母乳低聚糖与婴幼儿健康关系研究进展

姜毅康 刘鸿飞 潘丽娜,2 胡一波 彭喜洋 康文丽 彭小雨 汪家琦 李 威 董 玲

母乳含有婴儿生长发育所需的全部营养,通常被称为人类生命最初几个月营养的“黄金标准”[1]。母乳中含有大量生物活性成分,如免疫球蛋白、激素、低聚糖等,非常适合婴幼儿尚未发育成熟的消化及免疫系统。其中母乳低聚糖(human milk oligosaccharides,HMOs)在婴幼儿消化系统及免疫调节中发挥着重要作用[2]。HMOs约占母乳中碳水化合物总量的20%[3],其含量仅次于乳糖和脂肪[4]。研究[5]表明,HMOs对婴儿的健康成长及发育有益,例如,HMOs可作为可溶性配体类似物抑制不同病原体与细胞表面受体的结合,从而保护母乳喂养的婴儿免受不同病原体的感染。HMOs还可作为共生细菌的益生元[3,6],维持肠道微生态平衡,调节免疫系统,以及促进婴幼儿大脑发育等[7-8]。

文章拟综述HMOs结构特征、生理功能的研究成果,并总结HMOs的应用现状,以期为开发及设计新型婴幼儿食品提供理论依据。

1 母乳低聚糖的结构及含量

目前已有超过200种HMOs的结构被确定[9-10],每个HMOs分子包含3～14个单糖,通常为直链或支链结构[1]。HMOs核心结构由5种基础单糖组成:3种单糖,D-葡萄糖(Glc)、D-半乳糖(Gal)和L-岩藻糖(Fuc);一种氨基糖,N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和一种酸性单糖,N-乙酰神经氨酸(Sia)[11](如图1)。在HMOs分子还原末端有一个乳糖残基,乳糖通过β-1,3或β-1,6糖苷键连接半乳糖β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰氨基乳糖延伸糖链;糖链可以由岩藻糖或唾液酸进一步修饰,从而形成HMOs结构多样性[12-13]。一些HMOs还存在同分异构体形式,如乳酰-N-岩藻糖基五糖和唾液酸基乳酰-N-四糖[14]。根据其末端结构不同,可分为中性岩藻糖基化的HMOs、中性非岩藻糖基化的HMOs和酸性或唾液酸化的HMOs 3种类型[15]。

图1 主要HMO的分子结构图[8]

王艳菲等[1]通过对HMOs种类鉴定及含量测定后发现,母乳中含量较多的HMOs主要为2′-岩藻糖基乳糖(2′fucosyllactose,2′-FL)、3′-岩藻糖基乳糖(3′-fucosyllactos,3′-FL)、乳糖-N-四糖(lacto-N-tetraose,LNT)、乳糖-N-新四糖(lacto-N-neotetraose,LNnT)、3′-唾液酸乳糖(3′-sialyllactose,3′-SL)和6′-唾液酸乳糖(6′-sialyllactose,6′-SL)。为了更好贴合婴幼儿胃肠道微生物菌群变化,HMOs含量在哺乳期内会随着婴幼儿的生理需求的变化而变化。早产母亲成熟乳中总HMOs质量浓度为10～20 g/L,整体要高于足月分娩的母亲[15]。母乳中HMOs质量浓度在整个哺乳期呈下降趋势,初乳中HMOs质量浓度最高,为20～23 g/L,成熟乳(产后11 d～9个月母乳)中HMOs质量浓度下降至12～14 g/L[16];但Plows等[17]研究表明,母乳中2′-FL、唾液酸内酯-N-四糖b和二唾液酰基-乳糖-N-四糖的含量在哺乳过程中几乎不发生变化;3′-FL和3′-SL在哺乳过程中的含量分别显著增加了10倍和2倍。母乳中HMOs的类型及其平均质量浓度,具体见表1。

表1 HMOs的类型[18]

2 母乳低聚糖的功能

2.1 调节肠道菌群组成

母乳低聚糖进入人体后,可以抵抗胃酸、消化酶水解和胃肠道吸收;大部分HMOs直接进入小肠和结肠被一些微生物发酵成短链脂肪酸,从而形成肠道酸性环境,而肠道中的低pH环境有利于其他有益双歧杆菌菌株的生长[18-19]。例如:HMOs通过共生细菌的选择性消费来塑造婴儿肠道微生物群的组成[6,20-21],其中双歧杆菌和拟杆菌通过特定的糖苷酶消化和利用HMOs,岩藻糖基化或唾液酸基化HMOs可为代谢这些化合物的细菌提供了选择性定殖优势[22-24];而大多数致病性肠杆菌无法利用糖苷酶,无法将HMOs作为食物来源[19,25]。

在母乳喂养的婴儿肠道中,双歧杆菌丰度更大,以双歧杆菌为主的肠道微生物群比用配方奶粉喂养的婴儿更常见[26];而配方奶粉喂养的婴儿肠道微生物群组成更复杂,与成人的肠道微生物群相似,以兼性厌氧菌(如拟杆菌和梭菌)为主,其次是葡萄球菌、链球菌和肠杆菌科[27]。De Leoz等[28]收集纯母乳喂养的婴儿第1周到第13周的粪便,粪便中HMOs含量从第1周到第13周逐渐降低,粪便中的优势菌群从链球菌变化为拟杆菌和双歧杆菌;到第13周,拟杆菌被双歧杆菌取代,双歧杆菌在粪便细菌群中占主导地位。研究表明,粪便中的双歧杆菌含量与HMOs含量有明显的负相关关系,双歧杆菌属能够利用HMOs在肠道内定殖。Bondue等[29]研究表明,双歧杆菌和粗双歧杆菌能够利用3′-SL进行生长,补充3′-SL的无细胞培养可以降低大肠杆菌O157:H7和伤寒沙门氏菌血清型中毒力基因的表达。

由此可见,HMOs有利于婴幼儿肠道中益生菌的定殖和增殖,不会导致有害菌的增殖,因而可以调节婴幼儿体内的肠道菌群的组成。

2.2 预防病原性感染

HMOs是母乳免疫成分的重要组成部分,可以保护婴儿免受病原体的侵害。除了通过为非致病性共生菌提供竞争优势来直接控制病原体外,HMOs还通过发挥抗黏附抗菌剂的作用来直接减少微生物感染[30-31]。大多数病原微生物,如空肠弯曲杆菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、志贺氏菌和沙门氏菌菌株的毒力往往取决于其黏附于宿主肠道上皮表面的能力[32]。例如:Morrow等[33]关于93对母乳喂养的母婴研究表明,2′-FL含量与空肠弯曲杆菌腹泻及各种原因的中重度腹泻的发生率呈显著负相关,LDFH-I(乳糖-N-新霉素六糖)与杯状病毒腹泻发生率呈显著负相关;母乳低聚糖与母婴喂养婴儿腹泻之间的相关性在整个母乳喂养过程中持续存在,但在母乳喂养终止后没有相关性,表明婴儿胃肠道中存在的母乳低聚糖可以抑制病原体结合。

(1) 阻止致病菌的黏附和定殖。产肠毒素的大肠杆菌和尿路致病性大肠杆菌通过红细胞识别并结合肠上皮细胞表面聚糖,唾液酸化的HMOs对产肠毒素的大肠杆菌和尿路致病性大肠杆菌介导的血凝作用有很明显的抑制作用,从而阻止其黏附和定殖[34]。Angeloni等[35]评估了大肠杆菌在宿主肠道上皮细胞表面黏附的改变结果表明,与对照组细胞相比,经过3′-SL诱导的上皮细胞表面糖链的变化导致大肠杆菌黏附减少了90%。HMOs可能有糖基化作用,调节肠上皮细胞表面糖基化合物的表达,使细菌不能与表皮上特定多糖位点结合,从而抑制细菌与表皮细胞的黏附,阻止其定殖及扩散[15,36]。Manthey等[37]研究表明,肠致病性大肠杆菌(enteropathogenicEscherichiacoli,EPEC)是一种肠道上皮细胞附着的病原体,可导致严重腹泻,也会导致婴儿高死亡率;从母乳中分离出的HMOs显著减少了EPEC对上皮细胞的附着,乳鼠试验结果也表明HMOs显著减少了EPEC的定殖。

(2) 阻止病原体与受体结合。岩藻糖基化和/或卵球形HMOs可以捕获病毒并参与阻断凝集素受体,HMOs阻断的病毒凝集素受体不能参与识别宿主细胞表面存在的糖原,从而阻止其黏附和定殖[5]。这也可以解释为什么通过母乳喂养母婴传播HIV的效率低,80%～90%的婴儿没有感染;研究[8,38-39]表明,包膜糖蛋白gp120促进HIV与人类树突状细胞上的DC-SIGN(树突状细胞特异性ICAM3抓取非整合素)的结合,DC-SIGN通过黏膜筛选环境中潜在的病原体;虽然DC-SIGN与gp120上的高甘露糖型聚糖结合,但是其对Le血型抗原具有更高的亲和力;在母乳喂养的婴儿中,黏膜表面覆盖着高浓度的HMOs,HMOs含有Le血型抗原,并在体外与gp120竞争结合DC-SIGN,阻断HIV-1-gp120与DC-SIGN的结合,从而阻止HIV通过DC-SIGN进入,降低感染风险。

在大肠中,双歧杆菌发酵HMOs后主要产物为醋酸、丁酸和丙酸,其可以降低肠道内pH值[40]。低pH值不利于致病菌的生长,因此也起到了抑菌作用[36]。此外,Kuntz等[7]研究表明,HMOs通过改变生长相关的细胞周期基因,减少细胞生长,诱导培养的人类肠上皮细胞分化和凋亡。

HMOs的抗粘连抗菌作用并不限于细菌和病毒,也适用于某些原生动物寄生虫[41]。例如,赤痢变形虫,它会导致阿米巴痢疾或阿米巴肝脓肿;赤痢变形虫需要附着在宿主的结肠黏膜上,体内测定结果表明一些HMOs显著降低赤痢变形虫的附着[42]。这些研究结果都表明,HMOs具有调节病原体—宿主相互作用的能力。

2.3 免疫调节作用

新生儿免疫系统尚未发育完全,母乳喂养可以帮助婴幼儿增强抵抗力[43],降低疾病感染的概率,而HMOs在其中发挥着重要作用。

HMOs能通过调节肠道菌群的构成或刺激肠上皮细胞的免疫反应,从而保护宿主免受病毒感染[14]。研究表明HMOs可在局部黏膜相关淋巴组织的细胞中发挥作用,刺激机体产生免疫物质,从而提高机体免疫能力,1%的HMOs被吸收后可以到达全身循环[44]。Liu等[45]研究HMOs对β-Lg诱导牛奶过敏的小鼠模型的免疫调节结果表明,2′-FL降低了血清IgE和β-Lg特异水平IgE,并显著增加了抗炎细胞因子IL-10、TGF-β和IFN-γ的水平,可以缓解过敏症状。Eiwegger等[46]报道,唾液酸化的HMOs可刺激T细胞成熟,促进T细胞反应转化为更平衡的Th1/Th2细胞因子的产生和低水平的免疫;一些唾液酸化的HMOs对预防过敏可能有一定的作用。

某些岩藻糖基化的HMOs,可激发巨噬细胞活性,促进其分泌免疫物质[47]。Sprenger等[48]发现,与对照组相比,喂食含2′-FL及LNnT奶粉的婴儿一年内患下呼吸道疾病的次数更少,对抗生素的需求也更低。与配方奶粉喂养的婴儿相比,HMOs有助于降低母乳喂养婴儿上呼吸道和泌尿感染的发生率[8]。无乳链球菌(group BStreptococcus,GBS)会导致新生儿败血症和脑膜炎[49],多人研究[50-52]表明,HMOs对无乳链球菌(group BStreptococcus,GBS)有明显的抗菌活性,而不依赖于宿主免疫。

2.4 预防坏死性小肠结肠炎

HMOs有助于降低炎性疾病的发生率,如坏死性小肠结肠炎(necrotising enterocolitis,NEC)。NEC是早产儿最常见和最具破坏性的肠道疾病之一,其原因主要为肠道屏障受损、免疫不成熟和肠道微生物失调[53]。新生儿科的进步提高了早产婴儿和低出生体重婴儿的存活率,也导致越来越多的婴儿面临NEC风险[54]。早产低体重婴儿的NEC发生率为5%～10%[14],死亡率超过25%,即使通过医学手段治愈,存活者也会面临长期的神经并发症[5]。研究[55]表明,NEC发病率在配方奶喂养的婴儿中是母乳喂养婴儿的6～10倍。

Huang等[56]研究表明,3′-SL和6′-SL通过抑制TLR4/NF-κB通路的激活,可以有效缓解NEC缺氧诱导的损伤。Autran等[57]从体外组织培养、动物模型体内研究及母婴队列研究的数据分析得出,HMOs在预防NEC的发生上起着重要作用。Autran等[58]以患有NEC的小鼠为对象研究表明,喂养含HMOs配方奶小鼠的存活率显著高于喂养含低聚半乳糖配方奶的小鼠,HMOs可有效降低患上NEC的风险。Sodhi等[59]研究表明,2′-FL和6′-SL这两种HMOs可以与TLR4的LPS结合位点相互作用(如图2所示),在小鼠和仔猪模型中预防NEC。

图2 2′-FL、6′-SL及乳糖(LAT)与TLR4-MD2复合物对接[59]

2.5 促进大脑发育

婴儿大脑的快速发育对饮食营养的供给提出了特别高的要求,尤其是对早产儿。唾液酸(sia)是脑神经节苷脂和聚唾液酸链的组成成分,其中聚唾液酸链对神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM) 起到修饰作用;NCAM在细胞间的相互作用、神经元生长、修改突触连接和记忆形成中发挥重要作用[60]。研究[61]表明,在仔猪饲料中添加唾液酸可以影响NCAM的基因表达,并提高学习和记忆能力。唾液酸化的HMOs是母乳中唾液酸的主要来源,因此唾液酸化的HMOs在促进婴儿大脑发育方面发挥着重要作用;岩藻糖基化的HMOs(如2′-FL)对婴儿的大脑发育也表现出积极的影响[62]。Oliveros等[63]给哺乳期大鼠幼鼠口服2′-FL,并在其4～6周龄及1岁时进行经典行为测试,结果表明,尽管两组动物在刚断奶时表现出相似的行为,但口服2′-FL的大鼠在1岁及成年后均表现出更强的认知能力,说明哺乳期补充2′-FL可增加儿童及成年期的认知能力。Berger等[64]研究发现在婴儿1个月大时,母乳喂养的频率越高,婴儿的认知能力就越强,这是由于其摄取了更多的2′-FL;但在婴儿6个月大时开始母乳喂养,并未观察到类似的相关性,表明早期接触2′-FL可能对提高婴儿的学习和记忆更为重要,而且这种益处可能会持续到成年。HMOs还可以促进代谢产物的产生,从而支持婴儿的认知发育。在体外试验中,2′-FL增加了肠道拟杆菌和乳酸菌的丰度,从而增加了短链脂肪酸的产生,而短链脂肪酸是大脑信号传递的底物[19]。

3 母乳低聚糖的开发与应用

HMOs对婴儿的益处已经得到了广泛验证,因此如何开发利用HMOs成为当下研究热点。到目前为止,只要少数短链HMOs可用,需要提供更复杂和支链的HMO。通过离心、沉淀、分级提取和各种色谱方法从母乳中提取HMOs既耗费时间也存在伦理问题,低聚糖作为商业食品添加剂[65],以母乳为原料几乎可以排除在外。目前,HMOs主要通过化学合成法、酶促合成法、化学酶合成法、微生物发酵法[66]。

(1) 化学合成法。可以合成四糖～八糖等15种不同结构的HMOs,岩藻糖基化产生了岩藻糖乳糖和二岩藻糖醛酸、LNnT和LNT、LNFP I或LNFP III,化学唾液酸化也产生了一些唾液酸化的HMO。通过化学合成生产HMOs的成本高,产量低(20%～55%)。

(2) 酶促合成法。糖基转移酶(GTs)和糖苷水解酶(GHs)两类酶被用于合成低聚糖,可以制备20多种HMOs,包括2′-FL、3′-FL、LNT、LNnT、3′-SL、6′-SL、DSLNnT等。这种方法可以比化学方法获得结构更复杂的HMOs,合成的效率也相对较高;但是通过酶促方法获得的HMO结构的多样性会受到底物特异性和糖苷酶可用性的限制。

(3) 化学酶合成法。在这种方法中,使用所需底物的化学合成,然后进行酶促延伸和修饰;可以合成3-FL、LNT、LNT II、具有或不具有岩藻糖基化和/或唾液酸化的双天线和不对称多天线HMOs等,可以实现毫克级的制备。

(4) 微生物发酵法。可在合适的重组微生物宿主生物中建立生物合成体系。尽管没有原核微生物能天然产生HMOs,但也可以由现有的代谢途径提供,例如非致病性大肠杆菌菌株等宿主生物体中;通过重组细菌细胞的全细胞生物转化可以制备2′-FL、3′-FL、LNT、LNnT、LNFP I、3′-SL和6′-SL等HMOs[67]。当前已实现工业化生产的HMOs有2′-FL、3′-FL、LNT、LNnT、3′-SL、6′-SL等[55]。

当前欧盟已经批准2′-FL、LNnT、LNT、3′-SL和6′-SL应用到婴幼儿配方食品中,美国、新加坡及澳新已允许在婴幼儿配方食品中添加2′-FL和LNnT,韩国、菲律宾及马来西亚也已批准在婴幼儿配方食品中添加2′-FL。且部分国外公司已经推出含有HMOs的婴幼儿配方奶粉。对于不能母乳喂养的婴儿,HMOs的有益特性让添加HMOs的婴幼儿配方奶粉成为一个极具吸引力的选择。Marriage等[68]通过临床试验发现,婴儿在喂养含有0.2 g/L及1 g/L 2′-FL的婴幼儿配方奶粉4个月后,其生长发育情况和母乳喂养婴儿无显著差距。Puccio等[69]针对6个月大婴儿的研究表明,含有2′-FL(1 g/L)和LNnT(0.5 g/L)的婴儿配方是安全且耐受良好的,与喂养不含有HMO成分的配方奶粉的对照组相比支气管炎和下呼吸道发病率降低。因此,含HMOs的婴幼儿配方奶粉不仅支持免疫和食道健康,在成分和功能上也更接近于母乳。

4 总结与展望

母乳低聚糖(HMOs)作为母乳中一类活性成分,对婴幼儿的健康成长有着至关重要的作用,关于HMOs的研究也取得了长足的进步。然而,许多关于HMOs代谢和健康益处、生物合成的问题仍未得到解答,以及确认观察到的效果能否转化为新生儿可衡量的健康益处仍需要深入研究。未来关于HMOs如何在人类乳腺中合成及其对母乳喂养婴儿的有益影响的深入研究十分必要,有助于开发新的策略和技术来生成和应用复杂的HMOs混合物,进一步指导如何将HMOs作为婴儿配方奶粉的补充剂。

鉴于母乳低聚糖的工业化生产,全细胞生物转化是现阶段提供母乳低聚糖作为食品添加剂的最有前途的选择,其合成的效率和产率仍需要提高,以满足未来食品工业食品添加剂的需求。随着对细胞培养肉的日益关注,利用哺乳动物细胞培养法合成HMOs也引起了行业的关注;未来,内源性HMOs生物合成的策略和获得HMOs的所有其他方法将被系统的考虑,以提供应对当前挑战的解决方案。

由于受环境、基因、个体差异的影响,母乳中HMOs的分布与含量差异很大。未来有必要建立中国HMOs数据库,根据中国母乳实际情况制定适合的添加量及配比,为中国婴幼儿量身打造精确化的乳粉营养配方,开发更适合中国婴幼儿成长发育的功能健康食品。