胆汁酸通过调控HOXB7促进胃黏膜肠化生

林可昕，姚 诺，赵行雨，曲晓东，李学志，李嵩博，董 强，王 娜，时永全

(国家消化系统疾病临床医学研究中心，消化系肿瘤整合防治全国重点实验室，空军军医大学西京消化病医院，陕西 西安 710032)

胃黏膜肠化生(gastric intestinal metaplasia，GIM)是一种常见的胃癌前病变。肠型胃癌的发生发展遵循Correa模型，即正常胃黏膜发生浅表性胃炎，持续炎症刺激下发生慢性萎缩性胃炎、GIM、异型增生，最终进展为胃癌。临床研究表明，胆汁反流是胃癌及癌前病变的独立危险因素[1-2]。胆汁酸是胆汁的主要成分，其中最丰富的是脱氧胆酸(deoxycholic acid，DCA)和鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)。有研究发现，DCA能够诱导GIM，并促进胃癌的发生和进展[3]。DCA可显著上调HNF4A在胃上皮细胞中的表达，而胃黏膜上皮细胞特异性的HNF4A转基因小鼠在DCA诱导后可出现GIM表型[4]。DCA通过上调c-Myc表达，增强端粒酶活性并促进胃癌进展[5]。上述研究只能部分解释DCA诱导GIM和促进胃癌进展的作用，仍需进一步研究进行其他的机制探索。

HOXB7属于同源盒转录因子HOX家族。HOX家族分为A～D四个簇，在胚胎发育过程中参与调控消化道吻尾轴的形成。HOXB7表达改变被认为与癌症恶性表型密切相关，能够促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭，并抑制凋亡[6-10]。在Barrett食管及食管腺癌中，HOXB7表达增高，通过影响组蛋白修饰和染色质压缩程度，在早期阶段启动肿瘤转录程序的改变[11]。近年来有研究证实，HOXB7在胃癌组织中的表达较癌旁组织增强，并与患者不良预后相关[8，12]。

CDX2是肠道分化的关键转录因子。在正常的消化道中，CDX2仅表达于下消化道。但在GIM组织中，CDX2的表达显著升高。研究表明，CDX2的异常激活和过表达可以直接促进GIM的发生。HOXB7和CDX2均为消化道吻尾轴形成的关键分子，我们推测，HOXB7可能通过调控肠型标志分子CDX2等的表达，直接参与了GIM的形成。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织样本 在空军军医大学西京医院内镜中心收取14例GIM患者的GIM组织及配对正常胃黏膜组织。研究方案符合人体试验伦理学标准，得到空军军医大学西京医院医学伦理委员会的审核批准(许可证号：KY20202100-F-1)，并且受试者知情同意。

1.1.2 实验动物 6周龄C57BL6小鼠购自空军军医大学实验动物中心，实验经空军军医大学实验动物福利与伦理委员会批准(许可证号：20220481)。

1.1.3 细胞与试剂 永生化胃上皮细胞系、胃癌细胞系、肠上皮细胞系(赛柏康，中国)；胎牛血清(IC-1905，InCellGene，美国)；培养基及孵箱(Thermo，美国)；RNA提取试剂盒(AG21023，艾科瑞，中国)；反转录试剂(AG11706，艾科瑞，中国)；qRT-PCR试剂(CM0139，艾科瑞，中国)；Western blotting试剂及仪器(Bio-Rad，美国)；HOXB7过表达质粒(吉凯，中国)；HOXB7siRNA(吉玛，上海)；Attractene Transfection Reagent(301005，Qiagen，德国)。Western blotting一抗：anti-CDX2(#12306，CST，美国)、anti-MUC2(#ab133555，Abcam，英国)、anti-KLF4(#4038，CST，美国)、anti-HOXB7(#12613-1-AP，Proteintech，美国)和anti-β-actin(#AP0060，Bioworld，美国)；Western blotting二抗(ZB2306，中杉金桥，中国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 永生化胃上皮细胞系GES-1，胃癌细胞系BGC-823、HGC-27、NCI-N87，正常肠上皮细胞系FHC、NCM-460，均使用含100 mL/L胎牛血清和10 mL/L青霉素-链霉素的RPMI1640或DMEM培养基培养，培养条件为37 ℃、50 mL/L CO2。

1.2.2 细胞转染及细胞感染 待细胞融合度达50%时，按照Qiagen转染试剂说明书配置转染混合物，加入6孔板中。孵箱培养4～6 h后换为完全培养基。HOXB7过表达质粒：CMV enhancer-MCS-SV40-puromycin。HOXB7siRNA：正义链CCCAGAACAAACUUCUUGUTT，反义链ACAAGAAGUUUGUUCUGGGTT。转染48 h后收取细胞RNA及蛋白，用于后续检测。

1.2.3 RNA提取及qRT-PCR检测 细胞RNA按照艾科瑞公司总RNA提取试剂盒(AG21023)说明书提取。组织RNA使用TRIzol法提取。使用Biodrop分光光度计测定RNA浓度，并按照艾科瑞反转录试剂盒(AG11706)说明书进行反转录。qRT-PCR体系按照艾科瑞SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒(AG11701)说明书配置。仪器使用CFX96TMReal-Time PCR Detection system(Bio-Rad Laboratories，美国)，结果通过2ΔΔCq法计算分析。

1.2.4 总蛋白提取及Western blotting 细胞使用RIPA裂解，并加入1∶100的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，超声粉碎、离心，加入1/5的上样缓冲液煮沸变性后进行检测。Western blotting使用Bio-Rad仪器及相关试剂进行。

2 结果

2.1 胆汁酸诱导HOXB7在GIM细胞模型中表达上调

使用DCA对胃上皮细胞GES-1进行诱导以建立GIM细胞模型。Western blotting结果显示，DCA以浓度依赖(图1A)和时间依赖(图1B)的方式诱导肠型标志分子CDX2和MUC2表达上调，提示GIM细胞模型构建成功。qRT-PCR检测结果表明，DCA能以浓度依赖(P<0.01，图1C)和时间依赖(P<0.01，图1D)的方式显著诱导HOXB7mRNA在GIM细胞模型中的表达。Western blotting显示，HOXB7在GES-1细胞中呈微弱表达；受DCA诱导后，HOXB7的蛋白表达水平在2 h即出现明显上调；DCA对HOXB7蛋白的表达诱导效应呈浓度依赖(图1A)和时间依赖(图1B)。

A：Western blotting检测不同浓度DCA处理的GES-1细胞中HOXB7及肠型标志分子的蛋白表达水平；B：Western blotting检测100 μmol/L DCA处理不同时间的GES-1细胞中HOXB7及肠型标志分子的蛋白表达水平；C：qRT-PCR检测不同浓度DCA处理的GES-1细胞中HOXB7 mRNA水平；D：qRT-PCR检测100 μmol/L DCA处理不同时间的GES-1细胞中HOXB7 mRNA水平。DCA：脱氧胆酸。bP<0.01。

2.2 HOXB7在胃癌及肠上皮细胞系中表达水平高于永生化胃上皮细胞GES-1

qRT-PCR结果显示，HOXB7在胃癌细胞系BGC-823、HGC-27、NCI-N87及正常肠上皮细胞系FHC、NCM-460中表达水平远高于永生化胃上皮细胞GES-1(P<0.01，图2A)。Western blotting结果显示，在蛋白水平上，HOXB7在多数胃癌细胞系及正常肠上皮细胞系中的表达高于GES-1细胞系，且在胃癌细胞系BGC-823、HGC-27中表达最高(图2B)。

A：qRT-PCR检测各细胞系中HOXB7的mRNA表达水平；B：Western blotting检测各细胞系中HOXB7的蛋白表达水平。bP<0.01 vs GES-1。

2.3 HOXB7在肠黏膜和GIM组织中表达水平高于正常胃黏膜组织

为探究HOXB7是否具有肠道高表达特征，我们取正常C57BL6小鼠的食管、胃、肠黏膜组织，利用qRT-PCR检测HOXB7的mRNA表达水平。结果表明，HOXB7在大肠黏膜组织中表达水平最高，胃黏膜组织次之，食管黏膜组织中表达水平最低(P<0.05，图3A)，呈吻尾轴表达模式。

A：qRT-PCR检测小鼠消化道黏膜组织中HOXB7的mRNA表达水平(P<0.05)；B：qRT-PCR检测14例GIM组织及其配对正常胃黏膜组织中HOXB7的mRNA表达水平(bP<0.01)。GIM：胃黏膜肠化生。

为明确HOXB7在GIM组织中的表达情况，我们收集14例GIM患者的GIM组织及其配对正常胃黏膜组织，检测其中HOXB7的mRNA表达水平。结果显示，HOXB7在GIM组织中的表达水平显著高于配对正常胃黏膜组织(P<0.01，图3B)。由此提示，作为肠道发育因子的HOXB7可能参与了GIM发生的调控。

2.4 HOXB7促进肠型标志分子在胃上皮细胞中的表达

根据各细胞系HOXB7本底表达情况，我们选择GES-1细胞系及胃癌BGC-823和HGC-27细胞系进行功能验证实验。在转染HOXB7过表达质粒后，肠型标志分子CDX2及MUC2的mRNA和蛋白表达水平在GES-1细胞中显著上调(P<0.05，P<0.01，图4A)。利用特异性siRNA分别敲低HOXB7在BGC-823和HGC-27细胞中的表达，CDX2和MUC2的表达水平在BGC-823细胞中显著下调(P<0.01，图4B)，CDX2和KLF4的表达水平在HGC-27细胞中显著下调(P<0.01，图4C)。以上结果说明，HOXB7能够促进多种肠型标志分子在胃上皮细胞中的表达。

A：在GES-1细胞中过表达HOXB7，qRT-PCR和Western blotting检测HOXB7、CDX2和MUC2的mRNA和蛋白表达水平；B：在BGC-823细胞中敲低HOXB7，qRT-PCR和Western blotting检测HOXB7、CDX2和MUC2的mRNA和蛋白表达水平；C：在HGC-27细胞中敲低HOXB7，qRT-PCR和Western blotting检测HOXB7、CDX2和KLF4的mRNA和蛋白表达水平。aP<0.05，bP<0.01。

2.5 敲低HOXB7能够减弱DCA对肠型标志分子的表达诱导作用

为探究HOXB7是否参与了胆汁酸对GIM的诱导，我们利用HOXB7特异性的siRNA敲低HOXB7在GES-1细胞中的表达，并用100 μmol/L DCA对细胞进行诱导处理24 h。qRT-PCR检测结果表明，DCA能够显著升高HOXB7(P<0.01)、CDX2(P<0.01)和MUC2(P<0.05)在GES-1细胞中的mRNA表达水平，但联合转染HOXB7siRNA能大幅减弱DCA对上述分子的表达诱导作用(图5A)。Western blotting检测结果显示，敲低HOXB7也在一定程度上减弱了DCA对CDX2和MUC2的蛋白表达诱导作用(图5B)。

A：qRT-PCR检测HOXB7及肠型标志分子的mRNA水平；B：Western blotting检测HOXB7及肠型标志分子的蛋白水平。DCA：脱氧胆酸。aP<0.05，bP<0.01。

3 讨论

胃癌是全球第五大癌症。根据世界卫生组织2020年全球癌症统计报告，胃癌发病率排名第五，死亡率排名第四[13]。现广泛应用的Lauren组织学分类根据腺体结构将胃腺癌分为弥漫型和肠型[14]，肠型腺癌是胃癌最常见的病理类型。GIM作为肠型腺癌癌前病变，是肠型胃癌发生过程中的重要环节。幽门螺杆菌感染是胃癌及癌前病变的主要致病因素。但WONG等[15]发现，在已经存在癌前病变的患者中，根除幽门螺杆菌治疗并不能降低胃癌的发病率，提示应重视胃癌的其他致病因素。

胆汁反流是胃癌及癌前病变的独立危险因素。胆汁酸已被证实与胃癌及癌前病变密切相关[16]。甘氨鹅脱氧胆酸和DCA通过c-Myc促进胃癌细胞增殖、抑制细胞凋亡，并激活端粒酶活性[5]。牛磺脱氧胆酸通过激活IL-6/JAK1/STAT3通路促进GES-1细胞增殖，促进癌前病变及胃癌的发生[17]。胆酸能够上调RGM-1细胞CDX2及CINC1表达，使细胞发生GIM转变[3]。CDCA上调miR-92a-1-5p，通过靶向FOXD1进而上调CDX2促胃上皮细胞GIM[18]。然而上述研究只能在部分程度上解释胆汁酸促进GIM的机制，仍需要进一步探索其他分子在其中的作用。

HOXB7是HOXB家族的成员。HOXB7能增强结直肠癌DNA修复，促进细胞存活[6]。HOXB7可通过激活MAPK通路促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭[8]，也可通过PIK3/AKT通路增强胃癌细胞的恶性生物学特性[12]。另外，近年来有研究表明，HOXB7能够促进Barrett食管的发生，并可能通过组蛋白翻译后修饰和染色质压缩程度影响基因表达，成为食管腺癌发生的潜在启动因素[11]。HOX家族成员和CDX2都是调控消化道吻尾轴形成的关键分子，它们在正常情况下高表达于下消化道，但不表达于上消化道。大量研究表明，CDX2在胃上皮细胞的异常激活和过表达是GIM形成的重要机制。那么，HOXB7是否也参与了GIM的发生调控呢？

在本研究中，我们首先利用GES-1细胞构建了GIM模型。我们发现在DCA的诱导下，HOXB7呈浓度依赖性及时间依赖性上调。同时在HOXB7上调的过程中，还伴随着CDX2、KLF4和MUC2等肠型标志分子的上调。这提示在胆汁酸诱导的GIM模型中，HOXB7表达增高，并可能参与肠型标志分子的表达调控。之后我们检测了胃癌细胞系及正常肠上皮细胞系HOXB7的表达情况。HOXB7在肠上皮细胞中的表达水平显著高于胃上皮细胞。而胃癌细胞中HOXB7表达增高，提示HOXB7的增加可能赋予了胃上皮细胞肠型特征，驱动胃癌的发生。另外，在小鼠食管-胃-小肠-大肠黏膜组织中，HOXB7在食管和胃中表达低，在大肠中表达最高。这种差异可能意味着HOXB7与肠道表型密切相关，HOXB7有可能参与GIM甚至胃癌的发生。为了在临床样本中检验HOXB7与GIM的关系，我们检测了HOXB7在14例GIM患者的GIM组织及配对正常胃黏膜组织中的表达，结果显示HOXB7在肠化组织中表达水平远高于正常组织。细胞生物学的研究表明，在GES-1细胞中过表达HOXB7能促进肠型标志分子CDX2和MUC2的表达，而在BGC-823或HGC-27细胞中敲减HOXB7则可降低CDX2、MUC2或KLF4的表达水平。挽救实验证实，敲低HOXB7能减弱DCA对多种肠型标志分子的表达诱导作用。由此提示，HOXB7参与了DCA对肠型标志分子的诱导调控。

综上所述，本文证实了HOXB7在DCA诱导的GIM中的关键作用。HOXB7在GIM细胞模型和GIM黏膜组织中表达增高，HOXB7能调控肠型标志分子CDX2、KLF4及MUC2的表达，敲低HOXB7能显著减弱DCA对肠型标志分子的表达诱导作用。进一步探讨HOXB7参与GIM发生的机制，可为逆转GIM进而预防胃癌提供新思路。