超声波协同低温等离子体活化水降解黑木耳中抗生素

蔡瑞，焦睿智，岳田利，高振鹏，袁亚宏，王周利*

（1.西北大学食品科学与工程学院,陕西西安 710069；2.西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西杨凌 712100）

黑木耳肉质细腻、营养丰富,是我国珍贵的药食兼用胶质真菌[1]。作为食用菌中的第二大产业,黑木耳的人工栽培或自然生长已遍布我国20 多个省份。据统计,2022 年我国黑木耳产量超过830 万t 且产业规模仍在不断扩大。近年来兽类抗生素的大量使用已对自然环境造成影响,不同基质中都检测到了抗生素的残留[2]。喹诺酮类抗生素作为常见兽药成分,污染食品后可引起消费者过敏反应、器官损伤、急性中毒等[3],对此,我国农业农村部对相关食品中抗生素有严格的限量标准,如牛奶中恩诺沙星和环丙沙星的限量分别为0.1µg/kg 和100µg/L,蛋制品中两种抗生素的限量为10µg/kg。在木耳栽培中,由于抗生素残留会污染木屑、麸皮等栽培基料,进而逐渐迁移到木耳产品中,因此我国相关标准对食用菌中恩诺沙星、环丙沙星等喹诺酮类抗生素的限量标准为10～500µg/kg[4],故建立木耳中抗生素的有效控制方法非常必要。超声处理具有一定的超声机械效应,超声波的传播使水分子振动,加速分子位移和碰撞速度,对内容物分子结构产生巨大冲击力,破坏内容物的化学键；同样还具有空化效应[5],导致溶液局部出现高温高压环境,使水分子裂解形成·H 和·OH,内容物进入空化泡内,也会使化学结构在高温高压条件下发生热裂解,导致化学键断裂[6]。等离子体是物质继固态、液态和气态之后的第4 种状态,当外加电压达到分子的击穿电压时,分子会发生电离并形成电子、离子、原子和原子团的混合物。低温等离子体放电过程中电子温度很高,但重粒子温度较低,故整个系统仍呈现出低温状态。低温等离子体中的活性组分与水反应,电子从电场中获得能量,通过碰撞将能量转化为分子的内能和动能；获得能量的分子被激发,同时部分分子被电离生成大量的活性粒子,如处于激发态的原子和离子,最终这一系列电子、分子及自由基等形成等离子体活化水[7]。超声波协同低温等离子体活化水,利用超声波对内容物的机械效应及空化效应,协同低温等离子体活化水中的大量活性离子,强化对黑木耳中的抗生素结构破坏及降解效果,目前该种联合方法对于抗生素的降解研究还处于空白。

本研究以超声波降解为核心手段,协同低温等离子体活化水中的活性粒子,重点研究其对黑木耳中恩诺沙星、环丙沙星两种喹诺酮类抗生素的降解效果,通过响应面试验优化超声处理工艺参数,并分析超声协同低温等离子体活化水处理后黑木耳的品质变化,以期为食用菌生产加工过程中抗生素的控制提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、甲酸、乙腈、磷酸（均为色谱纯）:四川西陇科学有限公司；乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、无水硫酸钠、氯化钠（均为分析纯）:广东光华科技股份有限公司；磷酸氢二钠（分析纯）:国药集团化学试剂有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷（ethylenediamine-N-propylsilane silica gel,PSA）（色谱纯）:烟台青云仪器设备有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）-Mcllvaine 缓冲液（pH4.0）:上海源叶生物科技有限公司；黑木耳:产自陕西省商洛市柞水县下梁镇西川村,经检测无环丙沙星和恩诺沙星抗生素残留污染。

1.2 仪器与设备

HN5-150A 型超声波清洗器、XH-D 型漩涡混合器:上海汗诺仪器有限公司；DBD-100A/B 型低温等离子体设备:上海万木春生物工程有限公司；LC-20A 型高效液相色谱仪:日本岛津公司；HC-3018R 型高速冷冻离心机:安徽中科中佳科学仪器有限公司；Y1 升级版破壁机:九阳股份有限公司。

1.3 低温等离子体活化水制备

利用介质阻挡放电低温等离子体设备制备活化水。调节介质阻挡放电设备的参数,在预试验基础上确定输出电压为4 kV,频率为10 kHz。将1 L 无菌去离子水置于低温等离子体设备料斗中,并将介质阻挡放电等离子体设备极板放置于水平面之上,极板与液面的距离为5 mm。开启电源,以外界空气中惰性气体（N2、O2、CO 等）为工作气体,激发产生大量活性粒子,去离子水处理3 min 后得到低温等离子体活化水,随用随制,置于常温（25 ℃）环境下待用[8]。

1.4 单因素试验

黑木耳中抗生素的加标与富集:将干制的黑木耳分别浸泡在不同抗生素浓度（1、2、4、8、16 mg/kg）水溶液中,常温（25 ℃）环境下间隔一定时间取样,经高效液相色谱仪检测处理后样品的初始浓度,使其分别含有0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/kg 的抗生素。将100 mL 低温等离子体活化水加入250 mL 烧杯中并加入5 g 黑木耳,放入超声设备中（超声波洗槽中加入6～8 L 水,保证浸没1/2 高度烧杯）,利用低温等离子体活化水中的高能电子、自由基等活性粒子对黑木耳中的抗生素进行降解,考察抗生素初始浓度（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/kg）、超声功率（240、320、400、480、560 W）、超声频率（25、33、40、59 kHz）、超声时间（20、30、40、50、60 min）、超声温度（20、30、40、50 ℃）对抗生素降解效果的影响。每个样品经处理后,取一定量进行前处理并按色谱条件进行液相色谱分析,评价不同参数对抗生素降解的影响。

1.5 响应面优化试验

表1 三因素三水平的Box-Behnken 设计Table 1 Three-factor and three-level Box-Behnken design

在此基础上,以优化获得的参数为基础,分别采用超声波（去离子水代替活化水）和低温等离子体活化水进行抗生素降解试验,评价不同处理对抗生素的降解效果。抗生素降解率计算公式如下。

T=（A0-Ai）/A0× 100

式中:T为降解率,%；A0为处理前抗生素浓度,mg/kg；Ai为处理后抗生素浓度,mg/kg。

1.6 高效液相色谱检测

标准液制备:准确称取环丙沙星、恩诺沙星2 种抗生素标准品各30 mg,溶于30 mL 乙腈中配制成浓度为1 g/L 的混合标品,避光置于-18 ℃储存备用。

样品制备:将处理后的基质样品用破壁机粉碎并装入洁净的密封袋,标明编号于干燥处保存。

提取:称取1 g 基质样品置于100 mL 离心管中,加5 mL 去离子水浸泡10 min 后加入8 mL EDTAMcllvaine 缓冲液（pH4.0）,涡旋振荡1 min 后加17 mL含有5% 甲酸的乙腈溶液中,提取并涡旋振荡1 min；然后加入2 g NaCl 和3 g 无水Na2SO4盐析除水,迅速摇匀再次涡旋振荡1 min,用高速冷冻离心机在4 ℃、5 000 r/min 下离心5 min,待净化步骤使用。

净化:称取0.15 g PSA,加入0.5 g 无水Na2SO4于10 mL 离心管中,向其中加入上述提取步骤中离心后的试管上清液5 mL,涡旋振荡1 min 使其充分混合。用高速冷冻离心机在4 ℃、5 000 r/min 下离心5 min,再用1 mL 注射器吸取上清液1 mL,过0.22µm 有机相滤膜并装入液相小瓶,于-20 ℃保存,待测[9]。

档案管理是一项动态性的工作，主要体现在两个方面：其一是档案的生成具有动态性的特点，油田档案的组成包括技术资料、日常文件等，经过简单筛选后，大多数都会作为档案进行留存。其二是档案的管理具有动态性的要求，管理人员需要根据油田企业工作需要，定期对这些档案进行销毁、更新或解密等处理。例如，一些档案具有保存时效，这些档案超过保存时效后，就需要按照相关要求销毁。还有一些加密档案，例如专利档案等，也有加密时效，一段时间后需要解密，对外公开。确保档案管理的动态性，对更好地发挥档案价值也有很大帮助。

色谱检测条件:色谱柱为Agilent TC-C18（4.6 mm×150 mm,5µm）；流动相A 为乙腈,流动相B 为0.7%磷酸水溶液；流速0.8 mL/min,等度洗脱（A 相20%,B相80%）；色谱柱柱温30 ℃；进样量20µL。荧光检测器:激发波长280 nm,发射波长450 nm。

1.7 木耳品质评价

总糖含量:参照GB/T 15672—2009《食用菌中总糖含量的测定》[10]；粗蛋白含量:参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[11]；粗脂肪含量:参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》[12]；粗纤维含量:参照GB/T 5009.10—2003《植物类食品中粗纤维的测定》[13]；灰分含量:参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》[14]。测定处理后黑木耳的基础理化指标,评价最优处理条件下该方法对木耳中营养指标的影响。

1.8 数据处理与分析

每次样品检测或理化指标测定均做3 次平行取平均值,响应面试验设计及分析采用Design Expert 8.0,采用SPSS 18 软件对数据进行方差分析及显著性检验（p<0.05）,并使用Origin 2018 软件作图。

2 结果与讨论

2.1 超声波协同低温等离子体活化水单因素试验

超声波协同低温等离子体活化水处理对黑木耳中抗生素降解率的影响如图1 所示。

图1 超声波协同低温等离子体活化水对黑木耳中抗生素降解率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic-assisted low-temperature PAW on degradation of antibiotics in Auricularia auricular

鉴于不同的抗生素限量一般是0.01～0.5 mg/kg,因此本研究按照对应限量的1、2、4、8、16 倍设置5 个浓度梯度,即0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/kg。如图1（a）所示,在抗生素浓度为0.5 mg/kg 时,抗生素的降解效果最好,恩诺沙星与环丙沙星两种喹诺酮类抗生素的降解效果分别可达53.11%和49.91%。随着抗生素初始浓度升高,协同处理对抗生素的降解效果呈现逐渐降低趋势,且不同浓度梯度之间有明显差异。因此,抗生素初始浓度为0.5 mg/kg 效果较佳。如图1（b）所示,随着超声功率增大,恩诺沙星降解率逐渐上升,环丙沙星降解率呈现先增大后减小趋势,在超声功率480 W时对黑木耳中抗生素的降解效果均达到52% 以上。如图1（c）可知,当超声频率为25 kHz 时抗生素降解效果最好,提高超声频率对抗生素的降解有一定的抑制作用。如图1（d）所示,在超声时间20～50 min 时抗生素降解率不断提高,超声时间50～60 min 时降解效果升高不明显,超声时间50 min 时恩诺沙星与环丙沙星的降解率最高可以达到52.31% 和50.11%。如图1（e）所示,在30 ℃时抗生素的降解效果较好,此时恩诺沙星和环丙沙星的降解率为53.66%和52.20%。不同处理参数变化时抗生素降解效果差异较大,这可能与等离子体中活性离子的组成和活性有关。在等离子体放电过程中,等离子体活化水中产生了大量的活性离子,并会显著影响体系的pH 值、氧化还原电位和电导率等指标。比如,在空气放电过程中会产生单态氧、超氧阴离子自由基、氢自由基、羟自由基、一氧化氮自由基等活性物质,这些活性物质相互之间或与周围气体继续发生反应并生成NO、NO2、H2O2、HNO3、O3等次级氧化产物。NO2还会进一步扩散到液体中并生成NO2-、NO3-和过氧亚硝基阴离子等活性物质,这些含氮物质会造成溶液的酸化,显著降低溶液的pH 值。此外,等离子体处理能够显著提高水溶液的氧化还原电位,这主要与活性氧、活性氮等物质作用有关[15-16]。因此,超声波协同低温等离子体活化水处理样品时,超声波的空穴效应及处理参数差异会引起体系中活性离子组成及其活性变化,进而影响体系的pH 值和氧化还原电位等,最终引起抗生素降解率差异。综上,超声波协同低温等离子体处理黑木耳时,超声功率、超声时间、超声温度对抗生素降解影响较大,因此以这3 个因素继续进行优化试验。

2.2 超声波协同低温等离子体活化水响应面优化试验

2.2.1 响应面优化试验设计结果

在单因素试验基础上,固定超声频率25 kHz、抗生素初始浓度0.5 mg/kg,以超声功率、超声时间和超声温度3 个因素为自变量,采用Box-Behnken 中心组合试验评估不同因素组合对抗生素降解效果的影响。响应面设计及结果见表2。

表2 Box-Behnken 设计试验的结果Table 2 Results of Box-Behnken design test

通过Design Expert 8.0 软件对不同因素组合的恩诺沙星与环丙沙星降解率数据进行多元回归拟合,得到与A、B、C相关的恩诺沙星降解率（Y1）的二次多项回归模型为Y1=55.23+1.93A+0.99B+0.88C+0.75AB+1.31AC+0.49BC-2.42A2-5.22B2-2.80C2；环丙沙星降解率（Y2）的二次多项回归模型为Y2=50.76+2.09A+1.47B+1.21C+0.65AB+1.63AC+1.02BC-2.62A2-4.20B2-1.99C2。对恩诺沙星降解率的二次多项回归模型与环丙沙星降解率的二次多项回归模型进行显著性方差分析,结果见表3、表4。

表3 Y1 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of Y1 regression model

表4 Y2 回归模型的方差分析Table 4 Variance analysis of Y2 regression model

由表3、表4 可知,Y1模型的R2=0.977 0,R2Adj=0.947 4,Y2模型的R2=0.979 2,R2Adj=0.952 4。在统计学上,模型的决定系数R2表示该模型的拟合优度,R2值越大则该模型表现的显著性越高,自变量对因变量的解释程度越高[17-18]。Y1与Y2模型的R2Adj系数表明这两种模型与真实数据的拟合程度良好,符合研究实际意义,可用该模型优化超声波协同低温等离子体活化水的处理条件。Y1回归模型的F值为33.02,p值小于0.01,Y2回归模型的F值为36.60,p值同样小于0.01,表明两种回归模型都极显著；失拟项p值分别为0.933 7 与0.815 3,均远大于0.05,表明失拟项差异不显著且模型的拟合性良好,该模型具有实际研究意义。根据p值大小可以看出模型的因子显著性,其中Y1模型的一次项A、二次项A2、B2、C2对响应值的影响极显著（p<0.01）,一次项B、C、交互项AC对响应值影响显著（p<0.05）,模型交互项AB、BC影响不显著（p>0.05）；Y2模型的一次项A、B、C、交互项AC、二次项A2、B2、C2的影响均极显著（p<0.01）；交互项BC影响显著（p<0.05）且交互项AB影响不显著（p>0.05）。根据F值的大小比较各种因素对抗生素降解率的影响,两种抗生素模型影响大小排序为超声时间>超声温度>超声功率。

2.2.2 响应面试验结果分析

超声时间、超声温度、超声功率3 个不同因素两两交互作用对恩诺沙星及环丙沙星降解率的影响如图2和图3 所示。

图2 两因素交互作用对恩诺沙星降解率的影响Fig.2 The effect of two factors interaction on the degradation rate of enrofloxacin

图3 两因素交互作用对环丙沙星降解率的影响Fig.3 The effect of two factors interaction on the degradation rate of ciprofloxacin

由图2 和图3 可知,响应面及等高线结果与两模型方差分析的结果基本一致,Y1回归模型中超声时间与超声功率的交互作用影响显著；Y2回归模型中,超声时间与超声功率、超声温度与超声功率之间的交互作用对环丙沙星的降解率影响显著。根据建立的两种抗生素降解率模型Y1与Y2,得到的最优条件为超声时间45.21 min、处理温度31.69 ℃、超声功率507.33 W,此时对恩诺沙星、环丙沙星的降解效果为55.91%和51.85%,预测准确度为96.2%。张秀芬等[19]在研究超声波辅助水酶法对辣木籽油提取率的条件优化中,采用响应面法优化提取中的超声条件,同样分析了不同因素交互作用的响应面及等高线,得到不同因素对辣木籽油提取率的影响程度,并得到超声条件的最优工艺,其验证试验的降解率与模型建立的最优工艺预测降解率无明显差异。

2.2.3 验证试验

为进一步确定抗生素降解效果的最优条件,根据Design Expert 8.0 模型预测的结果,综合实际操作的可行性和经济原则,固定因素超声频率25 kHz、抗生素初始浓度0.5 mg/kg,将最优试验条件调整为超声时间45 min、处理温度30 ℃、超声功率480 W,使用超声协同低温等离子体活化水平行处理3 次,结果见图4。

图4 不同处理方式对木耳中抗生素降解率的影响Fig.4 The effect of different treatments on the degradation rate of antibiotics in Auricularia auricular

由图4 可知,恩诺沙星与环丙沙星两种抗生素降解率分别为55.47%和51.92%,与预测值无明显差异,说明该响应面法优化抗生素的降解条件有效可行。同时,以优化获得的超声波处理参数为基础,以去离子水代替活化水进行木耳加标样品处理,发现其对恩诺沙星与环丙沙星的降解率分别为26.36%和23.48%；将木耳样品置于低温等离子体活化水中,30 ℃条件下处理45 min时两种抗生素的降解率分别为16.58%和15.36%。

以上结果表明,超声波和等离子活化水均对抗生素的降解有一定作用,而二者协同处理能进一步提高抗生素的降解率。这与Ali 等[20]采用超声波联合等离子水活化水/缓冲液进行番茄中百菌清降解,发现联合处理对农药的降解率达到93%以上,且显著优于超声波、等离子水体活化水和等离子体缓冲液单独处理的结果一致。Thokchom 等[21]以等离子体活化水和超声波协同处理污染物时,超声波的空穴效应可以提高氧化过程和羟基自由基的生成,进而提高目标物的降解率；Zhu 等[22]发现高压、高温、来源于水分子的OH-以及超声波的空穴效应等可以持续提高有机杀虫剂的降解率。

2.3 超声波协同低温等离子体活化水处理后木耳的品质评价

在上述最优参数下评价超声波协同低温等离子体活化水处理对木耳品质的影响,结果如表5 所示。

表5 超声波协同低温等离子体活化水处理对木耳品质的影响Table 5 Effect of ultrasonic-assisted low-temperature PAW treatment on the quality of Auricularia auricula

由表5 可知,处理后木耳中总糖含量为34.65%,比处理前降低了5.24%,依然高于国家标准中木耳总糖含量不低于22%的要求。同时,处理后木耳的粗蛋白含量降低1.24%、粗脂肪含量降低0.12%,对粗纤维、灰分无显著性影响（p>0.05）,且均符合国家标准对黑木耳的理化指标要求[23]。

3 结论

本研究采用超声波协同低温等离子体活化水对木耳中抗生素进行处理,并通过响应面设计优化得到最佳工艺参数,在超声功率480 W、超声时间45 min、超声温度30 ℃、超声频率25 kHz、抗生素浓度0.5 mg/kg条件下,木耳中环丙沙星和恩诺沙星降解率分别可达51.92% 及55.47%。经过处理后,木耳中总糖、粗蛋白、粗脂肪含量分别降低5.24%、1.24%、0.12%,粗纤维和灰分含量无显著变化,经过处理后主要营养指标均符合国家标准要求,因此,本研究建立的处理方法为木耳中抗生素控制提供了新思路。