邹钰珠,汤尧
(天津科技大学食品科学与工程学院/天津科技大学省部共建食品营养与安全国家重点实验室,天津 300457)
藜麦中富含蛋白质、淀粉、矿物质等基本营养成分,同时含有大量酚类物质,是唯一一种单体植物即可满足人体基本营养需求的食物,具有良好的应用前景。我国藜麦的种植面积在非原产地国家中排名第二位[1]。藜麦中的酚类物质可以消除由自由基引起的氧化应激现象,从而预防与氧化应激相关的疾病,如高血压、冠心病、动脉粥样硬化等[2-3]。越来越多的体内和体外试验结果表明,来自藜麦的植物化学物质具有许多潜在的健康益处,合理膳食获取酚类物质对于人们保持正常的抗氧化功能、减缓衰老、抗糖尿病和抗阿尔茨海默氏症有重要作用[4-6]。
以精制米面为主的饮食习惯不利于人们的健康。全民膳食结构的改变,推进全谷物饮食,对提高健康和绿色低碳等方面具有积极作用[7]。全谷物中存在膳食纤维,使得全谷物产品通常表现出体积减小、硬度增大、颜色深、口感粗糙和缺乏弹性,这极大地限制了全谷物产品的工业开发和应用[8]。开发藜麦馒头,有利于提升人们的膳食营养,保持人们的健康体质,也为相关全谷物食品的加工技术的研究提供思路。
目前由于藜麦、青稞等全谷物制品存在适口性差的问题,是全谷物产业发展的重大瓶颈[9]。为改进全谷物的风味和适口性,采用预熟化处理能有效改善食物的营养品质和食用品质,但其耗能高、耗时长、易使产品产生异变;采用挤压膨化技术,产品口感好,加工成本低,但在挤压膨化过程中会发生大量复杂变化;采用萌发技术,初期的藜麦多酚、黄酮等生物活性物质增加,但时间过长或较短都会产生异味,影响产品市场接受度[10]。采用酶酵解可更多保留全谷物营养,有效改善谷物适口性,试验发现酶制剂可以改善馒头内部结构,使其富有弹性,粗糙感减少,气孔疏松,使得藜麦馒头更易被大众接受;同时酶制剂可以使藜麦在一定程度上水解释放出酚类物质,提高抗氧化活性[11-13]。谷俊华等[14]研究发现木瓜蛋白酶可以水解藜麦蛋白使其暴露出更多抗氧化活性基团,提高藜麦抗氧化活性。Tang 等[12]研究发现果胶酶可以效释放酚类物质。Liu等[15]发现利用淀粉酶和木聚糖酶对面团的稳定性和延展性有改良效果。
本研究选用常用于烘焙中的4 种酶制剂(木聚糖酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、真菌淀粉酶),在保证藜麦馒头的营养价值和特殊香味的基础上,改善其弹性弱、延展性差、结构粗糙等问题,并通过测定藜麦馒头中游离多酚、结合多酚、游离黄酮和结合黄酮的含量以及DPPH 自由基清除能力和铁离子还原能力(ferric ion reducing antioxidant power,FRAP),探究酶制剂对藜麦酚类物质及抗氧化能力的影响,以期为我国全麦产品工业化生产提供参考,推动我国全谷物食品产业的发展。
藜麦:产自青海;面筋粉(糕点预拌粉):新乡良润全谷物食品有限公司;安琪高活性干酵母粉、木聚糖酶(XYL200、29 000 U/g)、真菌酵母(FAM100、55 000 U/g)、木瓜蛋白酶(PA-2、50 000 U/g):安琪酵母股份有限公司;果胶酶(食品级、100 000 U/g):山东隆科特酶制剂有限公司;芦丁标准品、甲醇、冰醋酸、氢氧化钠、盐酸、乙酸乙酯、碳酸钠、亚硝酸钠、六水合三氯化铝、福林酚、没食子酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine,TPTZ):国药集团化学试剂有限公司。除特殊标记外其它试剂均为分析纯。
HMJ-A50N1 型和面机:小熊电器股份有限公司;FLT-ZG 型304 不锈钢蒸锅:深圳澜邦酒业有限公司;SHA-B 型水浴恒温振荡器:常州市天竟实验仪器厂;DL-3021HR 型医用离心机:安徽中科都菱商用电器股份有限公司;Synergy-HTX 型多功能酶标仪:美国伯腾仪器有限公司;SB-4200DT 型超声清洗机:宁波新芝生物科技有限公司;TA.XT Plus 质构仪:美国博勒飞公司;LGJ-10N/A 型冷冻干燥机:北京亚星仪科科技发展有限公司;1000C 多功能粉碎机:永康市红太阳机电有限公司。
1.3.1 馒头的制作
将藜麦种子用去离子水冲洗3 次,用纸将表面水分吸干,置于阴凉通风处12 h。用粉碎机将洗后的藜麦种子粉碎成粉末过80 目筛网,得到藜麦粉。
称取120 g 藜麦粉和40 g 面筋粉混合均匀,加入1.0%(质量分数)用37 ℃去离子水活化后的酵母水溶液,添加酶制剂,用适量水溶解后加入面粉中,随后边搅拌边加入适量水,整个制作过程共加入120 g 水。使用和面机和面15 min,醒发1 h。得到面团均匀分成3 份,手工搓圆,塑性后,再在室温下醒发30 min,放于蒸锅中蒸20 min(冒气起计时)后取出,放于室温下冷却1 h 后,进行相关指标测定。
1.3.2 馒头样品质构检测
采用质构仪进行全质构分析(texture profile analysis,TPA)测定。取放于室温冷却1 h 后的馒头,去除馒头表皮,用专用切刀将馒头切成20 mm×20 mm×30 mm的长方体。采用ϕ100 mm 的圆柱形平底探头测定,仪器参数设定参考Kou 等[16]的方法并略作修改:数据采集速率200 pps,测前速率3 mm/s,测中速率为1 mm/s,测后速率3 mm/s,触发力设置为“Auto”,引发模式为应变,压缩速度1 mm/s,压缩程度60%。
1.3.3 馒头酚类物质提取
将馒头切成0.3 mm×0.3 mm×0.3 mm 方粒,将方粒用液氮预冷后,再放入冷冻干燥机中,脱水12 h 得到样品,用研钵粉碎,得到粉末放于-40 ℃冰箱中备用。
游离态和结合态酚类物质的提取参考Tang 等[12]的方法并略作修改。准确称取1 g 藜麦馒头粉放入10 mL 的塑料离心管中,加入5 mL 70%甲醇(含1%冰乙酸),进行超声提取30 min(温度25 ℃,功率40 kW)。在室温下用水浴恒温振荡器在暗处提取2 h,6 000×g离心20 min。残渣再提取1 次,合并上清液作为粗提物。
上述残渣(1.0 g)用12.5 mL 2 mol/L 氢氧化钠溶液在室温下水解4 h,加入6 mol/L 盐酸酸化至pH 值为2,然后6 000×g离心5 min。上清液用5 mL 乙酸乙酯萃取6 次,合并萃取液后用N2在黑暗中吹干,然后用2 mL 70%甲醇溶液中复溶,得到结合酚。
1.3.4 藜麦馒头酚类物质含量测定
1.3.4.1 总多酚含量测定
参考Tang 等[12]的方法采用Folin-Ciocalteu 法测定不同标准品总酚含量(total phenol contents,TPC),稍作修改。将25µL 样品或标品(250、125、62.5、31.25、15.626µg/mL)加入至96 孔板,然后与125µL 0.2 mol/L福林-环钙酸盐试剂混合。反应10 min 后,加入125µL 7.5% Na2CO3溶液。室温孵育30 min 后,在765 nm 处读取吸光度。以没食子酸的浓度(µg/mL)为横坐标(x),吸光度为纵坐标(y),绘制标准曲线。标准曲线回归方程为y=0.006 3x+0.207 5,R2=0.998 5,线性范围15~250µg/mL。根据线性回归方程计算样品中游离多酚和结合多酚含量,两项之和为总多酚含量。
1.3.4.2 总黄酮含量测定
参照Gu 等[17]的方法,稍作修改。将25µL 样品或标品(500、375、250、187.5、125、61.25、31.625µg/mL)加入至96 孔板,向提取液中加入25µL 10% NaNO2溶液反应6 min,随后加入20µL 5% AlCl3·6H20 反应5 min,然后加入30µL 1 mol/L NaOH 溶液和75µL 蒸馏水,在510 nm 处测定吸光度。以芦丁的质量浓度(µg/mL)为横坐标(x),吸光度为纵坐标(y),绘制标准曲线。芦丁线性回归方程为y= 0.000 7x+ 0.039,R2=0.998 0。线性范围31~500µg/mL。
1.3.5 酚类物质抗氧化活性测定
1.3.5.1 DPPH 自由基能力测定
采用Tang 等[12]的方法,稍作修改,测定DPPH 自由基清除活性。将25µL 样品或标品(62.5、125、250、500、750、1 000 µmol/L)加入到200µL DPPH 溶液(350µmol/L 甲醇溶液)中。将混合物在室温黑暗中反应4 h。以200µL DPPH 溶液(350µmol/L)为空白,在517 nm 处测定吸光度。DPPH 自由基清除活性表示为每克干马铃薯的Trolox 当量(trolox equivalent,TE)(µmol TE/g)(y=-0.004 8x+2.115 7,R2=0.999 0)。
1.3.5.2 FRAP 铁离子还原能力测定
采用Tang 等[12]等的方法,稍作修改,测定FRAP。FRAP 试剂由0.3 mol/L 醋酸缓冲液(pH3.6)与10 mmol/L TPTZ 在40 mmol/L 盐酸和20 mmol/L FeCl3·6H2O 溶液中以10∶1∶1(体积比)混合制备。将10µL 样品或标品(62.5、125、250、500、750、1 000µmol/L)和新鲜制备的FRAP 试剂(300µL)加入96 孔板中,室温孵育2 h,以300µL FRAP 试剂为空白,在593 nm 处测定吸光度。FRAP 的抗氧化活性以每克干马铃薯的抗坏血酸当量(ascorbic acid equivalents,AAE)(µmol AAE/g)(y=0.001 5x+0.121 8,R2=0.999 5)表示。
采用Excel 2010 对数据进行整理,每组试验设置至少3 个平行,取均值,应用SPSS 26 软件对所有试验数据进行方差分析,P<0.05 表示差异显著。由Excel 2010 版软件作图。
不同酶制剂处理后藜麦馒头的表观状态如图1所示。
图1 不同酶制剂处理后藜麦馒头的表观图Fig.1 Morphological images of quinoa steamed bread treated with different enzyme preparation
由图1 可知,与未经酶制剂处理的藜麦馒头相比,酶制剂处理后藜麦馒头的色泽发生了不同程度的改变,其中木瓜蛋白酶处理的馒头颜色较其他处理更深,酶制剂处理组的馒头内部结构变得更加细腻,表面光滑程度增大,面团更易成型。
食品的感官表现直接影响消费者对食物的接受和喜爱程度,酶制剂的添加对馒头的质构影响如表1所示。
表1 不同酶制剂处理藜麦馒头的质构特征Table 1 Texture characteristics of quinoa steamed bread treated with different enzymes
由表1 可知,果胶酶、木聚糖酶明显提高了藜麦馒头的硬度、弹性、黏聚性、回复性,经真菌淀粉酶处理后的馒头硬度、咀嚼性、弹性和回复性分别增强87%、96%、8% 和23%,李进才等[18]发现真菌淀粉酶可作用于藜麦中的淀粉,使其含量降低,硬度增强,在藜麦中淀粉的含量与硬度和咀嚼性均极显著负相关,与回复性和黏聚性呈显著负相关,与本试验中使用真菌淀粉酶后所得结论一致。木聚糖酶和果胶酶均作用于细胞壁,在馒头质构特性方面的改变具有相似性,但木聚糖酶在弹性、黏聚性、咀嚼性的改善效果较果胶酶更为突出,木聚糖酶在馒头弹性方面增强17%。木瓜蛋白酶作用后的藜麦馒头质构特性各项指标均降低,木瓜蛋白酶主要作用于藜麦中的藜麦蛋白,使得藜麦的硬度和黏聚性降低,这与前人研究结果较为一致[19]。
植物多酚是广泛存在于植物体内的天然次生代谢产物,存在于人类饮食中常见的许多植物源性食品和饮料中[20]。不同酶制剂对馒头中多酚含量的影响如图2 所示。
图2 不同酶制剂处理对藜麦馒头中多酚含量的影响Fig.2 Effects of different enzyme preparations on the content of polyphenols in quinoa steamed bread
由图2 可知,经不同酶处理后,游离多酚、结合多酚、总多酚的含量分别为129.13~343.84、48.51~72.06、177.65~404.63 mg/100 g。与对照组相比,经木瓜蛋白酶处理后总多酚含量提高99.23%,游离多酚的含量增加了162.14%,这可能是由于木瓜蛋白酶作用于蛋白多酚复合体从而释放出游离酚并导致总酚含量增加[21]。李梦瑶等[22]发现藜麦发酵时伴随蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等酶的生成,导致藜麦中蛋白质、纤维素的结构变化从而引起结合多酚的释放。木聚糖酶处理后游离多酚、结合多酚、总多酚含量分别增加5.57%、5.09%、5.40%。结肠中微生物区能够代谢出木聚糖酶,木聚糖酶处理后藜麦馒头释放多酚有利于人体吸收和代谢[23]。果胶酶处理组中结合多酚含量下降约32.67%。真菌淀粉酶、果胶酶处理组与对照组中游离多酚含量无显著性差异(P>0.05)。综上,木瓜蛋白酶能促进藜麦中的酚类物质的释放,木聚糖酶能增加结合多酚含量,真菌淀粉酶处理对藜麦馒头的多酚含量没有显著影响,而果胶酶则会使藜麦馒头中的多酚含量有所损失。
谷物是黄酮的主要膳食来源,是评价食物健康功效的主要指标之一[24-25]。不同酶制剂对馒头中黄酮含量的影响如图3 所示。
图3 不同酶制剂处理对藜麦馒头中黄酮含量的影响Fig.3 Effects of different enzyme preparations on flavonoid content in quinoa steamed bread
由图3 可知,酶制剂对藜麦馒头中黄酮含量的影响存在差异。藜麦馒头经酶加工处理后,总黄酮的含量均有所提高。这可能是由于黄酮在高温及高压条件下极易分解,酶解法条件温和,能够有效促进有效成分溶出。其中,木瓜蛋白酶处理的藜麦馒头游离黄酮、结合黄酮和总黄酮含量分别增加了17.98%、12.50% 和15.50%。木瓜蛋白酶可将蛋白质水解成多肽及氨基酸类,并促进黄酮类化合物等成分的释放[26]。经过木聚糖酶处理的藜麦馒头游离黄酮的含量增加25.00%,但结合黄酮的含量降低14.16%;果胶酶处理后结合黄酮增加15.22%,游离黄酮含量损失4.83%,这可能是由于果胶酶作用于细胞壁间相连的果胶物质,将果胶分解成小分子物质,减少了黄酮向主体溶剂扩散的传质阻力,便于黄酮的浸出[27]。真菌淀粉酶处理对总黄酮、游离黄酮和结合黄酮均无显著性影响(P>0.05)。
2.5.1 酶制剂处理藜麦馒头对多酚提取物的DPPH 自由基清除能力的影响
不同酶制剂处理后藜麦馒头的DPPH 自由基清除能力如图4 所示。
图4 不同酶制剂处理藜麦馒头多酚提取物的DPPH 自由基清除能力Fig.4 DPPH free radical scavenging ability of polyphenol extract from quinoa steamed bread treated with different enzyme preparations
由图4 可知,藜麦馒头中多酚的DPPH 自由基清除能力与游离和总多酚的含量呈正相关。不同酶制剂处理藜麦馒头的DPPH 自由基清除能力存在差异。与对照组相比,木瓜蛋白酶处理后游离多酚、结合多酚和总多酚的DPPH 自由基清除能力分别增强了96.67%、17.90% 和61.60%;但真菌淀粉酶处理后结合多酚DPPH 自由基清除能力降低了23.34%,游离多酚和总多酚与对照组间无显著差异(P>0.05),木聚糖酶和果胶酶处理后DPPH 自由基清除能力与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。果胶酶处理结合多酚占总多酚含量的27.31%,但结合多酚DPPH 自由基的清除能力占总多酚的43.68%,可能是因为藜麦中结合酚类物质DPPH 自由基清除能力优于游离多酚的贡献[28]。
2.5.2 酶制剂处理藜麦馒头对多酚提取物的FRAP 的影响
不同酶制剂处理藜麦馒头的FRAP 如图5 所示。
图5 不同酶制剂处理藜麦馒头多酚提取物的FRAPFig.5 FRAP iron ion reduction capacity of quinoa steamed bread polyphenol extract treated with different enzyme preparations
由图5 可知,与对照组相比,木瓜蛋白酶处理后藜麦馒头中游离多酚FRAP 增强了32.30%,但结合多酚FRAP 减弱了18.93%;经真菌淀粉酶、果胶酶、木聚糖酶处理的藜麦馒头FRAP 与对照组相比无显著差异(P>0.05)。综上所述,木瓜蛋白酶处理藜麦馒头对藜麦馒头FRAP 影响最为显著。因此,木瓜蛋白酶处理能够更好地保留和释放藜麦馒头中的抗氧化活性物质。
本试验采用木聚糖酶、真菌淀粉酶、果胶酶、木瓜蛋白酶处理藜麦馒头,对其质构及抗氧化活性进行测定。结果表明,在质构方面,真菌淀粉酶处理后,馒头硬度、咀嚼性上分别提高87%、96%,而木瓜蛋白酶在硬度上降低30%;在抗氧化活性方面,木瓜蛋白酶处理后游离多酚的含量增加162.14%,游离黄酮增加17.98%,游离态DPPH 自由基清除能力增强96.67%,铁离子还原能力增强32.30%;其他处理差异不明显。因此本研究揭示了不同酶制剂处理后藜麦馒头品质和多酚、黄酮总含量及其抗氧化活性的变化,为藜麦馒头抗氧化、降血糖的深入研究以及相关全谷物产品开发提供理论依据。