基于网络药理学和分子对接探讨艾迪注射液治疗结直肠癌作用机制研究

曾 炼，杨 桃，陈 江，曹一波，胡文婷，罗字呈，肖天保

(1贵州中医药大学第一临床医学院，贵州 贵阳 550025；2贵州中医药大学第一附属医院肛肠科，贵州 贵阳 550001)

在全球范围内，结直肠癌(colorectal cancer，CRC)的发病率在各类恶性肿瘤中居第三位，也是仅次于肺癌的第二大死因[1]。2022年中国统计报告显示：我国CRC新发人数为592 232例，死亡人数为309 114例，CRC在全球的发病率和死亡率都在不断增加[2-3]。手术治疗是大多数CRC患者的主要治疗方式，对于无法行手术治疗或术后患者多采用化疗[4]，但化疗常常伴有骨髓抑制、肝功能异常、消化系统症状、外周神经功能病变等不良反应，且会延长患者总住院时长，从而降低患者的生存质量[5-7]。随着中医药事业的创新发展，一些中药的制剂被用于治疗CRC，疗效颇为显著，且不良反应低于西药。艾迪注射液中药组成包括人参、斑蝥、黄芪、刺五加，全方具有解毒散结、扶正祛邪的功效[8]，临床广泛用于肺癌、肝癌、大肠癌及胃癌等，可以联合化疗使用以提升患者的免疫力，并降低化学疗法所产生的负面影响，进而改善患者的生活品质[9-10]。然而，艾迪注射液抗CRC的具体机制有待进一步研究。因此，本研究拟采用网络药理学技术结合分子配对方式，探索艾迪注射液抗CRC的药效物质基础及靶标，阐明艾迪注射液抗CRC作用的分子机制。

1 资料与方法

1.1 艾迪注射液有效化学成分收集与筛选

在TCMSP(https：//cmspw.com/tcmsp.php)、TCM-ID数据库[11](https：//www.bidd.group/TCMID/)、中国知网和PubMed上检索艾迪注射液的活性成分。根据口服生物利用度≥30%和类药性(drug-likeness，DL)≥0.18筛选化合物。

1.2 化学成分相关靶点的预测与筛选

成分SMILES号在PubChem数据库[12](https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取，ADME参数利用SwissADME数据库[13](http：//www.swissadme.ch/)进行预测，以药代动力学参数胃肠道吸收度为“High”，DL满足两项以上“Yes”作为筛选标准[14]，进行活性成分筛选。将筛选后的活性成分信息导入SwissTargetPrediction数据库[15](http：//www.swisstargetprediction.ch/)中，对“Probability*”(成分对应靶点的可能性)>0的靶标进行了筛选，确定了其为可能的药物作用靶标。

1.3 CRC相关基因收集

以“colorectal cancer”为关键词，从GeneCards数据库[16](https：//www.genecards.org/)、OMIM数据库[17](https：//www.omim.org/)、DisGeNET数据库[18](https：//www.disgenet.org/)中检索CRC相关靶点。最后，从3个数据库中删除重复项，以获得最终的CRC疾病靶标。当获取结果靶点过多时以筛选Score值大于中位数的靶点作为疾病的潜在靶点。

1.4 构建“艾迪注射液治活性成分作用靶点”网络模型

通过使用Venny绘制网页工具对筛选出的艾迪注射液活性成分目标和CRC目标进行了交集并制作韦恩图，接着利用Cytoscape 3.9.1版本的软件建立了一个“活性成分-作用靶点”的网络模型以展示艾迪注射液对抗CRC的效果。

1.5 构建蛋白质蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络

为了明确艾迪注射液中的成分与CRC疾病目标之间的相互影响，我们将以上获取到的交集目标上传至STRING平台[19](https：//cn.string-db.org/)，以“人源”的种属作为研究对象，建立PPI网络模型图。通过Cytoscape3.9.1软件可视化PPI网络图并筛选出核心靶点。

1.6 靶点功能与通路富集分析

使用Metascape平台[20](https：//metascape.org/)对艾迪注射液与CRC的共同目标基因进行了GO富集分析及KEGG通路分析。根据P值选取GO分析排名前10的条目和KEGG富集分析排名前10的条目进行可视化。

1.7 分子对接

将PPI网络中Degree值前5的靶点作为关键靶点，和“艾迪注射液-活性成分-作用靶点”中前5个活性成分进行分子对接。从PDB数据库(https：//www.rcsb.org/)中下载前5个核心靶基因编码的蛋白质的三维结构作为蛋白质受体。从TCMSP数据库下载艾迪注射液活性化合物的二维结构。将它们引入PyMOL完成脱水和去配体预处理，然后利用AutoDockTools实施加氢操作，配体加氢完成后进行受体与配体的分子对接，对接完成的配体和受体使用PyMOL软件，对其进行可视化并导出可视化图。

2 结果

2.1 艾迪注射液的活性成分和潜在靶点

按照筛选条件，通过数据库检索的成分共51个(斑蝥1个，黄芪20个，人参22个，刺五加8个)，通过文献检索得到16个艾迪注射液活性成分[21-24]。按照筛选标准及SwissADME数据库筛选后共得到成分39个(斑蝥1个，黄芪15个，人参16个，刺五加7个)。其中黄芪和人参均有山柰酚活性成分，槲皮素为黄芪和刺五加共有活性成分(表1)。利用SwissTargetPrediction数据库对39个活性成分进行搜索，筛选与去除重复项后得到684个成分对应的靶点。

表1 艾迪注射液有效活性成分

2.2 疾病和药物共同靶点

检索3个疾病基因数据库，共得到1 792个疾病靶点。将艾迪注射液的潜在作用靶点与CRC疾病靶点导入Venny在线作图软件，绘制成韦恩图，并得到169个交集靶点(图1)。

CRC：结直肠癌。

2.3 艾迪注射液治疗CRC的“活性成分作用靶点”网络图绘制

将艾迪注射液治疗CRC的潜在有效成分和潜在靶点数据导入Cytoscape 3.9.1软件进行网络可视化。该网络图由208个节点、342条边组成(图2)。其中关联度得分较大者为华良姜素、山柰酚、槲皮素、黄芪紫檀烷、异黄烷酮，提示上述成分可能是艾迪注射液治疗CRC的核心成分。

黄色代表艾迪注射液，红色代表药物，绿色代表药物有效活性成分，蓝色代表靶点。

2.4 PPI网络构建

将交集靶点导入STRING平台，创建PPI网络。通过Cytoscape 3.9.1的可视化功能，我们得到了一个网络图，包含168个节点和3 503条边。通过Centiscape 2.2插件对网络进行拓扑分析，计算得到Closeness值0.003 3，Betweenness值139.10，Degree值41.70，按照上述值进行筛选后得到75个节点，1 843条边。图中节点颜色深浅与Degree值有关，颜色越深，节点越大，其Degree值越大，代表该节点在网络中越重要(图3)。通过Cytoscape插件Cytohubba计算排名前5的靶点，分别有TP53、BCL2、AKT1、CCND1、CASP3(表2)。

图3 艾迪注射液对CRC作用靶点PPI网络图

表2 Degree值排名前5的共表达基因拓扑学分析

2.5 GO和KEGG富集分析

在Metascape平台上对交集靶点进行GO功能富集分析，共获得2 141个GO项目，包括1 845个生物过程(biological process，BP)，主要与蛋白质磷酸化、细胞因子的反应、细胞死亡的正调控相关；108个细胞组成(cellular component，CC)，主要与受体复合物、膜筏、磷脂酰肌醇3-激酶复合物和基底质膜相关；188个分子功能(molecular function，MF)，主要与蛋白激酶活性、激酶激活、转录因子结合相关(图4)。根据P值选择前10个项目进行可视化分析。交集靶点经KEGG富集分析后共得到200条调控通路，其中与CRC相关的主要包括癌症通路、PI3K/AKT信号通路、细胞周期、膀胱癌、结核、钙信号通路等通路(图5)。

图4 GO功能富集分析

图5 KEGG通路富集分析

2.6 分子对接验证

使用AutoDock软件在分子水平上将具有最高度值的5种活性成分(华良姜素、山柰酚、槲皮素、黄芪紫檀烷、异黄烷酮)与PPI网络中的5种核心蛋白(TP53、BCL2、AKT1、CCND1、CASP3)对接。分子对接的结合能力越低，表明配体与受体的结合越稳定[25]。其中对接结合能<-17.79 kJ/mol认为配体与靶点之间具有结合活性，结合能<-20.93 kJ/mol表明结合活性较佳[26]。对接结果显示，平均结合能为-22.07 kJ/mol，表明艾迪注射液的核心成分与核心靶点连接性能佳(表3)。其中，华良姜素与TP53(结合能-28.70 kJ/mol)、BCL2(结合能-23.92 kJ/mol)、AKT1(结合能-24.60 kJ/mol)，山柰酚与TP53(结合能-21.45 kJ/mol)、BCL2(结合能-23.92 kJ/mol)、AKT1(结合能-22.37 kJ/mol)，槲皮素与TP53(结合能-23.80 kJ/mol)、BCL2(结合能-19.53 kJ/mol)、AKT1(结合能-19.90 kJ/mol)均有较好的结合活性(图6)。

A：槲皮素与AKT1；B：槲皮素与BCL2；C：槲皮素与TP53；D：华良姜素与AKT1；E：华良姜素与BCL2；F：华良姜素与TP53；G：山柰酚与AKT1；H：山柰酚与BCL2；I：山柰酚与TP53。

表3 关键靶点与有效活性成分对接参数及结合能分数

3 讨论

CRC是消化系统常见肿瘤之一，是我国发病率第五位的肿瘤。CRC根据其症状，中医属于“锁肛痔”“肠蕈”“脏毒”，瘀毒互结是该病的重要病机[27-28]。艾迪注射液全方以斑蝥为君药，辅佐黄芪、人参、刺五加三味药，四味药协同可以清热解毒抗癌，同时也能益气消瘀散结[29]。彭小丹等[30]采用艾迪注射液联合XELOX方案(卡培他滨+奥沙利铂)治疗晚期CRC患者，其研究组(艾迪注射液联合XELOX化疗)的肿瘤标志物(CEA、CA125、CA242)下降程度高于对照组(XELOX方案)，且研究组治疗后Th17比例、Th17/Treg比值高于对照组同期，研究组血管生成指标(VEGF、MVD)下降均高于治疗组，化疗联合艾迪注射液的治疗，可抑制血管生成，有效阻止疾病的进展。

本研究通过网络药理学发现艾迪注射液有效成分39个，所对应靶点684个，其中关联度得分较大者是华良姜素、山柰酚、槲皮素等成分，可能是艾迪注射液发挥抗CRC的重要药效成分。华良姜素是一种黄酮类化合物，广泛存在于黄芪、丁香等中药材中[31]。研究表明，华良姜素能够通过诱导癌细胞的死亡和阻止M2表型肿瘤相关巨噬细胞的活化来展现其抗癌效应[32]，肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中最丰富的先天免疫群体，是促进肿瘤生长和转移的重要细胞[33]。槲皮素为黄芪和刺五加共有活性成分，实验表明，其能减少IL-6和p-STAT3在结直肠组织中的表达，从而抑制结直肠黏膜炎症细胞浸润，减少结直肠道炎症反应，抑制肿瘤的发展[34]。山柰酚为黄芪和人参共有活性成分，是一种天然衍生的黄酮醇，可减少活性氧的产生，其抗氧化和抗炎作用调节癌症的发展和进展[35]。CHO等[36]研究发现山柰酚以剂量依赖(0～60 μmol/L)的方式减少HT-29人结肠癌细胞中的活细胞数量，山柰酚通过下调CDC2C抑制CDC1/cyclin B25复合物的激活，导致G2/M细胞周期停滞。

通过PPI拓扑分析及Degree值筛选结果可知，TP53、BCL2、AKT1是Degree值排名前三的靶点蛋白，推测可能是艾迪注射液发挥抗CRC的核心靶点。转录因子p53是一种关键的抑癌因子，可调节多种细胞反应以防止癌症发展。约43%的CRC发生TP53突变，发生突变的TP53其蛋白结构改变，失去抑癌作用，促进癌细胞增殖、侵袭和转移，从而促进癌症进展，可作为肿瘤恶性程度的重要参考指标[37-38]。BCL2是一种抗凋亡蛋白，促生存BCL2蛋白的异常高表达与各种癌症的发展和预后不良相关，此外，BCL2的过表达使恶性和未转化细胞对以TP53依赖性方式杀死细胞的各种抗癌药物具有显著抗性[39-40]。AKT1也称为AKT激酶，作为PI3K/AKT/mTOR信号通路的介质，在一系列细胞过程中起重要作用，可触发许多生物过程，包括细胞存活生长、糖代谢、血管生成，并刺激细胞的恶性转化和肿瘤进展[41-42]。

根据KEGG通路富集分析结果显示，癌症、PI3K/AKT、膀胱癌等信号通路是艾迪注射液抗CRC的主要通路。PI3K/AKT信号通路与癌症的发生发展密切相关，是各种类型癌症的主要信号通路，通过调节其下游效应子，促进肿瘤细胞发生和增殖[43]。姚红等[44]通过RNA测序和分析发现，华良姜素对细胞凋亡相关基因的mRNA表达有影响，可能通过PI3K/AKT信号通路等代谢途径对HepG2细胞有抑制作用，主要是下调了TEK、PIK3CG、JAK3等与癌细胞凋亡相关的差异基因。有研究表明山柰酚可以通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路，从而减轻与炎症依赖性途径相关的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的细胞凋亡[45]。同时，也有证据表明，当山柰酚与5-氟尿嘧啶结合使用时，它们可能会通过压制PI3K/AKT信号传导路径而触发肿瘤细胞的死亡，导致细胞周期的暂停，最后实现对抗肿瘤的效果[46-47]。YANG等[48]通过实验发现，槲皮素处理后的HT-29人结肠癌细胞中AKT和CSN6蛋白表达水平显著下调，进一步验证了槲皮素诱导促凋亡信号转导通路，从而抑制HT-29人结肠癌细胞的细胞活力，诱导细胞凋亡并导致细胞周期停滞。

分子对接结果表明，艾迪注射液治疗CRC的5种重要成分与5个核心蛋白之间具有良好的结合能力。其中华良姜素与5个核心蛋白结合能均较高。可能表明华良姜素是艾迪注射液治疗CRC的核心成分。目前活性成分华良姜素治疗CRC的相关研究较少，有待进一步挖掘其证据。

综上所述，艾迪注射液中的华良姜素、山柰酚、槲皮素等成分，通过TP53、BCL2、AKT1、CCND1、CASP3等靶蛋白影响癌症的通路、PI3K/AKT信号通路，从而发挥治疗CRC的作用。为临床上应用艾迪注射液治疗CRC实验进一步提供理论依据。