基于MTT比色和响应面法优化侧孢短芽孢杆菌最大活菌数培养条件

宋 鹏 李理想 赵 彪 王泽乐 孙兴鑫

侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)是一种可产芽孢的兼性厌氧细菌,具有广谱抑菌活性[1],可产生抗菌肽、蛋白酶、几丁质酶、芽孢菌胺、肽类抗生素、聚酮化合物等物质[2],在植物抗逆促生[3]、降解重金属[4]、改善根际微生态环境[5]和抑制食源性致病菌[6]等方面效果显著,具有较高的应用价值。MTT商品名为噻唑蓝,其作用于活细胞线粒体中的呼吸链,可以形成蓝紫色结晶甲臜,使用二甲基亚砜溶解后,测定溶液吸光值可以间接反映活细胞数量。有研究[7-8]表明,在107～109CFU/mL细胞浓度范围内,吸光值与活细胞数成正比。利用MTT比色法检测细胞活性灵敏度高、成本低廉、操作简便,主要用于药物对体外培养细胞的毒性测定及细胞活性的测定[9-10]。菌株传统优化方法主要为线性回归分析和正交试验,其回归精度低,不连贯,而响应面法可以弥补以上不足[11-12],具有周期短、精度高的优点,被广泛应用于食品、生物、化工等领域。

目前,微生物培养以活菌数为测定指标的研究多采用比浊法,利用分光光度计测定菌液吸光值,然后通过标准曲线计算得出[13]。这种方法虽然快速简便,但是无法区分细菌是否存活,结论有一定的误差。而利用MTT比色法测定微生物活菌数并进行发酵条件优化的研究尚未见报道。研究拟以侧孢短芽孢杆菌活菌数为研究对象,建立MTT比色法测定发酵液活菌数的标准曲线,通过响应面法对培养基成分和发酵条件进行优化,以期为微生物活菌制剂发酵工艺优化及规模生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

侧孢短芽孢杆菌HA-2:CGMCC NO. 24130,河南科技大学农学院特色生物资源开发与利用实验室;

琼脂粉、胰蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、牛肉膏、硫酸铵、蛋白胨、硝酸铵、氯化钙、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、磷酸二氢钾、噻唑蓝、二甲基亚砜、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等:分析纯,国药集团化学试剂有限公司;

基础培养基:10 g/L胰蛋白胨,5 g/L酵母粉,10 g/L NaCl,初始pH 7.0;按2%接种量接种至装有30 mL基础培养基的三角瓶中,9层纱布封口,摇床转速160 r/min,30 ℃培养18 h;

MTT溶液:配制pH 7.2、0.2 mol/mL的PBS缓冲液,121 ℃灭菌15 min待用;称取0.5 g MTT用PBS缓冲液定容至100 mL,121 ℃灭菌15 min,现配现用,-4 ℃避光保存。

1.2 仪器与设备

酶标仪:Infinite E Plex型,瑞士Tecan公司;

高速冷冻离心机:5810R型,德国Eppendorf公司;

高压灭菌锅:SX-700型,日本TOMY公司;

洁净工作台:SW-CJ-1BU型,苏州安泰空气技术有限公司;

恒温培养振荡器:ZWYR-D2403型,上海智城分析仪器制造有限公司;

生化培养箱:TPH-160S型,宁波莱福科技有限公司;

pH计:PP60型,德国Sartorius公司。

1.3 试验方法

1.3.1 MTT比色法及与平板计数法线性关系的确定

将5 mL侧孢短芽孢杆菌菌液加入35 mL生理盐水中,4 ℃、3 500 r/min离心10 min,去除上清液。重复此清洗过程一次后,将离心所得菌泥复溶于5 mL生理盐水中,制成菌悬液。取100 μL菌悬液于96孔板中,每个样品重复6次,每孔加入20 μL MTT溶液静置培养5 h,吸弃上清液,每孔加入150 μL二甲基亚砜,低速振荡10 min,测定570 nm处菌液的吸光值[14]。

分别制备菌数为1×106,5×106,1×107,5×107,1×108,5×108,1×109CFU/mL的侧孢短芽孢杆菌菌悬液10 mL于试管中。每支试管摇匀后平均分为A和B两管。A管采用MTT比色法测定菌液的吸光值,将其作为线性拟合方程中的自变量,B管稀释后涂布于基础培养基琼脂平板,统计活菌数,将其作为线性拟合方程中的因变量,进而建立MTT比色法与平板计数法的相关回归方程。

1.3.2 单因素试验 从基础培养基成分及发酵条件出发,利用MTT比色法测定各单因素试验发酵液吸光值[15]。分别考察碳源(葡萄糖、可溶性淀粉、果糖、麦芽糖)、氮源(硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨、硝酸铵)和无机盐(氯化钙、氯化镁、硫酸镁、氯化钾)对侧孢短芽孢杆菌活菌数的影响。在最佳碳源、氮源及无机盐的基础上,分别研究碳源添加量(0～18.0 g/L)、氮源添加量(0～16.0 g/L)和无机盐添加量(0～0.33 g/L),确定最佳培养基成分及其添加量。分别考察初始pH(3.5～10.5)、发酵温度(24～39 ℃)、接种量(1.0%～8.0%)和磷酸二氢钾添加量(0.5～7.5 g/L)对侧孢短芽孢杆菌活菌数的影响,确定最佳发酵条件。

1.3.3 响应面优化

(1) Plackett-Burman试验:选取影响侧孢短芽孢杆菌活菌数的7因素为自变量,发酵液中活菌数为响应值,选用N=12的Plackett-Burman设计。各因素选取高(+1)和低(-1)两个水平,筛选显著影响因子。

(2) 最陡爬坡试验和Box-Behnken试验:通过Plackett-Burman试验结果中多个显著影响因子的系数值确定步长及方向,其因素系数值为正值选取高水平,负值选取低水平,以活菌数结果的最大值作为Box-Behnken试验起始中心点。以Plackett-Burman试验筛选出的显著因子作为自变量,发酵液中侧孢短芽孢杆菌活菌数为响应值,设计多因素多水平的响应面试验,建立多元二次回归数学方程拟合自变量与响应值之间的函数关系,获得侧孢短芽孢杆菌活菌数的最佳发酵参数。

1.3.4 验证实验 通过响应面试验获得的理论最佳发酵条件培养18 h进行验证,得到的侧孢短芽孢杆菌活菌数平均值与理论最大值进行比较,验证模型的可靠性。

1.4 数据分析

使用IBM SPSS 22.0软件进行显著性分析和方差分析,采用Design-Expert 10软件进行响应面分析,采用Origin 2021软件作图。

2 结果与分析

2.1 MTT比色法与平板计数法的线性关系

由图1可知,侧孢短芽孢杆菌菌悬液浓度与活菌数的线性回归拟合方程为y=3.113 5x-0.128 8,相关系数为0.999 7,说明MTT比色法与平板计数法结果具有非常显著和强的线性相关性,能够准确、快速反映侧孢短芽孢杆菌的活菌数,同时表明MTT比色法具有较好的实用性和可行性,可用于后续侧孢短芽孢杆菌活菌数的测定,与高琼[16]的研究结果相似。

图1 MTT比色法与平板计数法的线性关系

2.2 单因素试验

2.2.1 碳源 由图2可知,以麦芽糖为碳源时,侧孢短芽孢杆菌活菌数显著高于其他碳源的(P<0.05)。当麦芽糖添加量为0～10.0 g/L时,活菌数随麦芽糖添加量的增加逐步增加,当麦芽糖添加量为10.0～18.0 g/L时,侧孢短芽孢杆菌活菌数逐渐下降,可能与麦芽糖呈微弱酸性有关,过多的麦芽糖会导致发酵液pH降低,不利于微生物生长。这与吴丽媛[17]的结果一致,因此选择麦芽糖最佳添加量为10.0 g/L。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.2.2 氮源 由图3可知,蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵和硝酸铵可以促进侧孢短芽孢杆菌快速繁殖。以蛋白胨为氮源时,活菌数达最大值3.72×108CFU/mL。随着蛋白胨添加量的升高,侧孢短芽孢杆菌活菌数缓慢上升,当添加量为8.0～10.0 g/L时活菌数最大,但无显著性差异,随后活菌数开始下降,与陈丹霞等[18]的结果相似。这可能是蛋白胨为微生物提供氮源、碳源、维生素、生长因子等营养物质,可以促进侧孢短芽孢杆菌的生长繁殖。综上,选择8.0 g/L为最佳蛋白胨添加量。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.2.3 无机盐 由图4可知,氯化钾、氯化钙、硫酸镁和氯化镁可促进侧孢短芽孢杆菌的生长繁殖,其中氯化钙的促进作用最为显著,较氯化镁提升了76.88%(P<0.05)。随着氯化钙添加量的增加,侧孢短芽孢杆菌活菌数显著增加。当氯化钙添加量为0.17 g/L时,其对侧孢短芽孢杆菌活菌数的促进效果最佳,与李茂琳等[19]的研究结果一致。其原因可能与Ca2+的存在改变侧孢短芽孢杆菌的细胞膜通透性,调节细胞内部物质交换、酸碱度和渗透压有关。因此,选择0.17 g/L氯化钙为最佳无机盐添加量。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.2.4 发酵温度 由图5可知,当发酵温度为24～34 ℃时,侧孢短芽孢杆菌活菌数逐渐上升,与侧孢短芽孢杆菌在低温条件下菌株生长受到抑制有关。当发酵温度为34～39 ℃时,侧孢短芽孢杆菌活菌数逐渐下降,可能是由于侧孢短芽孢杆菌胞内热敏性酶活性降低,导致代谢受阻。范海延等[20]发现侧孢短芽孢杆菌的最佳培养温度为30～35 ℃。因此,选择最佳发酵温度为34.5 ℃。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.2.5 接种量 由图6可知,当接种量为1.0%～6.0%时,侧孢短芽孢杆菌活菌数随接种量的提高而增加,当接种量为6.0%时,侧孢短芽孢杆菌活菌数最大可达3.73×108CFU/mL。当接种量>6.0%时,发酵液中初始菌体密度偏高,营养消耗过快,活菌数随接种量的增加而减少,与杨旭等[21]的研究结果一致。因此,选择6.0%为最佳接种量。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.2.6 初始pH 由图7可知,升高初始pH可促进侧孢短芽孢杆菌活菌数增加,当pH为7.5时,侧孢短芽孢杆菌活菌数最大。而在偏碱性(pH 9.5～10.5)和偏酸性(pH 3.5～4.5)条件下,侧孢短芽孢杆菌活菌数的生长繁殖均受到抑制。刘蒲临等[22]发现侧孢短芽孢杆菌的最佳pH为6.0～8.0。因此,选择最佳发酵初始pH为7.5。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.2.7 磷酸二氢钾 由图8可知,当磷酸二氢钾添加量为0～3.5 g/L时,侧孢短芽孢杆菌活菌数逐渐增加;当添加量为3.5 g/L时,侧孢短芽孢杆菌活菌数达最大值(2.27×108CFU/mL),较优化前提高了12.38%(P<0.05)。当添加量>3.5 g/L时,侧孢短芽孢杆菌活菌数减少。磷酸二氢钾作为缓冲物质,在微生物发酵过程中对发酵液pH起缓冲作用,利于侧孢短芽孢杆菌的生长繁殖,与卜雯丽等[23]的结果相同,其最佳添加量不同可能与不同菌株因其自身特性对发酵培养基成分及发酵条件具有一定的选择性有关。因此,选择3.5 g/L为磷酸二氢钾最佳添加量。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.3 响应面优化

2.3.1 Plackett-Burman试验 根据微生物生长所需营养成分的基本特点,结合前期单因素试验,分别选取麦芽糖、蛋白胨、氯化钙、磷酸二氢钾添加量及发酵条件中发酵温度、接种量和初始pH作为试验因素。各因素设2个水平见表1,试验设计及结果见表2。

表1 响应面试验因素与水平

表2 Plackett-Burman试验设计及结果

由表3可知,X1、X3、X6和X7是构建模型的主要影响因素(P<0.05),因此选择X1、X3、X6和X7进一步进行优化试验。

表3 Plackett-Burman试验显著性分析†

2.3.2 爬坡试验 为了逼近X1、X3、X6和X7的最大响应区域,根据表3设计爬坡试验方案,试验结果见表4所示。在试验3条件下,侧孢短芽孢杆菌活菌数最高为8.13×108CFU/mL,因此选择试验3条件作为试验中心点。

表4 爬坡试验结果

2.3.3 Box-Behnken试验 为确定X1、X3、X6和X7的交互作用,进行四因素三水平响应面试验,试验因素水平见表5,试验设计及结果见表6。

表5 Box-Behnken试验因素水平

表6 Box-Behnken试验设计及结果

采用Design-Expert 10软件进行响应面回归过程数据分析,建立二次响应面回归模型,得到二次多项式回归方程:

(1)

表7 响应面结果的方差分析†

2.4 响应面结果分析

由图9可知,氯化钙与磷酸二氢钾之间交互作用较其他交互作用最弱。当麦芽糖分别与氯化钙、初始pH及磷酸二氢钾交互作用,随着氯化钙添加量、初始pH及磷酸二氢钾添加量的变化,麦芽糖的最佳添加量为9 g/L左右,氯化钙添加量、初始pH及磷酸二氢钾添加量分别为0.11～0.16,7.3～7.7,3.2～3.9 g/L;当氯化钙与初始pH交互作用时,氯化钙添加量与初始pH对活菌数影响成反比;当初始pH与磷酸二氢钾交互作用时,活菌数极值点出现在初始pH为7.3～7.8,磷酸二氢钾添加量为3.5 g/L或磷酸二氢钾添加量为3.2～3.9 g/L,初始pH为7.5的范围内。由表7中F值可知,各因素对侧孢短芽孢杆菌活菌数的影响强弱为X1>X3>X7>X6,两因素间除X3X7外,均对活菌数的影响显著,两因素间的正负效应大小依次为X3X6、X1X6、X1X3、X6X7、X1X7、X3X7。

图9 各因素交互作用的响应面图

2.5 验证实验

使用Design-Expert 10软件分析得到各显著因子的最佳组合为麦芽糖添加量8.75 g/L、氯化钙添加量0.17 g/L、初始pH 7.07、磷酸二氢钾添加量3.73 g/L,此条件下模型预测侧孢短芽孢杆菌活菌数最高为8.25×108CFU/mL。在此基础上重复3次试验,测得侧孢短芽孢杆菌活菌数为(8.12×108±0.64) CFU/mL,为预测值的98.42%,表明该模型能够很好地预测实际活菌数。

3 结论

以侧孢短芽孢杆菌活菌数为研究对象,通过MTT比色法与平板计数法测定建立了相关回归方程。结果表明,侧孢短芽孢杆菌菌悬液浓度与活菌数之间具有良好线性关系(R2>0.999),可用于侧孢短芽孢杆菌活菌数的测定。侧孢短芽孢杆菌培养基成分及发酵条件的最佳组合为麦芽糖添加量8.75 g/L、氯化钙添加量0.17 g/L、初始pH 7.07、磷酸二氢钾添加量3.73 g/L,优化后发酵液中活菌数为8.12×108CFU/mL,较优化前提高了3.02倍。后续将对侧孢短芽孢杆菌产抗菌肽、蛋白酶、几丁质酶等方面开展研究。