动物源性食品中酰胺醇类药物残留检测研究进展

张振宇 崔海燕 王 勇

酰胺醇类药物作为广谱抗菌药被广泛应用于动物的抗菌治疗,常用的酰胺醇类药物有氯霉素(chloramphenicol)、甲砜霉素(thiamphenicol)和氟苯尼考(florfenicol)[1]。由于酰胺醇类药物半衰期较长,进入人体后难以通过消化系统排出[2]。氯霉素和甲砜霉素对人体均有较强的毒性,不仅会使人体产生耐药性,严重时还会导致白血病、再生性障碍性贫血及灰色婴儿综合症的发生;氟苯尼考虽无致癌、致畸和致突变作用,但会可逆性地抑制红细胞的生成,且具有胚胎毒性[3-4]。GB 31650—2019对食品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的最高残留限量均作出了规定(表1)。目前酰胺醇类药物残留的检测方法主要有色谱法[5]、质谱法[6-7]、电化学法与电致化学发光法[8-9]、荧光法[10]、免疫法[11]、表面增强拉曼光谱法[12]等。文章拟综述近5年来上述方法在动物源性食品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考检测的各种应用,以期为动物源性食品中酰胺醇类药物残留检测新方法的开发提供依据。

表1 中国规定的食品中酰胺醇类药物最高残留限量

1 色谱法

色谱法可以对复杂的组分进行分离并实现定量检测,被广泛应用于药物、食品、化工等领域,具有分离效率高、重现性能好、能与多种检测器兼容且易于自动化等特点[13-14]。

样品前处理过程中萃取方法的选择是影响色谱法检测动物源性食品中酰胺醇类药物残留的重要因素之一。Moudgil等[15]利用高效液相色谱结合二极管阵列检测器来检测牛奶中的氯霉素,借助Oasis HLB固相萃取柱净化样品中的氯霉素,在最佳的试验条件下,氯霉素的线性范围为50～500 ng/mL,检出限为21.4 ng/mL。

加速溶剂萃取法是在高温高压条件下利用未达到临界点的液体作为萃取溶剂的提取方法,具有萃取时间较短和溶剂使用量少的优点。Wang等[16]使用加速溶剂萃取法提取禽蛋中的甲砜霉素和氟苯尼考,利用液相色谱—荧光检测器可以在5 min内准确检出甲砜霉素和氟苯尼考,2种残留物的检出限为1.8～4.9 μg/kg,回收率>80.1%,说明该法可以用于检测不同品种禽蛋中的甲砜霉素和氟苯尼考残留。

浊点萃取法是通过改变pH值、温度或离子强度等使表面活性剂产生浊点析相,从而将疏水性物质和亲水性物质分离,该法不使用挥发性有机溶剂,是一种较为环保的提取方法[17]。Sürücü等[18]使用聚乙二醇6000作为表面活性剂,在添加pH为5.0的Britton-Robinson缓冲溶液与20%的硫酸钠溶液后提取样品中的氯霉素,经涡旋、孵育、离心、相分离等步骤后,氯霉素便吸附至聚乙二醇6000表面,最后使用乙醇洗脱后利用高效液相色谱—二极管阵列检测器检测,该法在检测牛奶样品中氯霉素时回收率为95.4%～102.4%,检出限为2.98 ng/mL。

气相色谱法在检测酰胺醇类药物残留时一般需经过衍生处理,步骤较为繁琐,但农业部958号公告-13-2007(水产品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素残留量的测定)选择气相色谱法来检测水产品中的氯霉素和甲砜霉素,说明气相色谱法具有一定的适用性。胡红美等[19]利用气相色谱—电子捕获方法来测定水产品中的氯霉素,样品经乙酸乙酯超声萃取和正己烷除脂后,使用N-丙基乙二胺固相吸附剂净化并通过硅烷化试剂衍生,再使用气相色谱进行检测,氯霉素的线性范围为1.5～100.0 μg/L,检出限为0.1 μg/kg,该法在鳗鲡、鳜鱼和大管鞭虾3种不同基质中的回收率为78%～108%,在实际样品复杂基质检测的应用中效果良好。

色谱法具有准确度较高、可同时快速检测多种药物残留的优点,整体耗费较低,因此较为适合市、县级检测机构对酰胺醇类药物残留的日常监测。但色谱法在检测酰胺醇类药物时具有前处理方法较为繁琐、前处理时间较长以及挥发性有机试剂消耗较多等缺点,需进一步完善。

2 质谱法

质谱法是根据目标分析物的质荷比进行定量检测,可以在较短时间内同时检测上百种目标分析物。质谱仪可连接不同的色谱仪进行分离步骤,GB/T 22338—2008中规定了动物源性食品中氯霉素类残留量的气相色谱—质谱和液相色谱—质谱/质谱测定方法,GB/T 20756—2006、GB 31658.2—2021使用了液相色谱串联质谱的测定方法。除了这些国家标准,广大科研人员也借助质谱法来开发新的方法用于检测动物源食品中的酰胺醇类药物残留,并取得了令人满意的结果。

与色谱法一样,前处理过程的效果直接影响质谱法在检测药物残留应用中的准确度,科研人员在使用质谱法检测酰胺醇类药物残留时,常常会尝试多种方法以寻找合适的提取试剂和方法。Saito-Shida等[20]建立了一种利用液相色谱串联质谱法检测牛和鳗鱼中氟苯尼考与氟苯尼考胺总残留量的方法,样品经盐酸水解及固相萃取净化,最大限度地降低了基质效应,该法在检测氟苯尼考残留时回收率>90%。Xie等[21]利用乙酸乙酯—乙腈—氨水(V乙酸乙酯∶V乙腈∶V氨水为49∶49∶2)混合溶液作为提取剂提取鸡蛋中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考药物残留,3种药物残留的检出限为0.04～0.50 μg/kg,回收率为90.84%～108.23%。

气相色谱—质谱法检测酰胺醇类药物残留时也需要对样品进行衍生化处理。劳哲等[22]对样品进行提取、净化、衍生化和定容后,利用在线凝胶渗透色谱—气相色谱串联质谱检测氯霉素,上机溶液经凝胶渗透色谱柱后由切换阀可以排出残留的脂肪和色素,在优化提取溶剂、衍生温度、衍生时间等试验条件后,该法在检测食品中氯霉素时检出限为0.05 μg/kg,线性范围为0.25～10.00 ng/mL。

固相萃取过程中吸附剂的选择直接影响萃取效果,Zhou等[23]建立了一种新的微波辅助合成硼酸改性膨胀石墨(B-EG)方法,得到了蠕虫状和片状结构的B-EG,并将B-EG作为固相萃取吸附剂来富集和分离鸡蛋样品中的氯霉素,利用液相色谱串联质谱法检测时,检出限为0.27 ng/g,在50 ng/g的添加浓度下,氯霉素回收率为87%～94%。

内标法可以显著提高质谱法检测的准确度,内标物的加入可以在一定程度上消除进样量和色谱条件的微小变化,并且可以部分补偿待测组分在前处理过程中的损失。氘代氯霉素(d5-氯霉素)为氯霉素的内标物,在开发新的检测方法时往往会选择加入氘代氯霉素作为内标物。表2展示了利用内标法在检测动物源性食品中酰胺醇类药物残留的应用效果。

表2 内标法在检测酰胺醇类药物残留中的应用效果

质谱法检测速度快、准确度和自动化程度高,在农业、食品、药品等检测工作中具有十分重要的作用,但是质谱法也具有仪器和耗材昂贵、前处理过程繁琐、有机溶剂使用量多等缺点。

3 电化学法与电致化学发光法

电化学法是通过分子识别元件与目标分析物发生作用产生信号,经信号转换器转换为可以识别的电信号来实现定性与定量分析。电化学法检测速度较快,通常几十秒便可以完成一次检测,灵敏度高,检出限可达到“fg/mL”级,且电化学法仪器简单便宜,便于小型化[27-28]。电化学传感器是电化学法的基础和重点,其性能直接影响电化学法的灵敏度。常见的电化学法检测方式有循环伏安法和差分脉冲伏安法[29-30]。

电致化学发光法是将电化学法与化学发光法结合而产生的方法,也是利用电化学传感器来检测目标分析物,与电化学法不同的是电致化学发光法是检测光信号,因此灵敏度要比电化学法更高[31]。由表3可知,在检测酰胺醇类药物残留时,贵金属、金属氧化物、聚合物、石墨烯、核酸适配体、金属有机框架材料等均可以作为电极材料用于构筑电化学传感器。

表3 不同电化学传感器在检测酰胺醇类药物残留中的应用

电化学法在检测一种药物残留时性能优秀,但在同时检测多种药物残留时存在较大的缺陷:① 多种药物的氧化还原峰很接近,难以区分;② 一种固定浓度药物的电流响应值会随另一种药物浓度的变化而发生较大变化,严重影响测定的准确性;③ 电化学法的稳定性和重现性不理想,利用滴涂法制作的电化学传感器在几个测量之后表面的电极材料脱落严重。

4 荧光法

荧光法是基于辐射跃迁原理的检测方法,当利用一定波长的激发光照射目标分析物时,具有特定结构的分子/原子会发出荧光。该法具有特异性,适合复杂样品中药物残留的检测[41]。Yi等[42]使用上转换纳米材料NaYF4:Yb与金纳米粒子设计了一种荧光探针,当加入甲砜霉素时,金纳米颗粒会聚集从而抑制荧光共振能量转移过程,使荧光强度减弱来实现对甲砜霉素的定量检测,该法在检测鸡蛋中甲砜霉素时回收率为98.2%～105.3%,检出限为0.003 μmol/L。

与传统的荧光探针相比,量子点荧光探针的荧光强度高、稳定性好,且量子点具有良好的生物相容性[43]。Sadeghi等[44]采用水热法一步合成了新型离子液体包覆CdS量子点的荧光探针,在碱性介质中加入氟苯尼考后会引起荧光猝灭,可据此来实现对氟苯尼考的定量分析,优化试验条件后,氟苯尼考检出限为0.098 μmol/L,线性范围为0.3～56.0 μmol/L,该法在检测鱼肉和鸡肉中氟苯尼考时结果令人满意,可用于肉制品中氟苯尼考残留的快速筛查。Sa-Nguanprang等[45]制备了CdTe*CdS*ZnS量子点,随后与介孔碳、分子印迹聚合物结合制备了用于灵敏检测甲砜霉素的混合荧光传感探针,在检测牛奶中甲砜霉素时回收率为93.5%～100.1%。

荧光生物传感器是将生物技术与荧光技术结合而成,识别元件主要有各种抗原、抗体、蛋白和核酸等,其中由核酸构成的荧光生物传感器对待测物具有特异性的识别能力,在检测药物残留时具有优秀的灵敏度[46]。Li等[47]利用三倍体DNA和杂交链式反应扩增的无酶荧光共振能量转移传感平台来检测牛奶中残留的氯霉素,氯霉素能够特异性地与适配体结合引发杂交链式反应形成三倍体DNA导致荧光降低,进而检测牛奶中的氯霉素残留,该法对氯霉素的检出限为1.2 pg/mL,回收率为97.5%～106.0%。

以蛋白为模板合成的金纳米簇在生物相容性、光稳定性、绿色合成以及表面功能化修饰等方面具有十分重要的研究价值[48]。成玉梁等[49]合成了大豆蛋白—金纳米簇,根据氯霉素对大豆蛋白—金纳米簇的荧光猝灭现象开发了可以检测氯霉素的荧光传感器,检出限为22.86 μmol/L,回收率为87.80%～98.45%,可靠性较高,可用于检测猪肉中的氟苯尼考。

碳点是一种新型的碳纳米荧光材料,具有光学性能稳定、生物相容性良好、易于制备等优点,既可以通过生物质碳源制备,也可以由非生物质碳源制得,来源十分广泛[50]。Fu等[51]分别利用柠檬酸盐、乙二胺和香菜制备了非生物质碳点与生物质碳点,然后将SiO2和沸石咪唑酯骨架结构材料(ZIF-8)结合制备了下/上转换双激发多发射荧光印迹传感器,在370,780 nm光源激发条件下,该传感器对甲砜霉素表现出双通道荧光响应,线性范围分别为5.0×10-3～6.0,6.0～26.0 μmol/L,可用于检测肉类样品与牛奶样品中的甲砜霉素,回收率为95.0%～105.0%。

荧光法具有耗费低、仪器结构简单、灵敏度高等优点,适合现场高通量快速筛查,在食品检测领域应用广泛。但是荧光物质稳定性差的缺点还未解决。

5 免疫法

免疫法是以抗原抗体的特异性反应为基础而进行测定抗原抗体含量的一种分析方法,主要有酶联免疫法和免疫层析法,具有检测速度快、价格便宜、便携性好等优点[52]。

胶体金免疫层析法是以胶体金作为示踪物应用于抗原抗体反应的一种免疫法,该法特异性强且灵敏度高,不需要借助任何设备仪器[53]。Lei等[54]利用以纳米金为基础的单克隆抗体和间接竞争酶联免疫法建立了可以检测鸡蛋中氟苯尼考和甲砜霉素药物残留的方法,优化条件后,该试纸条在检测氟苯尼考与甲砜霉素的检出限为0.053 ng/mL。

近年来,免疫法与仪器分析技术相结合开发的时间分辨荧光免疫分析技术具有检测速度快且可以实现定量分析的特点,该法使用稀土元素作为标记物,可以明显提升方法的灵敏度[55]。崔乃元等[56]合成了羧基化的铕微球,并将其与氯霉素鼠单克隆抗体进行偶联标记,使用氯霉素抗原与羊抗鼠二抗分别包被于硝酸纤维膜上作为检测线和控制线,将羧基化铕微球标记的氯霉素单克隆抗体喷洒在释放垫上一起制成了试纸条,利用荧光免疫定量分析仪检测水产品中的氯霉素时,定量限为0.1 μg/kg。

免疫法常用于养殖场和屠宰场对动物尿液进行现场分析,在动物源性食品安全监管方面发挥了很大作用。但是,免疫法具有假阳性的缺点,当出现假阳性时,还需要借助其他方法进行确证,而且大部分免疫法在检测酰胺醇类药物残留时均不能给出具体的残留量,免疫法与其他仪器结合使用可以克服这一缺点。

6 表面增强拉曼光谱法

表面增强拉曼光谱法结合了拉曼光谱和表面材料技术,由于局域表面等离子体共振和化学吸附现象导致拉曼散射信号显著提升,检测灵敏度得以提升,同时具有样品消耗少、无损伤、响应速度快等优点[57]。Li等[58]合成了具有3D结构的ZnO@Ag纳米花,Ag纳米粒子均匀分布在ZnO表面,将ZnO@Ag纳米花通过浸渍法组装至聚酯纤维膜上制备了柔性基板,将含氟苯尼考的鸡肉样品利用乙酸乙酯提取后得到的上清液滴加至柔性基板上进行表面增强拉曼光谱测量,在最佳的试验条件下,该法检测氟苯尼考的检出限达0.223 nmol/L。

7 结论

(1) 色谱法与质谱法在同时检测多种酰胺醇类药物残留的应用方面优势明显,准确度高,已有许多国家标准采用色谱—质谱联用法用于检测动物源性食品中的酰胺醇类药物残留,后续研究重点可聚焦于以下方面:① 开发有机溶剂使用量少、萃取效率高、绿色环保以及安全的前处理方法;② 合成性能优异的新型吸附剂,如磁性纳米材料;③ 建立多种类药物同时提取、检测的方法,提高检测效率,降低试验成本。

(2) 除了常见的循环伏安法、差分脉冲伏安法等方法,电化学法也可使用交流阻抗谱进行酰胺醇类药物残留的定性与定量分析,以提高电化学法的灵敏度和准确性。此外,可以合成新型功能化纳米复合材料用于改善电化学传感器的重现性,也可探索使用电沉积、电聚合、金—硫键反应等方式制作稳定性能更好的电化学传感器。

(3) 联合使用免疫法与荧光法,既保留了特异性也满足定量分析,可合成具有多种颜色的荧光标记物实现多种酰胺醇类药物残留的同时检测,并且利用有机材料包裹荧光物质制成纳米微球可以显著提高荧光探针的稳定性。