基于有效性完整表达的白芍质量标志物研究△

韩彦琪，徐佳新，4，许浚*，张立娜，张铁军*

1.天津药物研究院 药物成药性评价与系统转化全国重点实验室，天津 300462；2.天津药物研究院 天津市中药质量标志物重点实验室，天津 300462；3.天津药物研究院 中药现代制剂与质量控制技术国家地方联合工程实验室，天津 300462；4.天津中医药大学，天津 301617；5.河北医科大学第三医院，河北 石家庄 050051

中药质量是保证中药有效、稳定、安全的基础，建立科学合理的中药质量与安全评价体系是促进中医药高质量发展的关键。尽管中药质量控制评价模式在单一指标成分、多成分、体内或体外模型筛选等基础上不断有所创新和完善，但受以往研究工具、研究技术或研究思路等因素的影响及限制，广大研究者对于五味药性理论研究较少，将传统中医药理论与质量评价的关联性研究还有诸多不足[1-3]。2016年刘昌孝院士提出了中药质量标志物（Q-marker）的新概念，其中“有效性”作为Q-marker 的核心要素，强调了传统功效中“药性”和“药效”双重表达的特点，两者作为传统中医药理论的核心概念可体现中药“物质基础”作用于人体疾病主体的不同层面、不同方式的生物效应表达形式，即“性-效-物”三元论的研究思路[4-6]。

白芍为毛茛科芍药属植物芍药Paeonia lactifloraPall.的干燥根，味苦、酸，微寒，归肝、脾经，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的功效，现代药理研究表明其具有抗炎、镇痛、保肝、促进造血功能、抗血栓、神经保护等作用，是风湿类疾病、自身免疫病及肝病治疗中的重要组方药味之一[7-10]。目前对白芍的质量研究多集中于指纹（特征）图谱、一测多评、全成分分析等[11-12]，但从药性方面对白芍进行系统研究尚存留一定空白，化学成分、药理作用与传统中医药理论中的五味药性及中药功效之间的关联性研究尚不完善。因此，本研究以“性-效-物”三元论为研究思路，在高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法（HPLC-Q-TOFMS/MS）辨识化学物质组的基础上，采用基于味觉受体的分子对接技术解析“药性（味）”物质基础，进一步采用网络药理学方法构建其化合物-靶点-通路-药理作用-功效网络，并结合体外抗炎药效筛选模型，确定药效物质基础，进而从有效性完整表达的角度初步解析白芍的Q-markers。

1 材料

1.1 样品

白芍饮片（批号：BS-1）、炒白芍饮片（批号：2003101）购自安徽省亳州市谯城区，赤芍饮片（批号：2001111）购自内蒙古自治区多伦县，经天津药物研究院有限公司张铁军研究员鉴定，符合《中华人民共和国药典》2020 年版规定，于室温干燥贮存。

1.2 细胞

小鼠RAW264.7 单核巨噬细胞系，购自上海生命科学院研究院，用DMEM 高糖完全培养基（含1%双抗和10%胎牛血清）培养于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱，2～3 d传代1次。

1.3 试药

脂多糖（LPS，批号：12190801）、地塞米松（WXBD5583V）均购于美国Sigma 公司；白细胞介素（IL）-6（批号：2105251）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α，批号：2110261）ELISA 试剂盒均购于上海西塘生物科技有限公司；一氧化氮（NO）检测试剂盒（批号：120320210414，上海碧云天生物技术有限公司）；对照品芍药苷、儿茶素、没食子酸、原儿茶酸、山柰酚（批号分别为110736-202044、110877-202005、110831-201906、110809-200604、110861-202013，纯度分别为96.8%、91.5%、91.5%、97.7%、93.2%）均购于中国食品药品检定研究院；芍药内酯苷、芍药苷亚硫酸酯、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、没食子酰芍药苷、五没食子酰葡萄糖（批号分别为P26N11F132310、M21S11S125351、M19S10S97994、J21N10T100881、P08A10S85131、P16M11F113433，纯度分别为91.4%、98.0%、98.0%、98.0%、98.0%、99.0%）均购于上海源叶生物科技有限公司；色谱级甲醇、乙腈和甲酸均购于天津市康科德科技有限公司。

1.4 仪器

ExionLCTM AC 型高效液相色谱仪、Sciex X500R Q-TOF 型液质联用仪器均购于美国AB SCIEX 公司；AB204-N 型万分之一电子天平（德国Meteler 公司）；MCO-5M 型CO2细胞培养箱（日本Olympus 公司）；Spectra Max M5 型酶标仪（美国Bio-Rad）；HFsafe-1200LC 型超净工作台（上海Heal Force公司）。

1.5 软件及数据库

采用Schrödinger 2020 Maestro 12.4 软件、ChemBioOffice 2010 软件、Cytoscape 3.8.2 软件，PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、PDB（https://www1.rcsb.org/）、国家生物技术信息中心（NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/）、UniProt（http://www.uniprot.org/）、中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）、京都基因与基因组百科全书（KEGG，http://www.genome.jp/kegg/）、STRING 10（http://string-db.org/）数据库，Swiss Target Prediction（http://new.swisstargetprediction.ch/）服务器，Omicsbean 在线分析平台（http://www.omicsbean.cn/）。

2 方法

2.1 基于HPLC-Q-TOF-MS/MS 的化学物质组表征和辨识

2.1.1 供试品溶液及对照品溶液的制备 分别取白芍、炒白芍和赤芍粉末各约2.0 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）45 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

取1.3项下对照品适量，精密称定，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成约1 mg·mL–1的混合对照品溶液。

2.1.2 色谱及质谱条件 Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈(A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，5%A；5～22 min，5%～20%A；22～36 min，20%～28% A；36～45 min，28%～48%A；45～48 min，48%～66%A；48～50 min，66%～95%A；50～60 min，95%～100%A）；进样量为5 μL；流速为0.8 mL·min–1；检测波长为230 nm；柱温为25 ℃。

电喷雾（ESI）离子化方式；正、负离子模式扫描，离子扫描范围为50～1000 Da，离子源温度为600 ℃，检测电压为5500 V（正离子模式）、4500 V（负离子模式）；去簇电压为50 V（正离子模式）、–80 V（负离子模式）；碰撞能量为10 V（正离子模式）、–10 V（负离子模式）。

2.2 基于药性（味）的分子对接实验

2.2.1 配体化合预处理 根据化学物质组辨识结果，以白芍解析出的化合物为小分子配体（见增强出版附加材料）。从PubChem数据库下载小分子.sdf格式文件，导入Schrödinger 2020 Maestro 12.4 软件中，进行预处理后用于后续分子对接实验。预处理条件为电场力OPLS3e、不改变小分子离子化状态、保留指定手性、最多产生分子5个。

2.2.2 苦、酸味受体选择及同源建模 研究发现苦味由苦味受体（hTAS2R）基因家族的G 蛋白偶联受体介导，可与呈苦味物质相结合[13-14]，瞬时受体电位多囊蛋白（TRPP）通道家族成员PKD1L3 和PKD2L1 为非选择性阳离子通道，可在特定区域的味觉受体表达酸味并作为酸味受体，产生一系列应答反应[15-16]。本部分实验通过同源模建构建苦味受体，从PDB 下载酸味受体6D1W 晶体结构，Binding Site Detection 计算可能的活性空腔，选择打分最高的空腔生成苦、酸味受体的格点文件，进行分子对接实验。

2.3 基于药效的网络药理学实验

2.3.1 目标化合物选取 结合LC-MS、分子对接结果，选取白芍中主要化学成分、入血成分的同时兼顾各结构类型（包括单萜及其苷类、黄酮类、鞣质类、有机酸类、其他类等）的17 个化合物为研究对象：芍药苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、没食子酰芍药苷、紫苏酸苷、牡丹皮苷I、牡丹皮苷H、牡丹皮苷B、山柰酚、儿茶素、四没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、原儿茶酸、没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯。

2.3.2 靶点预测及蛋白质相互作用（PPI）构建 在TCMSP数据库检索17个化合物的相关靶点信息，同时登录SwissTargetPrediction 服务器，采用反向药效团匹配方法得到化合物虚拟匹配靶点筛选结果，合并2 个数据库结果得到17 个化合物潜在作用靶点。将靶点数据导入STRING 10 数据库中，获得蛋白间相互作用信息（.tsv 格式数据文件），再将其导入Cytoscape软件进行可视化处理，构建PPI网络图。

2.3.3 基因本体（GO）及KEGG 通路富集分析将靶点导入Omicsbean 软件，ID type 设置为Gene Symbol，物种设置为“Homo sapiens”，对靶点蛋白进行细胞组分（CC）、分子功能（MF）、生物过程（BP）及KEGG信号通路分析。

2.3.4 化合物-靶点-通路-药理作用-功效网络构建 将化合物与靶点、靶点与通路、靶点与药理作用、药理作用与功效相互对应关系导入Cytoscape软件中，构建白芍化合物-靶点-通路-药理作用-功效网络关系图。

2.4 基于“药效”的体外抗炎作用实验

2.4.1 白芍提取物对LPS诱导的RAW 264.7细胞上清液中NO、TNF-α、IL-6 的影响 取生长至80%～90%的RAW 264.7细胞，调整细胞密度为5×105个/mL均匀接种于96 孔板，每孔100 μL，在37.5 ℃、5%CO2培养箱培养24 h 后弃上清，按实验分组，每组2 个复孔，空白组加入DMEM 培养基，模型组加入0.1 μg·mL–1的LPS；阳性对照组加入终质量浓度分别为100 μmol·L–1和0.1 μg·mL–1的地塞米松及LPS 混合液；白芍提取液高、低剂量组分别加入200、100 μg·mL–1白芍提取液及0.1 μg·mL–1的LPS混合溶液，以上各孔均加入由100 μL DMEM配制的对应溶液。继续培养24 h 后，取上清液按照试剂盒说明书检测NO、TNF-α和IL-6含量。

2.4.2 化合物对LPS 诱导的RAW 264.7 细胞上清液中NO、TNF-α、IL-6 的影响 细胞铺板，空白组、模型组及阳性对照组处理方法同2.4.1 项下。芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、没食子酰芍药苷、儿茶素、五没食子酰葡萄糖、没食子酸的各化合物高、低剂量组分别加入100 μL 终质量浓度为50、10 μmol·L–1的对应化合物对照品及0.1 μg·mL–1的LPS 混合溶液。各组细胞处理后，培养24 h去上清液，检测各指标含量变化。

2.5 统计学处理

使用GraphPad Prism 5 进行统计分析，以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（Oneway analysis of variance,one-way ANOVA），P<0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 HPLC-Q-TOF-MS/MS 化学物质组表征和辨识结果

通过对照品比对，结合准分子离子、二级碎片离子信息及相关文献分析[11-12,17-20]，分别鉴定出白芍、炒白芍、赤芍药材中42、41、34 个化合物，其中单萜及其苷类分别为27、26、19 个，鞣质类化合物均为5个，多酚及酚酸类化合物均为5个，黄酮类化合物均为2个，有机酸类化合物均为1个，其他类化合物均为2 个，三者的差异成分主要体现在单萜及其苷类。各样品的总离子流色谱图（TIC）见图1，具体成分信息见表1。

图1 白芍、炒白芍、赤芍样品TIC图

3.2 配体化合物与苦、酸味受体分子对接结果

苦味受体阳性配体奎宁与苦味受体hTAS2R10的对接得分为–5.22，白芍中单萜苷类如芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷亚硫酸酯、牡丹皮苷F 和芍药新苷，鞣质类如儿茶素，黄酮类如山柰酚等成分与苦味受体的对接结果均优于奎宁，故推断单萜苷类化合物可能为白芍药材主要苦味物质基础。酸味受体的阳性配体柠檬酸与酸味受体6D1W的对接得分为–5.20，白芍中鞣质类如五没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖及单萜苷类没食子酰芍药苷、酚酸类没食子酸甲酯等成分对接结果皆优于柠檬酸，推断带有没食子酰基的鞣质类化合物可能为白芍主要酸味物质基础，分子对接结果见图2，对接示意图见图3。

图2 白芍化学成分与苦味、酸味受体对接得分

3.3 网络药理学研究结果

3.3.1 化合物潜在靶点分析结果 预测得到17 个化合物共191 个相关靶点，PPI 网络图见图4A，圆节点代表蛋白靶点，圆圈大小和颜色深浅代表靶点蛋白相互作用的紧密程度，对网络进行分析发现，处于网络中心的丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶（Akt1）、白蛋白（ALB）、细胞肿瘤抗原p53（TP53）、白细胞介素-6（IL-6）、血 管内皮生 长因子A（VEGFA）、表皮生长因子受体（EGFR）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）、JUN 原癌基因（JUN）、胱天蛋白酶3（CASP3）、丝裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）、热休克蛋白αA1（HSP90AA1）、前列腺素G/H 合酶2（PTGS2）等靶点拥有较多相互作用关系，degree 值较高，为核心靶点。这些蛋白涉及抗炎、镇痛、保肝、抑制子宫收缩、促进骨髓造血、抗高血压、抑制汗腺分泌等方面，提示白芍发挥养调经、柔肝止痛、平抑肝阳、敛阴止汗机制可能与这些蛋白有关。

3.3.2 生物信息学分析结果 利用OmicsBean 分析软件对相关靶点进行GO 分析，选取P值最小的前10个进行作图呈现（图4B）。结果发现，在CC方面主要涉及胞外空间、细胞外膜结合细胞器、胞外细胞器等过程；在MF 方面主要参与蛋白结合、酶结合、受体结合等过程；在BP方面主要表现在对内源性刺激的反应、单细胞-多细胞生物体过程以及多细胞生物体突起等过程。对潜在靶点进行KEGG 通路富集分析得到165 条通路，通过Omicshare 在线平台对false discovery rate 值前20 的通路进行可视化处理（图4C），其中Rich factor 表示相关基因中位于该通路的基因数目与所有注释基因中位于该通路的基因总数的比值，该值越大代表富集程度越高。

3.3.3 化合物-靶点-通路-药理作用-功效网络构建 根据对应关系在Cytoscape 软件中，构建化合物-靶点-通路-药理作用-功效的网络关系图（图5）。其中包括386 个节点与3493 条边，特征路径长度为1.457，大多数蛋白的联系非常密切，表明该网络具有较快的传播速度和较短的反应时间，具有小世界性质。平均相邻节点数目10.373、网络直径3、网络密度0.013，提示该网络具有无标度、小范围的体系结构，揭示了白芍多成分、多靶点、多通路的作用特点，初步阐释了白芍养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的药效物质基础和作用机制。

3.4 RAW264.7细胞炎症模型实验结果

3.4.1 白芍提取物对细胞NO、TNF-α、IL-6 释放量的影响 与空白对照组比较，模型组中NO、TNF-α、IL-6含量显著升高（P<0.001），见图6。与模型对照组比较，阳性对照组地塞米松在给药浓度为100 μmol·L–1时可显著抑制NO、TNF-α、IL-6 的释放（P<0.001）；白芍提取物高（200 μg·mL–1）、低（100 μg·mL–1）剂量组对NO、TNF-α 的释放均有显著抑制活性（P<0.001），且有一定的浓度梯度依赖性；高剂量组对IL-6 的释放有显著抑制作用（P<0.01）。提示白芍提取物对LPS 诱导的RAW264.7 细胞炎症因子的释放有一定抑制作用。

3.4.2 单体化合物对细胞NO、TNF-α、IL-6 释放量的影响 与空白组比较，模型组中NO、TNF-α、IL-6 含量显著升高（P<0.001），见图7。与模型组比较，阳性药组地塞米松（100 μmol·L–1）可显著抑制细胞上清液中NO、TNF-α、IL-6 的含量（P<0.001）；单体化合物芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷亚硫酸酯、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、没食子酰芍药苷、儿茶素、五没食子酰葡萄糖和没食子酸在浓度为50、10 μmol·L–1时对NO、TNF-α均有显著抑制作用（P<0.05）。芍药苷亚硫酸酯、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、没食子酰芍药苷、儿茶素和五没食子酰葡萄糖在浓度为50、10 μmol·L–1时对IL-6的释放均有显著抑制活性（P<0.05），芍药苷仅在高浓度对IL-6的释放有显著抑制作用（P<0.05）。提示白芍提取物中的主要成分如芍药苷等化合物能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子的表达。

图7 单体化合物对细胞上清液中NO、TNF-α、IL-6释放量的影响（±s,n=2）

4 讨论

中药白芍与赤芍在药性上有所差别，在基原上也有所差异，赤芍除了源于芍药的干燥根之外，还可为川赤芍的干燥根。两者在药理作用与化学成分上有诸多类似，但也有不同之处，研究表明芍药内酯苷在白芍中含量较高是两者最大的差异性成分，因此，在补血和改善造血功能、抗抑郁等方面白芍优于赤芍[21]。白芍药材在通过采收、加工、炮制之后临床效果与应用会出现变化，而这种变化与化学成分在含量上的差别有关，如没食子酸和五没食子酰基葡萄糖的含量在经去皮和水煮的炮制处理后有所增加，而儿茶素有所下降，炒制后芍药苷含量显著降低，且在熏硫后会产生芍药苷亚硫酸酯，其在抗血小板凝聚、松弛平滑肌方面并未具有芍药苷的生物活性，硫黄熏制后的药材使白芍的药用价值大幅度降低[22-23]，因此，在白芍药材的加工过程中应当控制硫黄熏制的过程。本研究采用HPLC-Q-TOFMS/MS 快速辨识了白芍、炒白芍和赤芍化学物质组，辨析三者差异性成分发现，白芍与炒白芍的共有成分较多，牡丹皮苷I及丹皮素F在炒白芍及赤芍中未鉴别出；芍药苷亚硫酸酯及其异构体、异麦角芍药苷、紫苏酸苷、牡丹皮苷H、牡丹皮苷B 在赤芍中未鉴别出；3′,6′-二没食子酰芍药苷在白芍中未鉴别出；其余化合物仅在峰面积上有所差别，其中白芍中芍药内酯苷的峰面积明显大于赤芍。

中药药性理论作为传统中医药理论的核心内容，其科学内涵可以通过本原药性（元药性）和效应药性（能药性）加以概括，除药物本身所具有的性味外，在一定程度上味觉的呈现还取决于与味觉相关联的功能属性[24]。而中药之所以可以发挥功效治愈疾病与其本身具有的功能属性、药理药性密不可分。因此，本研究从有效性的药性（味）及药效角度，解析了白芍性（味）/效物质基础。哺乳动物味觉受体均为G蛋白偶联受体（GPCR），其中，TAS2Rs家族作为GPCR 受体家族，可以识别多种苦味物质，其作为苦味的味觉受体在许多组织中皆有表达[13-14]。研究发现苦味主要化学成分为生物碱、苷类、苦味质三类，但随着后续深入研究发现醌类、黄酮类、挥发油类等也可呈苦味，且苦味药物大多在治疗消化系统疾病、糖尿病、精神类疾病、肝胆疾病、肾脏疾病中发挥重要作用[25-27]。TRPP 通道家族成员PKD1L3 和PKD2L1 起到酸味受体的作用[15-16]，研究发现“酸收”是对酸味药功效的最早概括，酸味药物一般具有收敛、固涩、止汗等作用，酸味入肝，有平息肝火、滋养肝血的功效，能够起到促进肝脏代谢、保护肝脏的作用，并在糖尿病、胃病的治疗中起显著疗效，其化学成分可概括为三类，即有机酸类、鞣质类及生物碱和苷类[28-30]。分析本研究结果发现，白芍中单萜及其苷类、黄酮类及鞣质类成分与苦味受体的对接结果较优，尤其以单萜及其苷类为主。同时，鞣质类、单萜及其苷类、酚酸类及有机酸化合物皆可与酸味受体有很好的结合，其中以带有没食子酰基的鞣质类化合物更为突出。故初步推断单萜及其苷类可能为白芍主要苦味物质基础，而带有没食子酰基的鞣质类化合物可能为白芍主要酸味物质基础。

中医药的特色体现在中药复方在治疗复杂疾病整体上的辨证论治，强调整体性，通过药物的协调配合进而调节机体改善状态，体现其多成分、多靶点、多途径的调控理念。而网络药理学基于疾病-基因-靶点-药物相互作用的基础上，通过网络分析，揭示多分子药物协同作用，这与中医药调控理念具有一致性[31-32]。本研究利用网络药理学的方法对白芍性（味）/效物质基础进行预测分析，探究白芍网络调控机制。分析发现，芍药苷、氧化芍药苷、没食子酰芍药苷、山柰酚、儿茶素、没食子酸、五没食酰葡萄糖等化合物可作用于Akt1、CD14、LBP、PTGS2、VEGFA、ALOX5、NOS3、MAPK8、PTAFR等蛋白靶点，进而调控钙离子信号通路，Wnt、NFκB、花生四烯酸代谢、血管平滑肌收缩、醛固酮的合成和分泌、MAPK 等信号通路，发挥抑制子宫收缩、抗血栓、抑制汗腺分泌等作用；芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、山柰酚等活性成分可作用于IL-6、HSP90AA、JUN、CASP3、PRKCG 等蛋白靶点，调控Toll 样受体、TRP 通道炎症介质调节及TNF 等信号通路进而发挥抗炎、镇痛、保肝作用。鉴于白芍在临床应用、疾病诊疗等方面多与抗炎作用相关，因此选用LPS 诱导的RAW264.7 细胞炎症模型，进一步验证了白芍抗炎物质基础。实验发现，不仅白芍提取物能显著降低炎性细胞NO、TNF-α和IL-6 的释放，同时芍药苷、氧化芍药苷、没食子酰芍药苷、没食子酸等多个单体化合物均能不同程度地抑制炎性因子的表达，具有显著抗炎作用。

综上，本研究通过对白芍化学物质组、真实“滋味”成分、功效成分综合分析，从有效性完整表达角度，初步确定8 个成分，即芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、没食子酰芍药苷、苯甲酰芍药苷、儿茶素、五没食子酰葡萄糖及没食子酸，可作为白芍基于有效性的Q-markers。鉴于Q-marker 确定的“五原则”方法[33]，后续还需基于传递与溯源、特有性、可测性等方面对白芍进行对应分析，进而综合确定其Q-markers。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。