益生菌发酵番茄汁对小鼠抗疲劳和肠道菌群的调节作用

韩紫薇，赵斗，马自强，仇燕*

（1.河北科技大学食品与生物学院,河北石家庄 050018；2.新疆冠农股份有限公司技术中心,新疆库尔勒 841000）

疲劳一般可分为精神疲劳和身体疲劳,肌肉疲劳是由剧烈运动产生,会导致大量自由基的产生和积累进而产生氧化损伤。当机体进行超负荷的体力劳动未得到及时缓解时,会产生一系列的生理变化,大量的代谢产物如乳酸和尿素氮在体内不能代谢出去,就会造成机体运动耐力下降,严重时能损伤机体器官从而引起抑郁症、癌症和帕金森等疾病的产生[1]。有研究表明,肠屏障的损伤和肠道菌群的变化可能导致慢性疲劳综合征患者疲劳后的严重不适[2],疲劳综合征往往伴随着肠道菌群紊乱[3]。因此肠道菌群在疲劳产生的过程中起到非常重要的作用。膳食补充石菖蒲[4]、红景天[5]、黄芪多糖[6]、番茄红素[7]等中草药或食物来源的天然物质能有效延缓运动性疲劳,其抗疲劳作用主要通过抑制神经递质的累积、增加机体能量物质储备、促进脂肪供能、维持氧化还原稳态、减少代谢物堆积、增强线粒体生物合成以及修复线粒体损伤来实现[8]。近年来,抗疲劳功能性饮料成为促进疲劳消除和提高机体机能的理想产品[9],受到广泛青睐。

番茄（LycopersiconesculentumMill.）含有丰富的维生素C、番茄红素和多酚等活性物质,这些物质具有抗氧化、降血脂和抗癌活性,对人类健康具有积极影响[10]。番茄及其衍生产品是促进健康的营养食品和微量营养素的良好来源。利用酿酒酵母发酵番茄汁,可改善果汁的物理性质和番茄红素的体外生物可及性[11]。番茄汁经乳酸菌发酵后其中的矿质营养元素、B族维生素含量均有较大提高,且菌体分泌的蛋白酶能够分解多余的多肽和蛋白质从而提高氨基酸种类和含量[12]。利用益生菌（植物乳杆菌和嗜热链球菌）发酵的番茄原汁,融合了益生菌和番茄汁的营养价值与保健功能,且其口感得到改善[13]。

目前关于益生菌发酵番茄汁（probiotic fermented tomato juice,PFTJ）抗疲劳作用的研究未见报道。因此,本研究通过小鼠负重力竭游泳实验,结合小鼠生化指标、骨骼肌中5′-腺嘌呤核苷酸蛋白激酶（adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α（peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1alpha,PGC-1α）基因的表达水平评估PFTJ 的抗疲劳效果,并通过肠道菌群群落结构探究其调节肠道菌群的功能,以期为功能型番茄发酵制品的开发与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵番茄汁（经植物乳杆菌和嗜热链球菌充分发酵后超高温瞬时杀菌）:新疆冠农股份有限公司。无特定病原体（specific pathogen free,SPF）级雄性ICR 小鼠:（20±2）g,北京华阜康生物科技股份有限公司,合格证号SCXK（京）2019-0008,饲养环境温度（25±1）℃,自由饮水进食,将小鼠进行1 周的适应性饲养后分组实验。

红景天胶囊:江苏康缘药业股份有限公司（国药准字Z20040023）；尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）测定试剂盒、乳酸（lactic acid,LA）测定试剂盒、糖原测定试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）测定试剂盒、丙二醛（malondialdehyde,MDA）测定试剂盒:南京建成生物工程研究所；快速去基因组cDNA 第一链合成试剂盒:康维世纪生物科技股份有限公司；化学染料法定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）预混液（无ROX）:莫纳生物科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

高速冷冻离心机（RE-52）:赛默飞世尔科技有限公司；数显恒温水浴锅（DK-98-Ⅱ）:天津市泰斯特仪器有限公司；酶标仪（SpectraMAX i3x）:美国美谷分子仪器有限公司；电子天平（AR124CN）:美国奥豪斯仪器有限公司；荧光定量PCR 仪（CFX connectTM）:美国BIO-RAD 公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组

将雄性ICR 小鼠随机分成4 组:空白对照组（生理盐水）、阳性对照组（红景天胶囊0.06 g/kg）、PFTJ 低剂量组（5 mg/kg）和高剂量组（15 mg/kg）,每组10 只,实验前进行小鼠适应性喂养1 周。空白对照组每天灌胃10 mL/kg 的生理盐水,PFTJ 低剂量组和高剂量组分别灌胃5 mg/kg 和15 mg/kg 的PFTJ,连续灌胃4 周,每7 d 量取一次体质量,按体质量变化量调整灌胃量。动物实验的伦理审批单位为河北科技大学动物实验伦理审查委员会（批准号:2022017）。

1.3.2 小鼠负重力竭游泳实验

末次灌胃PFTJ 40 min 后进行小鼠负重力竭游泳实验,将小鼠置于温度（25±5）℃、水面高25 cm 左右的塑料容器中,并在小鼠尾部负荷体质量10%的铁块进行游泳实验,以小鼠沉入水面10 s 不能浮出水面的时间作为负重力竭游泳时间[14]。

1.3.3 血清和肌肉组织中生化指标的测定

负重力竭游泳小鼠休息10 min 后于眼眶静脉取血,将血液收集到1.5 mL 离心管中,4 ℃、3 000 r/min离心15 min,分离后取血清,置于1.5 mL 离心管,于-20 ℃中保存待测。按照试剂盒方法测定BUN 含量和LA 含量。

颈椎脱臼法处死小鼠,取0.25 g 的骨骼肌组织加入2.25 mL 的生理盐水,冰水浴条件下研磨匀浆,制成质量体积比为10%的组织匀浆液,4 ℃、2 500 r/min 下离心10 min,取上清液,按照试剂盒方法测定糖原和MDA 含量以及SOD 和GSH-Px 活性。

1.3.4 小鼠骨骼肌中AMPK和PGC-1α的实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）分析

采用RT-qPCR 分析小鼠骨骼肌中AMPK和PGC-1αmRNA 基因的表达。苯酚-胍盐法（Trizol）法从骨骼肌中提取总RNA,使用逆转录试剂盒合成互补DNA（cDNA）。PGC-1α正向引物序列为（5′CGATGACCCTCCTCACACCAAAC3′）,反向引物序列为（5′TTGCGACTGCGGTTGTGTATGG3′）；AMPK正向引物序列为（5′CGAGTGTTCGGAGGAGGAGGTC3′）,反向引物序列为（5′GTGGGCTGGTTGCTAGGTAGAAATC3′）。之后进行RT-qPCR,qPCR 条件为95 ℃15 min,之后95 ℃10 s、56 ℃30 s 和72 ℃30 s,40 个循环。数据分析采用2（-ΔΔCT）方法进行。

1.3.5 肠道菌群的测定

小鼠饲养4 周后每只小鼠收集3～5 粒粪便（每组3 个平行）,提取粪便DNA、16S RNA V3～V4 可变区扩增,引物为338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACATCHVGGGTWTCTAAT-3′）,之后进行高通量测序。利用UPARSE 软件对操作分类单元（operational taxonomic units,OTU）进行聚类设置相似度为97%,通过比对数据库（比对阈值为70%）,对每条序列进行物种分类注释。其余数据处理均在上海美吉生物公司生信云（https://cloud.majorbio.com/）中进行。

1.4 数据处理

实验数据结果用平均值±标准差表示,利用SPSS Statistics 26.0 统计软件进行单因素方差分析,Duncan法进行多重差异显著比较,Origin 2019 作图,P<0.05表示数据有显著差异。

2 结果与分析

2.1 PFTJ 对小鼠体质量的影响

小鼠体质量变化反映了PFTJ 对小鼠食欲和健康情况的影响[15]。灌胃4 周各组小鼠的体质量变化情况如表1 所示。

表1 各组小鼠体质量变化（n=10）Table 1 Change in body weight of mice in each group（n=10）g

由表1 可知,随着灌胃时间的延长,小鼠的体质量呈增加趋势。在同一时间,PFTJ 组与空白对照组和阳性对照组相比均无明显差异。同时,灌胃期间小鼠未发现异常或死亡情况,结果表明PFTJ 不会影响小鼠的健康生长。

2.2 PFTJ 对小鼠负重力竭游泳时间的影响

负重力竭游泳实验是评估抗疲劳能力的动物模型之一[16]。游泳时间的长短可以反映疲劳程度,运动耐力的提升是抗疲劳功效的表现。PFTJ 灌胃ICR 小鼠28 d 后,各组小鼠的负重力竭游泳时间见表2。

表2 各组小鼠负重力竭游泳时间（n=10）Table 2 Exhausted swimming time of mice in each group（n=10）min

由表2 可知,与空白对照组相比,阳性对照组、PFTJ 低剂量组和PFTJ 高剂量组的负重力竭游泳时间均有所延长,PFTJ 低剂量组和PFTJ 高剂量组的力竭游泳时间分别为34.60 min 和38.81 min,较空白对照组分别提高了22.65%和37.58%,以上结果表明,PFTJ能延长小鼠的负重力竭游泳时间,提高运动耐力,且小鼠负重力竭游泳时间随PFTJ 灌胃剂量的升高而延长,PFTJ 具有一定的抗疲劳作用。

2.3 PFTJ 对小鼠血清中尿素氮和乳酸含量的影响

疲劳的产生与代谢产物的积累有关,过多的代谢物会对机体产生毒害作用[17]。高强度的运动会造成机体中尿素氮（BUN）和乳酸（LA）的过量积累。当运动将机体贮存的能量消耗殆尽时就会分解肌肉蛋白而产生氨,高浓度的氨会影响脑组织内能量代谢和神经递质的传递,导致运动性疲劳[18]。血液中的氨以BUN 形式存在,是蛋白质和氨基酸的代谢产物,在肝脏中合成后被血液运输到肾脏随尿液排出。在长时间高强度运动状态下,肌肉内的氧气不断地消耗,会出现缺氧的现象,这时会促进糖酵解过程中丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化作用下产生大量的LA,使肌肉和血液中的pH 值降低进而影响糖原分解,能量供应受阻而造成运动性疲劳[19]。PFTJ 对小鼠血清中BUN 含量的影响见图1。

图1 PFTJ 对小鼠血清中尿素氮含量的影响Fig.1 Effect of PFTJ on blood urea nitrogen（BUN）concentration in the serum of mice

由图1 可知,负重力竭游泳后空白对照组小鼠血清中的BUN 含量为9.40 mmol/L,阳性对照组、PFTJ 低剂量组和PFTJ 高剂量组的BUN 含量均低于空白对照组。随着PFTJ 剂量升高BUN 含量呈下降趋势。与空白对照组相比,PFTJ 高剂量组的BUN 含量显著下降了27.34%（P<0.05）。

PFTJ 对小鼠血清中LA 含量的影响如图2 所示。

图2 PFTJ 对小鼠血清中乳酸含量的影响Fig.2 Effect of PFTJ on lactic acid（LA）concentration in the serum of mice

由图2 可知,与空白对照组相比,阳性对照组、PFTJ 低剂量组和PFTJ 高剂量组的乳酸含量分别下降了4.90%、5.01% 和14.00%,其中PFTJ 高剂量组能显著降低小鼠体内乳酸的产生（P<0.05）。综上,PFTJ 能够有效清除剧烈运动后小鼠体内的BUN 和LA,延缓疲劳的产生、增强抗疲劳能力。

2.4 PFTJ 对小鼠肌糖原含量的影响

肌糖原是机体运动时的主要能量来源,肌糖原消耗严重会影响小鼠的运动能力,尤其是运动耐受力[20]。剧烈运动会使肌糖原迅速分解,从而为肌肉收缩提供能量,所以肌糖原的含量可以很好地反映疲劳程度。PFTJ 对小鼠肌糖原含量的影响见图3。

图3 PFTJ 对小鼠骨骼肌中肌糖原含量的影响Fig.3 Effect of PFTJ on muscle glycogen content in the skeletal muscle of mice

由图3 可知,空白对照组的肌糖原含量为5.28 mg/g,与空白对照组相比,阳性对照组、PFTJ 低剂量组和高剂量组肌糖原含量分别显著提高了44.70%、21.97%和47.35%（P<0.05）。PFTJ 处理组能提高肌糖原含量,为肌肉收缩提供足够能量,减少糖原消耗,缓解疲劳。Kim 等[21]研究发现,灌喂高剂量铁皮石斛提取物能降低小鼠运动期间作为能量来源的糖原的利用,这与本研究结果相同。

2.5 PFTJ 对小鼠肌肉组织中抗氧化相关指标的影响

高强度运动会使机体处于氧化应激状态,产生大量自由基[如活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）],降低机体抗氧化能力,进而诱导疲劳产生[1]。SOD、GSH-Px 和CAT 这些抗氧化酶在清除自由基及其代谢产物方面起重要作用,还可以预防各种疾病,被认为是抵抗ROS 的重要防线。PFTJ 对小鼠肌肉组织中抗氧化相关指标的影响见图4～图6。

图4 PFTJ 对小鼠SOD 活性的影响Fig.4 Effect of PFTJ on SOD activity in mice

由图4 可知,空白对照组小鼠肌肉组织的SOD 活性为16.51 U/mg。与空白对照组相比,阳性对照组、PFTJ 低剂量组和高剂量组分别显著提高了55.00%、29.07% 和76.56%（P<0.05）。由图5 可知,PFTJ 高剂量组GSH-Px 活性较空白对照组显著提高了21.35%（P<0.05）。由图6 可知,MDA 含量随PFTJ 剂量的增加而降低,与空白对照组相比,PFTJ 高剂量组显著降低了38.06%（P<0.05）。以上结果表明,PFTJ 能够提高小鼠肌肉抗氧化酶（SOD 和GSH-Px）活性,降低自由基代谢产物MDA 的积累,且具一定的剂量效应关系。

图5 PFTJ 对小鼠GSH-Px 活性的影响Fig.5 Effect of PFTJ on GSH-Px activity in mice

图6 PFTJ 对小鼠MDA 含量的影响Fig.6 Effect of PFTJ on MDA content in mice

2.6 PFTJ 对小鼠骨骼肌中AMPK 和PGC-1α 基因表达的影响

AMPK/PGC-1α 是调控能量代谢的关键信号通路,在肌肉运动和物质利用中发挥重要作用。AMPK 在运动疲劳时被迅速激活,PGC-1α 作为AMPK 的重要下游靶分子,可直接被AMPK 磷酸化,在线粒体生物发生中起关键作用[20]。PFTJ 对小鼠骨骼肌中AMPK和PGC-1α基因表达的影响见图7。

图7 PFTJ 对小鼠骨骼肌中AMPK 和PGC-1α 基因相对表达的影响Fig.7 Effects of PFTJ on the mRNA relative genes expression of AMPK and PGC-1α in the skeletal muscle of mice

由图7 可知,与空白对照组相比,阳性对照组和PFTJ 处理组小鼠肌肉中AMPK和PGC-1α的mRNA表达水平均有所提高。随着PFTJ 剂量的增加,AMPK和PGC-1α的表达水平增加。与空白对照组相比,阳性对照组AMPK和PGC-1α的mRNA 表达水平分别提高了38.71%和80.95%,PFTJ 低剂量组和高剂量组小鼠骨骼肌AMPK的表达水平分别显著提高了83.40%和231.90%,PGC-1α的mRNA 表达水平分别显著提高了160.60% 和417.87%（P<0.05）。由此可见,PFTJ 可诱导AMPK和PGC-1α表达水平的升高,促进线粒体的合成,从而增加ATP 的产生,延缓疲劳。Wen 等[7]发现番茄红素可以激活AMPK/PGC-1α 调控通路,促进线粒体的生物合成,使快收缩肌肉纤维向慢收缩肌肉纤维的转变,慢收缩肌肉纤维能够高效利用氧合成ATP 维持肌肉收缩,增强骨骼肌的疲劳抗性。

2.7 PFTJ 对小鼠肠道菌群多样性的影响

肠道菌群多样性及其对人体的生理和病理之间的关系现已得到广泛研究证实。利用香菜类黄酮[20]、铁皮石斛多糖[22]进行饮食干预调节小鼠肠道菌群,增加菌群多样性,可以提高抗疲劳能力。肠道菌群Alpha多样性分析能反映生物群落的丰富度和多样性。Chao指数主要反映微生物群落的丰富度,数值越大,表明群落中含有OTU 数目越多,群落的丰富度越大；Shannon指数反映微生物群落的多样性,数值越大,表明群落中多样性越高。PFTJ 对小鼠肠道菌群多样性的影响见图8。

图8 PFTJ 对小鼠肠道菌群Alpha 多样性指数的影响Fig.8 Effects of PFTJ on Alpha diversity indexes of the intestinal microflora in mice

由图8 可知,空白对照组小鼠Chao 和Shannon 指数分别为226.90 和1.36,阳性对照组小鼠Chao 和Shannon 指数均显著高于空白对照组（P<0.05）。与空白对照组相比,PFTJ 低剂量组和PFTJ 高剂量组小鼠Chao 和Shannon 指数均有所提高,其中PFTJ 高剂量组小鼠Chao 和Shannon 指数分别提高了22.24% 和111.76%。以上结果表明,PFTJ 能提高Chao 和Shannon 指数,改善小鼠肠道菌群的丰富度和多样性,并随着PFTJ 剂量呈现一定剂量依赖趋势。

Beta 多样性是利用每个样品序列的进化关系和丰度信息来计算样本之间的距离,以反映样本（组）之间是否存在显著的微生物群落差异[23]。主坐标分析（principal co-ordinates analysis,PCoA）是Beta 多样性常用的分析方法。小鼠肠道菌群在OTU 水平上的PCoA 分析如图9 所示。

图9 各组小鼠肠道菌群Beta 多样性主坐标分析Fig.9 PCoA diagram of Beta diversity of the intestinal microflora in mice of each group

由图9 可知,空白对照组与阳性对照组、PFTJ 低剂量组和高剂量组均产生分离,而PFTJ 高剂量组与低剂量组距离靠近,说明PFTJ 可以改变小鼠肠道菌群的组成。PFTJ 高、低剂量组的分布更为集中,且PFTJ 剂量越高各组样本之间距离越小,个体差异越小,说明给予PFTJ 可以提高小鼠肠道菌群的进化相似性,通过PFTJ 干预能够使小鼠建立新的肠道菌群环境。冯瑞方等[24]利用牛骨胶原蛋白肽干预Balb/c 小鼠4 周以提高小鼠抗疲劳能力,发现主成分分析在PC2 轴（解释度为15.45%）上,对照组和肽干预组间菌群无交叉,这与本研究结果相似。

2.8 小鼠肠道菌群的科、属水平物种组成分析

小鼠肠道菌群的科、属水平物种组成分析见图10、图11。

图10 PFTJ 对小鼠肠道菌群科水平物种组成的影响Fig.10 Effect of PFTJ on the species composition of the intestinal microflora in mice at family level

图11 PFTJ 对小鼠肠道菌群属水平物种组成的影响Fig.11 Effect of PFTJ on the species composition of the intestinal microflora in mice at genus level

由图10、图11 可知,利用PFTJ 进行干预后小鼠肠道菌群发生了变化。在科水平上乳杆菌科（Lactobacillaceae）和Muribaculaceae 科的相对丰度上调,丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）、双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）的相对丰度下调。在属水平上,乳酸杆菌属（Lɑctobɑcillus）和norɑnk_f_Muribɑculɑceɑe相对丰度上调,而粪杆菌属（Fɑecɑlibɑculum）和双歧杆菌属（Bifidobɑcterium）则下调。有研究表明,增加肠道微生物群乳酸杆菌属的丰度可以提高肠道内短链脂肪酸（short chain fat acid,SCFA）的浓度[25],对于调节肠道菌群起到了积极作用。牛骨胶原蛋白肽能够明显上调小鼠肠道菌群中norank_f_Muribɑculɑceɑe的相对丰度,提高小鼠疲劳能力[24]。norɑnk_f_Muribɑculɑceɑe的丰度与健康小鼠粪便中富集的代谢产物呈正相关,可能是一种富含于健康肠道环境中的细菌[26]。在PFTJ 干预后,小鼠肠道中乳酸杆菌属和norɑnk_f_Muribɑculɑceɑe相对丰度上调,由于这两种有益菌对增加SCFA 和肠道健康有积极作用,推测其相对丰度的提高可能与PFTJ 的抗疲劳作用有关。

3 讨论与结论

机体疲劳的产生机制主要包括代谢产物积累理论、能量消耗理论和自由基理论[27]。细胞无氧呼吸过程中糖代谢会产生LA,蛋白质代谢水解加强则会产生氨,经肝循环形成尿素,最后形成BUN,体内LA 和BUN 这两种产物积累越多越容易产生疲劳。本研究结果发现PFTJ 可以降低LA 和BUN 含量,提高机体的疲劳耐受。根据“能量消耗理论”,运动开始时消耗细胞中的葡萄糖,血糖降低,肌糖原分解进行有氧呼吸,当肌糖原大量消耗而得不到及时补充,便会导致机体疲劳。PFTJ 能够提高小鼠肌糖原水平,且呈现一定的剂量效应。自由基被认为是导致机体疲劳的主要因素,过量的高强度运动会导致产生过量的自由基,破坏蛋白质和核酸结构,攻击生物膜致使脂质过氧化生成MDA,造成氧化应激损伤,引发肌肉疲劳。细胞的抗氧酶包括SOD、GSH-Px 等,能清除过多的自由基以维持机体氧化抗氧化平衡。高剂量PFTJ 能够显著提高SOD 和GSH-Px 的活性以清除自由基避免细胞受损,同时降低MDA 含量。AMPK/PGC-1α 信号通路在调节缺氧和能量代谢过程中起着非常重要的作用。激活此通路可促进线粒体生物合成缓解细胞缺氧,修复氧化损伤。在本研究中发现高剂量PFTJ 能显著提高小鼠骨骼肌中AMPK和PGC-1α的mRNA 表达水平,进而提高PGC-1α的转录活性,为细胞提供能量。

肠道菌群被称为机体的“第二基因组”,肠道菌群多样性分析已成为近年来研究健康与疾病的新视角[20]。剧烈运动产生过量自由基造成运动性氧化应激损伤,增加有害代谢物沉积,诱发疲劳加重,可能还会导致肠道菌群多样性降低,致病菌相对丰度升高。本研究发现PFTJ 能够提高肠道菌群多样性,促进乳酸杆菌属和norɑnk_f_Muribɑculɑceɑe生长,抑制丹毒丝菌科。在属水平上,PFTJ 促进了产SCFA 的乳杆菌属的大量增殖,而短链脂肪酸可以改善葡萄糖的代谢、吸收和转移,并有助于缓解疲劳[28]；同时PFTJ 提高了肠道有益菌属norɑnk_f_Muribɑculɑceɑe的丰度。

综上所述,PFTJ 通过减少疲劳相关代谢物的堆积,抑制糖原消耗增强能量储备,还可以调节氧化相关酶以减缓氧化应激,激活AMPK/PGC-1α 通路来缓解疲劳。PFTJ 干预调节肠道菌群结构,有助于产SCFA 肠道微生物群直接获得竞争优势,以达到更好的抗疲劳效果。PFTJ 有望成为抗疲劳、调节肠道菌群的新型保健功能性饮料原料,但其抗疲劳与肠道菌群的关系有待进一步通过代谢组学和宏基因组学的方法进行深入研究。