胶分解不足,影响原料的出汁率。尽管热超声在降低甲醇含量方面优于传统热处理方法,但仍需一定程度的加热处理,无法避免对果酒品质产生不良影响。热微波能够有效减少甲醇含量,但其大规模商业应用还不成熟,需要制定规范化的标准以及验证其安全性[48]。

3.2 酿酒酵母的改良

发酵过程中的微生物包括酵母会对甲醇的含量产生一定影响,这些微生物会在发酵过程中持续产生甲醇。有学者认为对酵母进行诱变选育,培养出产甲醇能力更弱的酵母突变体也是一种有效减少果酒甲醇含量的方法。例如,武晓娜[49]用紫外辐照（ultraviolet,UV）和硫酸二乙酯（diethyl sulfate,DES）对酵母进行诱变选育,获得最佳变异菌株,其能使甘蔗烈酒中甲醇含量相较于对照组降低25% 以上。UV 与DES 结合诱变选育后,培育出的低甲醇产量（97.3 mg/L）的突变型酿酒酵母DU9,与仅使用DES 处理的酿酒酵母D4 相比,其生产的甘蔗烈酒甲醇含量降低12.3%；相较于未进行任何处理的菌株,降低幅度达27.8%。这表明,紫外诱变与DES 结合是培育出具有较低甲醇生成量的酿酒酵母突变体的有效方法。

另有研究证明使用常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma,ARTP）射流在培育低甲醇产量的酵母菌属突变体中表现出较强作用[50]。在该研究中,突变率达到了47.4%,正向突变率为26.3%。研究结果显示,突变体酿酒酵母S12 的产甲醇能力最低,与野生型菌株相比,S12 发酵样品中的甲醇含量降低了72.54%。

值得注意的是,上述诱变方法虽然有效培育出了甲醇生成量更低的酵母突变体,但这些研究中多以单一的甲醇和乙醇含量为检测指标,未有香气以及风味物质的检测与感官评定的报告对比。经过诱变培育后的酵母虽然降低了甲醇的产量,但其发酵能力和最终成品的品质能否得到保证缺乏进一步的数据支撑。

3.3 外源物质的添加

传统的控制果酒甲醇的方法多为抑制果胶的酶解反应,添加外源物质抑制甲醇生成也是一种控制策略。在果酒发酵初期添加膨润土能有效降低甲醇含量。Han 等[37]研究表明在10 ℃和25 ℃发酵条件下,无论是鲜榨苹果混合汁还是静置处理得到的苹果清汁,在发酵前添加膨润土处理都能有效降低甲醇含量,能使甲醇含量下降30%左右,其中对鲜榨苹果混合汁的影响更为显著。膨润土作为良好的蛋白质吸附剂,有很强的吸附作用,作者推测其对果胶酯酶和果胶都有吸附作用,从而影响酶解反应来降低甲醇的产生。研究中膨润土处理组的果胶酯酶活性和果胶含量均有下降,其中果胶酯酶活性降低了50%以上,果胶含量下降了30% 左右。Miljić 等[44]在发酵前的李子果渣中加入了少量的单宁,在20 g/100 kg 和30 g/100 kg 的单宁用量下,果酒中甲醇含量下降了8%左右,作者认为更大剂量的添加会有更好的效果,但大剂量单宁会对果酒的风味造成不良影响,影响果酒品质。

Hou 等[51]在葡萄酒酿造过程中添加没食子酸和香豆酸来减少酒中甲醇含量。结果表明,添加没食子酸或香豆酸的样品中,甲醇含量显著低于对照组,下降了约45%。这表明在2 mg/L 水平下添加没食子酸或香豆酸会减少酒中甲醇的含量。添加果胶酶解反应生成物也被认为是一种潜在的降甲醇手段,Miljić 等[44]在梅子酒中添加了15 g/kg 果胶酸,使甲醇含量降低了10%。Wu 等[52]在杨桃酒中添加了爱玉子（FicusɑwɑkeosɑngMakino）果胶酯酶抑制剂（pectinesterase inhibitor,PEI）用于减少甲醇的产生,其中未经处理的空白组甲醇含量为256 mL/1 000 L,而添加了PEI 的样品则仅为58 mL/1 000 L。此外,有研究报道一种提取自猕猴桃中的果胶酯酶抑制剂,对多种植物（如橙子、苹果、番茄、猕猴桃、柿子）果胶酯酶具有特异性抑制作用,但未见该果胶酯酶抑制剂在果酒中应用的相关研究[53]。

果胶酸和膨润土在果渣发酵酒中对甲醇含量的作用效果不够理想,甲醇含量仅下降了15% 左右,虽然膨润土在苹果汁发酵酒中效果较好,但很多果酒更适用于带渣发酵,使用膨润土难以达到生产要求。而PEI 在研究中的表现更为优异,在果酒甲醇控制方面有着良好的应用潜力。还有许多抑制果胶酯酶的物质未有在果酒酿造中的研究,使用外源添加物质来调控甲醇还需要做更多的探索,寻找更具效率且仍能保证食用安全性的物质。

3.4 蒸馏

除了抑制果胶酶解反应以外,许多研究者采用蒸馏手段除去果酒中已经存在的甲醇。在整个蒸馏过程中,馏出物被分离成3 个馏分:头酒、中酒和尾酒。蒸馏会把一些不利于成品品质的化学物分离至头酒中,然后将其弃掉,从而保留最有价值的中酒部分（也称为中心馏分）,但甲醇只能被部分分离到头酒中,会同时存在于头酒和中酒中[54]。在整个蒸馏过程中,各馏分中甲醇占比一直保持稳定,没有显著下降[55]。因此,初次蒸馏很难除去酒中的甲醇,进行二次蒸馏才能有效去除这一有害物质[36,54]。Zhang 等[56]对樱桃酒的研究结果也证实了二次蒸馏能更有效降低甲醇含量。一次蒸馏后甲醇质量浓度为1.57 g/L,二次蒸馏后下降为1.39 g/L。

Carvallo 等[57]通过建立准确有效的模型来研究甲醇蒸馏技术,对沸腾温度、乙醇含量和馏出物流速的模拟结果误差均小于2%。该模型可以使用计算机进行动态优化,用以模拟不同操作参数对甲醇含量的影响,从而最大限度地减少甲醇含量,保留乙醇和香气。一些模型研究也揭示了在蒸馏中对果酒甲醇含量影响较高的操作参数,初始甲醇含量为2.3 g/L 的样品在不同的操作参数下,甲醇浓度下降幅度为12.8% 到22.7%不等[58]。模型中不同操作因素对甲醇含量的影响存在差异,这种差异与在梨酒[59]和猕猴桃酒[60]蒸馏研究中观察到的一致。分析结果表明,头酒中酒分离所需的时间和头酒阶段结束时的降温速度两项参数对甲醇浓度的影响最大。除了蒸馏清除酒中的甲醇外,对某些甲醇含量高的果酒原料汁进行蒸馏也能一定程度上降低果酒中的甲醇。赵岩[61]使用分子蒸馏法实现了红枣原料汁中82%的甲醇清除率。

与前面的控制方法相比,蒸馏去除甲醇效果并不理想,部分研究显示一次蒸馏后甲醇含量几乎不变,相对甲醇含量甚至有所升高。即使调整蒸馏工艺后甲醇下降的幅度也非常有限[54-56]。而二次蒸馏操作要求较高,成本也高,对于实际生产来说应用困难。同时,由于蒸馏会改变酒类的风味香气,因此并非所有类型的果酒都适合蒸馏,尤其是低醇果酒和一些甜果酒并不适用于蒸馏。这些特点决定了蒸馏方法只适应于那些本身甲醇含量较少的蒸馏型果酒。

3.5 其他传统控制技术

除热处理、酿酒酵母改良、外源物质添加以及蒸馏4 类较为常见的方法外,研究者们也探究了一些其他方法用于控制最终产品中甲醇的含量,例如,在葡萄酒酿造过程中,选择木制的容器可以减少成品中一定的甲醇。陈同强等[62]对比了不同发酵容器（塑料、木制、玻璃、陶瓷）对葡萄酒中甲醇含量的影响,其中木制容器酿造的葡萄酒中甲醇含量最少,推测可能与木材对甲醇有一定吸附作用相关,但去除甲醇效果不明显也不稳定。

此外,陈酿作为常见的改善果酒成分的手段,往往也能降低果酒中甲醇的含量,陈酿苹果酒的研究结果[63]表明,在陈酿初期6 个月内,甲醇含量呈现小幅度上升趋势,随后大幅度下降。陈酿1 年后,所有样品中的甲醇浓度趋于稳定。陈酿导致甲醇含量减少的原因尚不明确,可能是甲醇的蒸发和吸附导致的,也可能是酒液在成熟过程中发生的其他反应所导致的,例如甲醇氧化成甲醛、甲醇的酯化、缩醛转化。陈酿虽然能实现甲醇含量的下降,但其处理周期长,不利于实际生产应用。

4 新兴控制技术

传统方法主要是通过加热和添加外源物质两种手段来抑制果胶酶解反应,从而减少果酒中甲醇的含量。但随着新兴非热加工技术的出现,一些具备降解果胶能力的新兴物理场技术有望应用在果酒甲醇含量的控制上。除了直接降解果胶,运用非热技术灭活果胶酶在理论上也是甲醇控制的一种有效途径。这些新兴技术（见表2）在果酒甲醇含量控制的应用上潜力巨大。

表2 果酒甲醇的新兴控制技术Table 2 New technology to control methanol content in fruit wine

5 结论与展望

随着果酒市场的扩大与发展,越来越多的学者开始关注和研究果酒中甲醇含量的控制问题。一方面,传统方法以发酵温度、酿酒酵母的种属、原料成分和果胶酶4 个果酒中甲醇含量影响因素为研究基础,发展出了热处理、酿酒酵母的改良、外源物质的添加以及蒸馏4 类主流的果酒甲醇控制技术,但也仍存在损害酒品质、应用范围受限等局限性。另一方面,超声波、脉冲电场、超高压等非热加工技术在果胶降解和果胶酶灭活上的优异效果使其在果酒甲醇控制上表现出了巨大的应用潜力,但在生产上的应用还需要进一步的探索。对果酒品质损害更小、效果更显著、应用范围更广的果酒甲醇控制技术有待成为未来果酒研究的重点,这将为果酒行业的发展提供有力的技术支持。