新创制豫南黑香糯米的营养特性分析

李春英，刘慧鸽，乔云柯，曲姗姗，李俊周4，，李瑜，3

（1.河南农业大学食品科技学院,河南郑州 450002；2.农业农村部大众粮食加工重点实验室,河南郑州 450002；3.郑州市蔬菜加工贮藏与安全控制重点实验室,河南郑州 450002；4.河南省水稻生物学重点实验室,河南郑州 450002；5.河南农业大学农学院,河南郑州 450002）

水稻属于禾本科（Poaceae/Gramineae）稻亚科（Oryzoideae）稻属（OryzɑLinnɑeus）的一年生草本植物。水稻适应性广,普遍分布于全球各稻区,稻米粉具有低致敏性、低钠、易消化等优点,全球以水稻替代小麦粉备受关注。糙米的果皮和种皮约占2%,糊粉层占5%～6%,胚占2.5%～3.5%,胚乳占88%～93%,维生素[1]、矿物质、必需氨基酸以及酚酸、γ-谷维素、γ-氨基丁酸等大部分的生物活性物质都在胚芽和种皮中[2],具有抗氧化[3]、降血糖[4]、降血脂[5]等生物功效。黑香糯米是聚合色稻、浓郁芳香气味的香稻和糯稻多种性状的特种稻,蒸煮后米饭紫黑晶莹,浓郁芳香,口感软糯有弹性；冷饭具有不易回生的特点[6]。黑香糯米因其营养丰富,多食具有健脾暖肝、明目活血、妇女产后虚弱、贫血、肾虚等补养作用,被誉为“黑珍珠”、“补血米”、“长寿米”[7]。

河南省水稻主产区地处豫南的亚热带向暖温带过渡区,适合种植特种稻。近年来,水稻种质资源也向外观好、食味佳、富含矿物质、富含花青素等功能性稻米变化,选育、研究和开发优质营养的功能性稻米符合中国水稻产业发展和市场需求。本研究对新创制的4份豫南黑香糯米进行淀粉、花青素和矿质元素含量分析,以期筛选出精准功能营养特性的特种稻资源,为豫南稻区特种稻种质资源创新研究和利用提供新品系的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豫南黑香糯米（‘晋谷60 号’经6 代辐射诱变得到的已稳定的诱变株系）、‘日本晴’（‘NIP’、‘山彦’与‘幸风’杂交得到的粳稻品种）:2021 年河南农业大学农学院水稻研究组提供。‘NIP’为白米对照样品,‘LN48-2’、‘LN48-3’、‘LN54’、‘LN55’是经‘LN56 CK’辐射诱变得到的新品种。

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3,5-二葡萄糖苷（纯度≥98%）、直链淀粉（CAS:9005-82-7）、支链淀粉（CAS:9037-22-3）:北京索莱宝科技有限公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯）:天津市四友精细化学品有限公司；正己烷、甲酸、碘化钾、氢氧化钾、无水乙醇、盐酸、硝酸（均为分析纯）:国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

扫描电子显微镜（S-3000N）:日立科学仪器有限公司；喷金仪（IS150）:江苏雷博科学仪器有限公司；超高效液相色谱仪（Ultimate 3000）:上海硅仪生化科技有限公司；紫外-可见分光光度计（UV-2600）:日本岛津企业管理有限公司；微波消解仪（TANK 40）:山东海能未来技术集团股份有限公司；离心机（TDZ5-WS）:湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；等离子质谱仪（Agilent 700）:美国安捷伦科技有限公司；超细微粉碎机（FW80）:天津市泰斯特仪器有限公司；漩涡仪（VORTEX-5）:海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 淀粉制备

稻米采用超细微粉碎机粉碎制粉,过筛（80 目）,利用正己烷去脂处理后,干燥,获得去脂米粉样品,备用。

精确称取3.00 g 米粉,0.4% KOH 浸泡20 min,4 000 r/min 离心10 min,弃去上清液,沉淀用蒸馏水洗涤至中性,过筛（200 目）,4 000 r/min 离心10 min,取出沉淀于45 ℃干燥,粉碎,过筛（100 目）,最终得到粗淀粉样品,置于干燥器中常温保存备用。

1.3.1.1 淀粉颗粒结构观察

每份淀粉样品用导电双面胶带纸固定在铜样台上,对淀粉样品进行喷金,于扫描电子显微镜下观察其淀粉颗粒形态。测试条件:加速电压5.00 kV、放大倍数5 000 倍。

1.3.1.2 标准曲线绘制

准确称取直链淀粉0.100 g 于烧杯中,加入1 mL无水乙醇分散淀粉后加入0.5 mol/L 氢氧化钾溶液9 mL,在沸水浴中加热糊化30 min,不断搅拌使其完全溶解后加蒸馏水定容至100 mL,制得1 mg/mL 直链淀粉标准工作液。分别吸取直链淀粉标准工作液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,调pH 值至3.5,滴加显色剂后加蒸馏水定容至100 mL,于400～800 nm 波段扫描,获得吸收光谱图,并用等吸收点作图法确定直链淀粉的检测波长。

准确称取支链淀粉0.100 g 于烧杯中,参照直链淀粉标准工作液制作方法获得1 mg/mL 支链淀粉标准工作液。分别吸取支链淀粉标准工作液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,用盐酸调pH 值至3.5,滴加显色剂后加蒸馏水定容至100 mL,利用紫外-可见分光光度计在400～800 nm 波段光谱扫描,获得吸收光谱图,并确定支链淀粉的检测波长。

1.3.1.3 淀粉含量测定

精确称取0.100 g 淀粉样品,加入1 mL 无水乙醇分散淀粉后加入0.5 mol/L 氢氧化钾溶液9 mL,在沸水浴中加热糊化30 min,不断搅拌使其完全溶解后转移至100 mL 容量瓶中定容,制得1 mg/mL 的淀粉糊化液。吸取淀粉糊化液1 mL,加水后调pH 值至3.5,滴加1 mL 碘-碘化钾试剂,定容至50 mL,并静置30 min,测定其吸光度,根据回归方程计算出直链淀粉和支链淀粉的含量。蒸馏水作为空白对照。

淀粉含量计算公式见公式（1）～（5）。

式中:Y粗为粗淀粉得率,%；m粗为碱浸法提取后的样品质量,g；m米为称取样品米粉质量,g；m总为总淀粉含量,%；W直为直链淀粉含量,%；W支为支链淀粉含量,%；c1为根据直链淀粉回归方程测得样品溶液浓度,mg/mL；c2为根据支链淀粉回归方程测得样品溶液浓度,mg/mL；V为定容体积,mL；n为稀释倍数；m为样品提取后干燥淀粉质量,g；P为样品淀粉纯度,%。

1.3.2 花青素含量测定

花青素含量的测定参考Park 等[8]的方法,并稍作修改。精确称取1.00 g 样品,用20 mL 80% 甲醇（含0.1% HCl）溶液常温提取24 h,4 000 r/min 离心10 min,取上清液用0.2µm 膜滤器过滤,用超高效液相色谱仪进行分析。色谱条件为检测器:光二极管阵列检测器（photo-diode array,PDA）；色谱柱Endeavorsil C18（520 nm）；进样量5µL；流动相A:0.1% 三氟乙酸（trifluoroacetic acid,TFA）溶液,流动相B:甲醇（含0.1%TFA）,0 min 20%B,0.4 min 25%B,6.5 min 35%B,9 min 20%B,10 min 20%B,流速0.5 mL/min。

标准溶液利用80% 甲醇（含0.1% HCl）溶液配制为1 mg/mL,置于棕色瓶中,-20 ℃保存备用。

1.3.3 矿物质相对含量测定

准确称取0.5 g 米粉,加入浓硝酸并放置微波消解仪进行消解,通过等离子质谱仪分析各种矿物质,使用匹配标准物质曲线求出每种矿物质相对含量。

1.4 数据处理

试验重复3 次,以平均值±标准差表示,并采用Excel 2016 和SPSS 26.0 软件进行数据处理和统计分析,通过单因素方差分析（one-way analysis of variance,ANOVA）检验显著性差异分析（P<0.05）,采用Origin 64 软件分析数据并绘图。

2 结果与分析

2.1 淀粉结果分析

2.1.1 淀粉提取

碱浸法提取所得粗淀粉样品如图1 所示。

图1 豫南黑香糯米粗淀粉Fig.1 Crude starch extracted from Yunan black fragrant glutinous rice

由图1 可知,除‘LN48-2’的淀粉样品中混有少量色素外,其余淀粉样品的色泽洁白、颗粒大小比较均匀。

2.1.2 淀粉结构

创新豫南黑香糯米提取的淀粉颗粒用扫描电子显微镜进行形态和颗粒大小观测,结果如图2 所示。

图2 豫南特种稻黑香糯米淀粉扫描电子显微镜图（5 000×）Fig.2 Scanning electron microscope（SEM）image of rice starches from Yunan black fragrant glutinous rice（5 000×）

由图2 可知,各品系间淀粉颗粒的形状和大小差异不明显,均表现出淀粉颗粒形状为不规则多角形,棱角分明,大小不一。淀粉颗粒表面观察到一些沟壑,可能是机械力造成,因为采用高速万能粉碎机结合筛分的方式获得的米粉,破损淀粉含量增加,而且淀粉粒度越小,损伤越多[9]。研究报道,从米粉的制作过程中超细微粉碎到淀粉的超声提取,都有可能造成淀粉颗粒大小不均匀、颗粒表面粗糙、颗粒内部层状结构的出现[10-11]。淀粉颗粒表面出现的空洞可能是淀粉提取过程中使用的碱造成的一定程度的损伤[12]。

2.1.3 淀粉含量

黑香糯米粉的粗淀粉得率、总淀粉含量和淀粉纯度对比如图3 所示。

图3 豫南黑香糯米粗淀粉得率、总淀粉含量和淀粉纯度对比Fig.3 Comparison of crude starch yield，total starch content and starch purity from Yunan black fragrant glutinous rice

由图3 可知,黑香糯米粉的粗淀粉得率（52.8%～60.7%）低于‘NIP’（71.2%）。黑香糯米中‘LN54’的粗淀粉得率最高,达60.7%；‘LN48-3’的粗淀粉得率最低,为52.8%；对照‘LN56 CK’的粗淀粉得率为54.3%。黑香糯米粉的总淀粉含量（36.5%～50.2%）低于‘NIP’（64.7%）,其中‘LN54’的淀粉含量（50.2%）最高,‘LN48-3’的淀粉含量（36.5%）最低,对照‘LN56 CK’的淀粉含量为47.0%。通过碱浸法获得淀粉纯度分析,发现‘NIP’的提取纯度高达90% 以上,‘LN55’、‘LN54’和‘LN56 CK’的纯度达80%以上,而‘LN48’系列品系的淀粉纯度低,只有70%左右。

2.1.4 淀粉组成

直链淀粉和支链淀粉的标准溶液通过紫外-可见分光光度计在400～800 nm 波段进行扫描,根据双波长测定原理,将扫描图谱进行绘图,结果如图4 所示。

图4 直链淀粉和支链淀粉双波长扫描光谱Fig.4 Dual-wavelength scanning spectra of amylose and amylopectin

由图4 可知,直链淀粉的最大吸收波长为620 nm,支链淀粉的最大吸收波长为530 nm。根据最大吸收波长绘出的直链淀粉和支链淀粉的参比波长分别是429 nm 和749 nm。因此,测定直链淀粉含量的双波长分别为λmax620 nm、λ参比429 nm,测定支链淀粉含量的双波长分别为λmax530 nm、λ参比749 nm。

直链淀粉和支链淀粉的扫描光谱和标准曲线分别如图5、图6 所示。

图5 直链淀粉扫描光谱和标准曲线Fig.5 Scanning spectrum and standard curve of amylose

图6 支链淀粉扫描光谱和标准曲线Fig.6 Scanning spectrum and standard curve of amylopectin

由图5 可知,根据不同浓度的直链淀粉标准溶液在最大吸收波长620 nm 处和参比波长429 nm 处的吸光度,求出两波长下的吸光度差值（△A）=A620nm-A429nm,绘制出直链淀粉的标准曲线,得到回归方程y=20.423x-0.003 2,R2=0.999 4。由图6 可知,根据不同浓度支链淀粉标准溶液在最大吸收波长530 nm 处和参比波长749 nm 处的吸光度,求出两波长下的吸光度差值（△A）=A530nm-A749nm,绘制出支链淀粉的标准曲线,其回归方程y=5.403 9x-0.001 2,R2=0.999 8。

豫南黑香糯米的淀粉组成及其含量和含量分布如图7 所示。

图7 豫南黑香糯米的淀粉组成及其含量和含量分布Fig.7 Starch composition，content and distribution of Yunan black fragrant glutinous rice in southern Henan

由图7 可知,新创制的不同品种的黑香糯米中支链淀粉的组成及其含量差异显著。‘LN54’、‘LN55’和‘LN56 CK’由支链淀粉组成,直链淀粉含量几乎为零。‘LN48’系列品系和‘NIP’中提取的淀粉中支链淀粉分别约占84.0% 和88.0%,直链淀粉分别约占16.0% 和12.0%。新创制的4 个品系中‘LN54’与对照‘NIP’和‘LN56 CK’以直链淀粉和支链淀粉含量绘制分布,可清晰地观察到‘LN54’、‘LN55’和黑香糯米对照‘LN56 CK’的直链淀粉和支链淀粉的分布特性相同,而‘LN48-2’和‘LN48-3’的直链淀粉和支链淀粉分布特性相似,更接近对照‘NIP’的淀粉组成和分布。

豫南黑香糯米的淀粉反应体系扫描光谱如图8所示。

图8 豫南黑香糯米的淀粉反应体系扫描光谱Fig.8 Scan spectrum of starch reaction system of Yunan black fragrant glutinous rice

由图8 可知,通过对淀粉反应体系进行波长扫描,进一步证实了‘LN54’、‘LN55’的糯性和‘LN56 CK’相同。‘LN54’、‘LN55’和‘LN56 CK’均在520 nm 处出现最大吸收峰,‘LN48’系列品系和‘NIP’则在570 nm 处出现了最大吸收峰。推测这可能是由淀粉的组成直链淀粉和支链淀粉的组成比例不同所致。‘LN54’、‘LN55’和‘LN56 CK’中几乎不含直链淀粉,其淀粉的反应体系最大吸收峰出现在支链淀粉的最大吸收波长520 nm 处。‘LN48’系列和‘NIP’中均含有约14%左右的直链淀粉,导致‘LN48’系列品系与‘NIP’淀粉的反应体系的最大吸收峰出现在570 nm 处。

2.2 花青素含量

新创制的5 种黑香糯米花青素在520 nm 波长下的超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography,UPLC）如图9 所示。

图9 豫南黑香糯米花青素在520 nm 处的UPLCFig.9 UPLC of anthocyanin from Yunan black fragrant glutinous rice at 520 nm

豫南黑香糯米花青素的色谱特性如表1 所示,花青素含量如图10 所示。

表1 豫南黑香糯米花青素的色谱特性Table 1 Chromatographic characteristics of anchocyanins in Yunan black fragrant glutinous rice

图10 豫南黑香糯米花青素含量Fig.10 Contents of anthocyanins from Yunan black fragrant glutinous rice

由图9 和表1 可知,豫南黑香糯米色中检测到4 种花青素,分别为矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷（cyanin-3,5-di-O-glucoside）,保留时间为5.34 min；天竺葵素3,5-二葡萄糖苷（pelargonidin-3,5-di-O-glucoside）,保留时间为6.65 min；矢车菊-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glu-coside）,保留时间为9.40 min；芍药素-3-O-葡萄糖苷（peonidin-3-O-glucoside）,保留时间为19.26 min。其中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量最高,相对含量平均值达90%,其次是芍药素-3-O-葡萄糖苷,相对含量达8%～10%。由此可见,豫南黑香糯米花青素主要是由矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-葡萄糖苷构成。

由图10 可知,‘LN48-3’品系的总花青素含量最高,为109.29 mg/100 g,其中,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量99.25 mg/100 g,芍药素-3-O-葡萄糖苷含量为9.09 mg/100 g。其次是对照‘LN56 CK’（104.45 mg/100 g）,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-葡萄糖苷含量分别为95.45 mg/100 g 和8.12 mg/100 g。‘LN48-2’和‘LN55’的花青素含量较低,分别为84.39 mg/100 g和87.15 mg/100 g,其矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量分别为76.02 mg/100 g 和78.00 mg/100 g。紫米的花青素组成以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为主,占总花青素的90%以上,芍药素-3-O-葡萄糖苷占10%左右,而红米中检不出花青素[13-14]。Pengkumsri 等[15]的研究报道中指出,泰国品种黑米利用含1% 盐酸的甲醇提取物中,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷占了26.7%,芍药素-3-O-葡萄糖苷占了53.8%。有色稻米的花青素组分含量不同跟稻米品种关系密切。

2.3 矿物质相对含量

豫南黑香糯米矿物质相对含量如图11 所示。

图11 豫南黑香糯米矿物质相对含量Fig.11 Relative contents of minerals in Yunan black fragrant glutinous rice

由图11 可知,黑香糯米的矿物质含量明显高于‘NIP’普通稻米,其中,创制的豫南黑香糯米中Ca、Mn、Zn 等矿物质含量明显高于对照‘LN56 CK’,可作为培育矿物质特种米或加工成高矿物质功能性米制品的重要原材料。‘LN48-2’和‘LN54’的Ca 和Zn 含量明显高于‘LN56 CK’,Ca 含量分别是‘LN56 CK’的约5 倍和3.5 倍,Zn 含量分别是‘LN56 CK’的约2.7 倍和2.5 倍。‘LN48-3’和‘LN54’的Mn 含量明显高于‘LN56 CK’,分别高于‘LN56 CK’26.5%和32.6%。‘LN56 CK’的Fe 含量明显高于‘NIP’59.4%,‘LN48-2’的Fe 含量也明显高于‘NIP’50.0%。矿物质是人体中含量少,但非常重要的微量营养素,膳食结构的不平衡,容易造成人体矿物质营养素的缺乏。一般情况下,黑米的Fe、Zn 等矿物质含量显著高于普通稻米[16]。黑米可作为人体获取矿物质重要的途径[17]。

近年来,特种稻作为具有特殊利用价值的水稻品种而不断扩展种质资源,对于特种稻营养功能的研究也逐渐深入。研究表明,特种稻中Ca、Fe、Zn 等矿物质含量普遍高于白米对照[18]。豫南稻区特种稻的矿质元素含量分析结果,Ca 含量普遍较高,变幅范围在161.5～384.0 mg/kg[19]。高钙天然配方米品种‘云光109’的Ca 含量为166 mg/kg[20]。综合对黑米和白米矿质元素含量的比较分析文章中指出,黑米中尤以Fe、Zn 微量元素,含量显著高于白米[21]。国际水稻所培育的富铁水稻‘IR164’中Fe 含量为25 mg/kg,上海‘黑糯2’的Fe 含量高达21.9 mg/kg,被称之为“富铁米”,‘黑香糯米193’和‘黑糯2’中Zn 含量也高达24 mg/kg 以上,被认为是一种“富锌米”[19]。本研究结果,‘LN48-2’的Ca 含量高达1 370.8 mg/kg,‘LN54’为956.3 mg/kg,‘LN55’为557.2 mg/kg,均可称之为“富钙米”品系。‘LN56 CK’对照品种的Fe 含量高达87.57 mg/kg,创新品系的Fe 含量变幅范围为57.0～82.3 mg/kg,均高于“富铁米”‘水稻IR164’品种。‘LN56 CK’对照品种的Zn 含量为22.3 mg/kg,而‘LN48-2’和‘LN54’中Zn 含量分别为60.3 mg/kg 和55.2 mg/kg,‘LN48 - 3’和‘LN55’中也含有31.6 mg/kg 和39.4 mg/kg,均高于“富锌米”品种。

3 结论

本研究根据新创制的适合河南地区南部种植的豫南黑香糯米,通过田间性状和产量的筛选,选出优异的4 份豫南黑香糯米品系。通过对淀粉、花青素和矿物质等豫南黑香糯米典型营养特性指标的分析,结果表明,黑香糯米的总淀粉含量显著低于‘日本晴’（‘NIP’,白米）,且淀粉的提取率和提取的淀粉纯度均显著低于‘日本晴’,这与黑香糯米壳中分布丰富的多酚类、花青素、膳食纤维有关。新创制的豫南黑香糯米淀粉颗粒结构与日本晴没有显著差异。黑香糯米品系不同,淀粉的组成有显著差异,‘LN48-2’和‘LN48-3’品系接近‘日本晴’的淀粉组成,直链淀粉含量约在14% 左右,而‘LN54’和‘LN55’品系与‘LN56 CK’品种的淀粉组成相同,直链淀粉含量不到1%,具有典型的糯稻特性。黑香糯米品系间的花青素含量差异显著,但其组成相同,含有90%以上的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷,且黑香糯米中富含Ca、Fe、Zn 等多种矿物质营养素,是优质的“富钙米”、“富铁米”、“富锌米”。

综上所述,黑香糯米的营养价值高,根据淀粉特性选择不同的加工方式生产出适合的产品,可推动特种稻的发展。