保健食品中新型双醋酚汀衍生物的发现、合成与鉴定

夏金涛 吴婉琴 朱松松 江 丰

随着生活水平的提高,肥胖现象呈逐年上升的趋势。肥胖不仅影响个人形象,还会导致高血压、糖尿病等心血管疾病的发生[1]。由于药物减肥存在作用机制明确,见效快的特点,近年来,在保健食品中非法添加西药成分的情形频频发生[2-9]。针对这种现象,国家食品药品监督管理局和国家市场监督管理总局先后发布了8个补充检验标准,涉及39种减肥类非法添加物的检测[10]。但这些检验标准仅能对靶向目标物进行分析,针对的物质种类和数量明显偏少,存在漏检现象。一些不法商家利用这一漏洞,在暴利的驱使下,开始向减肥类食品基质中添加补充检验标准监管以外、国家明令禁止的西药成分的结构衍生物[11-15]。由于这些新型结构衍生物的毒理药理学作用机制及服用剂量尚不明确,消费者在不知情的情况下服用后将会对健康和生命安全造成严重的威胁。同时,这些新型结构衍生物未经批准而非法应用于食品中,给执法部门的监管带来了巨大挑战。

双醋酚汀是一种临床上常用的轻泻剂类药物,在肠道内经肠液碱解产生刺激性更强的酚汀,从而加速肠道的蠕动而发挥导泻作用。近年来,双醋酚汀作为减肥类非法添加物在食品中常被检出[16]。为鉴别食品中非法掺杂双醋酚汀等化合物的不当行为,国家市场监督管理总局已发布了BJS202209《食品中双醋酚丁等19种化合物的测定》补充检验方法对其进行检测。由于在食品中添加新型化学物质的隐蔽性强,该法远不能满足实际检测的需要,如最近已有双酚沙汀在果味型果冻中被检出的报道[17]。研究拟通过高分辨质谱对市售及网购的24批次明示或暗示具有减肥功效的食品进行筛查,在2批次果冻中发现了一种未见能获批作为食品添加剂的新型双醋酚汀类衍生物,经同位素质谱图、二级质谱图、核磁共振波谱图解析及从头合成策略比对分析研究,确证该新型非法添加物,以期为监管部门及时做到快发现、早预防提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

薄层层析硅胶板:TLC Silica gel 60 F254,德国默克公司;

wilmad核磁管:5 mm,湖北热安科技有限公司;

柱层析硅胶:37～48 μm,青岛海洋化工厂;

微孔滤膜:0.45 μm,天津津腾实验设备有限公司;

果味型果冻等:网购;

氘代氯仿CDCl3:D含量99.8%,美国CIL公司;

氘代二甲亚砜DMSO-d6:D含量99.8%,美国CIL公司;

乙腈:色谱纯,德国默克公司;

甲酸:质谱纯,美国 Fisher Scientific 公司;

三苯甲基四(五氟苯基)硼酸盐:纯度98%,上海阿拉丁试剂有限公司;

5-氯靛红(纯度98%)、吡啶(纯度99.5%)、苯酚(纯度≥99.5%):上海麦克林生化科技有限公司;

6-氯靛红:纯度99.82%,上海皓鸿生物医药科技有限公司;

双醋酚汀:纯度98%,天津阿尔塔科技有限公司;

其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

超高效液相色谱仪:ExionLCTMAD型,上海爱博才思分析仪器贸易有限公司;

高分辨质谱仪:Triple TOF TM 5600+型,上海爱博才思分析仪器贸易有限公司;

全数字化超导核磁共振波谱仪:AVANCE Ⅲ型,600 MHz,德国Bruker公司;

高效液相色谱仪:Waters e2695型,美国Waters公司;

套装加热型磁力搅拌器:MS-H280-Pro型,北京大龙兴创实验仪器有限公司;

匀质机:D-500型,北京大龙兴创实验仪器有限公司;

旋转蒸发仪:Hei-Vap Expert ML型,德国Heidolph公司;

超声辅助萃取仪:S 180H型,德国Elma公司;

电子天平:ME 204型,精度0.000 1 g,瑞士Mettler Toledo公司;

去离子水发生器:Milli-Q型,美国Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 高分辨质谱分析

(1) 供试品溶液制备:称取 1.0 g供试样品,用剪刀剪碎于50 mL比色管中,加入30 mL乙腈,40 ℃超声辅助萃取15 min,冷却,用乙腈定容至50 mL,静置5 min,取上清液过0.45 μm滤膜,备用。

(2) 色谱条件:流动相A为含0.1%甲酸—水溶液,B为乙腈;流速0.3 mL/min;进样体积5 μL;柱温40 ℃;色谱柱C18色谱柱(100 mm×2. 1 mm,1.7 μm);梯度洗脱程序:0～2 min,5% B;2～14 min,5%～95% B;14～17 min,95% B;17～20 min,5% B。

(3) 质谱条件:采用电喷雾离子源(ESI源)正离子扫描模式采集数据;离子源温度550 ℃;电喷雾电压5 500 V;雾化气压力和辅助气压力均为344.7 kPa;气帘气压力241.3 kPa;去簇电压60 V;碰撞能量35 V;碰撞能量范围±15 V;扫描范围:一级质谱50～1 100 Da,二级质谱50～1 100 Da。

1.2.2 NMR结构分析

(1) 供试品制备:取约100 g样品于1 000 mL塑料量杯中,用匀质机搅碎,分3次用300 mL乙腈超声辅助萃提10 min,抽滤。滤液浓缩富集后,经柱层析色谱纯化(V乙酸乙酯∶V石油醚为35∶65)得到分析物约25 mg,经高效液相色谱分析纯度≥99%。

(2) 核磁测试条件:锁场温度298 K;1H-NMR脉冲序列zg30;谱宽(SWH)9.6 kHz,观察道中心频率偏置(O1P)4.8 kHz;13C-NMR脉冲序列zgpg30,谱宽(SW)120 kHz,观察道中心频率偏置(O1P)60 kHz;HSQC和HMBC分别采用HSQCEDETGPSISP2.3和HMBCGPLPNDQF标准脉冲程序,采样数据点阵均为t2×t1=2 048×256,累加次数32。

1.2.3 双醋酚汀疑似结构的从头合成 参照图1,根据文献[18]的方法进行疑似结构中间体I的合成。

图1 双醋酚汀类似物的从头合成技术路线

1.2.4 数据处理 质谱数据采集在Analyst TF 1.8.1 Software上进行;非靶向筛查在Library View上进行;数据分析在PeakView®2.2上进行;质谱数据处理在Origin 9.0上进行;NMR数据通过Topspin 3.5 pl 7采集,谱图处理在Mestrenova 14.0上完成。

2 结果与分析

2.1 减肥类保健食品中非法添加物筛查

应用HRMS筛查条件,通过Triple TOF的IDA模式对24批次减肥类保健食品进行筛查,结果在2批次果冻制品中发现了一种未见报道的新型双醋酚汀类衍生物。测试条件下,该新型化合物的出峰时间为10.693 min(图2)。对双醋酚汀与其新型衍生物的同位素质谱图分析发现,与双醋酚汀的同位素质谱图(图3)相比,新型衍生物质荷比436.09峰面积与质荷比438.08峰面积之比约为3∶1、质荷比437.10峰面积与质荷比439.09峰面积之比也约为3∶1,结合氯元素的天然同位素35Cl和37Cl丰度比为3∶1,推测未知非法添加物可能含有氯原子取代。对双醋酚汀与其新型衍生物的二级质谱图(图4)分析发现,将新型衍生物母离子质荷比436.09、子离子质荷比300.04/258.03/230.03与双醋酚汀母离子质荷比402.13、子离子质荷比266.08/224.07/196.07比对,新型衍生物比双醋酚汀相对分子质量多34,表明该新型衍生物疑似为双醋酚汀的单氯取代物。但氯原子在双醋酚汀上的取代位置经质谱不能明确分析得出,因此有必要借助核磁测试明晰化合物的结构。

图2 双醋酚汀类似物的非靶向筛查总离子

图3 双醋酚汀及其类似物5-Cl双醋酚汀的一级同位素质谱图

图4 双醋酚汀及其类似物5-Cl双醋酚汀的二级质谱图

2.2 疑似物的核磁谱图分析

取双醋酚汀和供试样品各约15 mg,用DMSO-d6溶解,上机检测。结果表明,疑似物的1H NMR和13C NMR分别为1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ11.00(s,1H),7.41(d,J=2.1 Hz,1H),7.33(dd,J=8.3,2.2 Hz,1H),7.23～7.18(m,4H),7.15～7.09(m,4H),7.01(d,J=8.3 Hz,1H),2.25(s,6H);13C NMR(151 MHz,DMSO)δ178.0,169.6,150.2,140.8,139.0,135.2,129.6,129.2,126.8,126.4,122.5,112.2,62.0,21.3。经与双醋酚汀的1H NMR对比(图5),从氢谱中可见δ11.00(s,1H)为活泼NH;从δ7.41(d,J=2.1 Hz,1H),7.33(dd,J=8.3,2.2 Hz,1H)与7.01(d,J=8.3 Hz,1H)的耦合裂分情况判断这3个氢原子为同一自旋体系;δ2.25(s,6H)为乙酸酐上的甲基信号;通过将1H NMRδ7.23～7.18(m,4H),7.15～7.09(m,4H)信号和13C NMRδ129.2,122.5的信号强度与双醋酚汀的13C NMR对比,可知疑似物的氯原子取代应发生在吲哚啉骨架5号或6号位,其具体位置通过核磁手段还无法确定。由于疑似物的合成步骤并不繁琐,因此通过从头合成策略对参照物进行制备,通过核磁氢谱比对来精准确证化合物的结构。

图5 双醋酚汀及其类似物5-Cl双醋酚汀的1H NMR和13C NMR谱图

2.3 疑似物的从头合成

参照1.2.3方法对5-氯双醋酚汀和6-氯双醋酚汀进行合成,得到5-氯双醋酚汀0.80 g,核磁数据与2.2的一致;6-氯双醋酚汀0.75 g,其核磁数据及质谱数据为1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ11.02(s,1H),7.35(d,J=8.1 Hz,1H),7.24～7.16(m,4H),7.16～7.09(m,5H),7.01(d,J=2.0 Hz,1H),2.26(s,6H);13C NMR(151 MHz,DMSO-d6)δ178.3,169.6,150.1,143.3,139.1,133.4,132.1,129.5,128.0,122.5(重合),110.8,61.4,21.3。HRMS(ESI):理论计算值C24H19NO5Cl[M+H]+:436.094 6;实际测试值:436.095 8。经与疑似物进行核磁氢谱比对(图6)发现,5-氯双醋酚汀与疑似物氢谱完全一致,而6-氯双醋酚汀与疑似物氢谱差别明显。因此,疑似物的精细结构被确证为5-氯双醋酚汀。

图6 疑似物提取物与合成的5-氯双醋酚汀、6-氯双醋酚汀的1H NMR对比图

2.4 疑似物的谱学特征和谱峰归属

结合核磁共振二维谱,将5-氯双醋酚汀和双醋酚汀的结构式及原子编号列于图7,波谱学数据特征及原子归属见表1。由表1的一维(1H NMR、13C NMR和DEPT135)、二维核磁数据(HSQC、HMBC)可知,5-氯双醋酚汀和双醋酚汀的氢谱和碳谱化学位移基本保持一致。由于5-氯双醋酚汀5号位存在氯原子取代,基于氯原子的诱导吸电子和共轭给电子效应,碳原子的化学位移略向低场移动,符合客观规律。

表1 双醋酚汀和5-氯双醋酚汀的核磁数据及归属†

图7 双醋酚汀和5-氯双醋酚汀的结构式

3 结论

通过对双醋酚汀的质谱裂解规律分析,利用Triple TOF系统的IDA模式,一针进样即可对化合物的同位素质谱图和二级质谱图进行分析,确认疑似物为单氯代双醋酚汀。通过核磁共振波谱确证疑似物的单氯代发生在吲哚啉苯环骨架5或6号位上,缩小了精准识别的范围。进一步通过从头合成策略对疑似物的可能结构进行制备,最终凭借氢谱比对确证了疑似物为5-氯双醋酚汀。试验建立了食品中非法添加物精准识别确证的鉴定方法,并在两份样本中检测出国家标准中未纳入的非法添加物5-氯双醋酚汀,需要引起相关部门的关注和重视。