高效液相色谱-串联质谱法测定黄连中的30种农药残留

侯晓燕

黄连是一味中药，具有清热燥湿、泻火解毒的功效。因黄连在生长过程中受空气、水等因素或者人为用药的影响，不可避免地会出现农药残留的现象。近年来，国家对中药农药残留的监管力度逐年加大，《中国药典》2020年版四部“2341農药残留量测定法”增加了“第五法药材及饮片（植物类）中禁用农药多残留测定法”，这一标准对完善中药农药残留监管体系，保障中药用药安全起着至关重要的作用。由于黄连基质复杂，基质干扰较为严重，因此建立准确、高效的农药残留检测方法非常重要。

本次实验在《中国药典》的基础上，针对黄连液质检测中遇到的苯线磷亚砜目标峰与干扰峰难分离的问题，有针对性地进行系列实验，建立了黄连中30种农药多残留同时分析检测的方法，为黄连中农药残留快速检测提供技术支持。

一、材料和方法

1.仪器和试剂。高效液相色谱-质谱联用仪（型号：Triple Quad 3500），SCIEX；电子分析天平（型号：BCE224I-1CCN），赛多利斯；超纯水仪（型号：Milli-IQ7000），Milli-Q；精密移液器（型号：Prospenser plus），赛多利斯；氮吹仪（型号：MTN-5800），奥特赛恩斯；旋蒸仪（型号：RV10），IKA；乙腈（色谱纯），德国默克；甲酸（色谱纯），阿拉丁；氯化钠（分析纯），科密欧；超纯水，由超纯水仪制得。

2.耗材和对照品。农残混合对照品溶液，Alta；亲水亲油平衡材料固相萃取HLB-A柱（200mg，6mL），纳谱分析技术（苏州）有限公司。

3.样品的提取和净化。取黄连空白基质，粉碎成细粉（过三号筛），取约5g，精密称定。加氯化钠1g，立即摇散，加入预冷的乙腈50mL，匀浆处理2min，离心，分取上清液。剩余沉淀中加入预冷的乙腈50mL，匀浆处理1min，离心，合并两次提取的上清液，减压浓缩至约3-5mL，放冷。用乙腈稀释至10.0mL，摇匀，量取溶液3mL至亲水亲油平衡材料固相萃取HLB-A柱，收集全部净化液，混匀，备用。

精密量取空白基质溶液1.0mL至氮吹仪上，40℃水浴浓缩至约0.6mL，梯度加入混合对照品溶液后加乙腈定容至1.0mL，涡旋混匀。精密加入水0.3mL，混匀，过0.22μm滤膜，取续滤液，上机待测。

精密吸取供品溶液各l.0mL，精密加入水0.3mL，混匀，过0.22μm滤膜，取续滤液，上机待测。

4.检测条件。（1）色谱条件。色谱柱：艾杰尔-飞诺美（货号：00D-4462-AN），十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（10cm×2.1mm，2.6?m）。以0.1%甲酸溶液（含5mmol/L甲酸铵）为流动相A，以乙腈-0.1%甲酸溶液（含5mmol/L甲酸铵）（95：5）为流动相B，流速为0.3mL/min，柱温为40℃，梯度洗脱程序参考《中国药典》2020年版四部“2341农药残留量测定法”第五法。

（2）质谱条件。离子源为电喷雾离子源（ESI源）。正离子多反应监测模式：每个化合物选择2对响应值高的特征离子对作为定量、定性离子对，离子化温度：400℃；离子化电压：3000V；辅助加热器：50μL/min；气帘气：25μL/min；喷雾气：55μL/min；碰撞气：9；CXP：6；EP：10。30种农药的保留时间、监测离子对、锥孔电压、碰撞电压参考《中国药典》2020年版四部“2341农药残留量测定法”第五法附注。

二、结果与讨论

1.色谱条件优化。根据2020版《中国药典》“2341”第五法中推荐的离子对，苯线磷亚砜离子对分别为：320.1-292.1、320.1-233.0、320.1-171.3，检测过程中的突出问题是目标化合物苯线磷亚砜离子对320.1-292.1、320.1-233.0与其结构相似的干扰峰无法实现有效分离，导致该化合物无法定量检测。本次实验通过对色谱条件的优化，实现目标化合物与干扰物的有效分离。

（1）洗脱梯度优化。通过分析目标化合物苯线磷亚砜和干扰峰的出峰时间，发现干扰峰的出峰时间受色谱条件影响较小，因此比较了流动相A：B（75：25）、A：B（80：20）、A：B（85：15）等不同比例下流动相的洗脱效果，目标化合物苯线磷亚砜和干扰峰未实现有效分离，且影响其他29种目标化合物中部分化合物的出峰。

（2）流速条件优化。在液相色谱系统中，流速的变化影响目标峰的出峰时间，但不改变出峰顺序，因此考察了三种不同流速（0.35、0.30、0.20mL/min）下的出峰情况。通过分析图谱可知，流速的改变未实现苯线磷亚砜和干扰峰的有效分离。

（3）柱温条件优化。在液相色谱系统中，柱温的变化也会在一定程度上影响目标峰的出峰时间，因此考察了不同梯度柱温（50、40、30、20℃）下的出峰情况。通过调整柱温，对比目标峰与干扰峰的出峰情况，确定柱温为20℃时，目标峰与干扰峰出现良好的分离效果，结果见图1，其他29种目标化合物出峰正常。

2.方法学研究。（1）线性关系和专属性考察。按上述方法制备一系列标准溶液，对照品溶液添加量分别为10μL、20μL、50μL、100μL、150μL、200μL（以甲胺磷为例，浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、75ng/mL、100ng/mL），上机分析，把空白基质图谱与基质对照品混合溶液最低浓度点图谱对比，确定方法的专属性；建立各组分的标准曲线，线性相关系数r均达到0.99以上，线性关系良好（见表1）。

（2）准确性和灵敏度实验。在黄连空白基质样品中添加适量标样，分别设置40%LOQ、100%LOQ、150%LOQ三个水平的添加质量分数，每个添加质量分数重复3次。40%LOQ中30种农药的平均回收率为66.1%-99.1%，相对标准偏差在0.7%-11.2%，方法的灵敏度良好。三个添加质量分数的平均回收率为64.7%-95.6%，相对标准偏差在2.2%-9.5%，方法的准确性良好（见表1）。

三、结论

本实验采用乙腈提取、固相萃取方式二（HLB）净化、高效液相色谱-串联质谱法柱温20℃检测，建立了黄连中30种农残的检测方法，并对方法的专属性、线性、准确度、灵敏度进行考察。在三个添加水平下，回收率和相标准偏差均满足检测要求，说明本方法灵敏、可靠，为黄连的农药残留检测提供了较为可行的方法。