高效液相色谱法测定聚乳酸吸管中甲醛迁移量

胡 云 邹勇平 周元元 王 帅 梁志春

聚乳酸(polylactic acid,PLA)吸管在(58±2) ℃的弱光环境下,经过70 d左右的时间即可完全降解[1],其初始原料来自玉米、甜菜、土豆等天然可再生资源,是一种环保、可再生、可持续的新型生物基食品接触材料[2]。当前,包括中国在内的许多国家陆续出台了禁塑令[3-4],遏止一次性塑料吸管的使用。PLA吸管安全无害、对环境友好,具备商业应用的基本特性[2],成为了替代传统的聚丙烯(polypropylene,PP)吸管的主要选择。

PLA材料通常与聚酯混合以改善其抗冲击性[5-6],当聚酯部分添加三聚氰胺甲醛树脂时,甲醛会从这些食品接触材料中迁移出来[7]。甲醛具有毒性,中国及欧盟规定,塑料等食品接触材料中甲醛的特定迁移限量为15 mg/kg[8-9]。据报道[10-11],德国、荷兰对市场上生物基餐具的产品抽检中,有11%左右的样品甲醛迁移量超过限量要求,最高达到了247 mg/kg。为了保障消费者的安全,亟需对PLA吸管这种新型生物基食品接触材料中的甲醛进行迁移测试并进行安全性评估。目前,中国规定的食品接触材料中甲醛迁移量的测定方法为乙酰丙酮分光光度法和变色酸分光光度法[12]。2,4-二硝基苯肼(2,4-dinnitrophenylhydrazine,DNPH)柱前衍生高效液相色谱法[13-14]与分光光度法相比具有更高的灵敏度,在分析领域中更常被选择用于醛类的测定。普遍认为,衍生化法的甲醛检测灵敏度受衍生化试剂DNPH的pH值、物质的量、反应温度、反应时间的影响[15-16],但是不同的产品,优化的衍生条件并不完全相同。

据统计[17],饮料水、果蔬汁、茶饮料的消费占据了中国饮料总消费量的前列,试验选择用水模拟饮料和茶饮料,用酸性模拟液模拟果蔬汁饮料。酸性模拟液为国内外常用的4 mL/100 mL冰乙酸的水溶液和3 mL/100 mL冰乙酸的水溶液。根据PLA吸管在冷冻饮品、常温饮品、热烫饮品下的实际使用情况,设计相应温度条件,研究PLA吸管中甲醛的迁移行为,并进行相应的安全性评估,旨在为这种新型食品接触材料的市场监管提供一定的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

PLA吸管:市售;

色谱柱:Eclipse Plus C18(4.6×150 mm,3.5 μm),美国Agilent公司;

预柱:Agilent EP-C18柱,美国Agilent公司;

甲醛标准物质溶液(质量浓度为1 002 mg/L)、甲醛-DNPH腙标准溶液(质量浓度为1 008 mg/L):色谱级,美国o2si公司;

2,4-二硝基苯肼(纯度98%):色谱纯,上海麦克林生化科技有限公司;

甲醇、乙腈:色谱纯,默克化工技术(上海)有限公司;

冰乙酸:分析纯,国药集团化学试剂有限公司;

超纯水:自制。

1.1.2 主要仪器设备

高效液相色谱仪(配置DAD检测器):1260型,美国Agilent科技有限公司;

Milli-Q超纯水仪:Reference型,密理博(上海)贸易有限公司;

酸度计:S210-K型,梅特勒托利多科技(中国)有限公司;

电子分析天平:XSR204型,梅特勒托利多科技(中国)有限公司;

精密恒温箱:DH611C型,雅马拓科技贸易(上海)有限公司;

数显恒温水浴锅:HH-4型,常州国华电器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱:Eclipse Plus C18(4.6×150 mm,3.5 μm);预柱:Agilent EP-C18柱;流动相:水—乙腈(V水∶V乙腈=55∶45);流速1.0 mL/min,柱温35 ℃,进样量20 μL;吸收波长355 nm。

1.2.2 甲醛-DNPH腙标准工作溶液配制 分别准确吸取1 008 mg/L甲醛-DNPH腙标准溶液0.01,0.1,0.2,0.4,0.7 mL于10 mL棕色容量瓶中,加乙腈定容至刻度,配得质量浓度为1.008,10.08,20.16,40.32,70.56 μg/mL的甲醛-DNPH腙标准工作溶液。此系列标准溶液每次临用前现配。

1.2.3 DNPH衍生化试剂的配制 准确称取0.673 3 g DNPH于100 mL棕色容量瓶中,先加入50 mL乙腈,然后加入1.5 mL冰乙酸,超声20 min至完全溶解,最后用乙腈定容至刻度,配得浓度为33.3 mmol/L、冰乙酸含量为1.5%的DNPH溶液。此溶液可于5 ℃避光保存2周,临用前进一步稀释至2.664 mmol/L,此浓度是标准曲线最高浓度点对应的甲醛浓度的4倍。

1.2.4 柱前衍生化反应 迁移试验结束后,取5 mL酸性食品模拟液的浸泡液,与5 mL浓度为2.664 mmol/L、冰乙酸含量为1.5%的DNPH衍生化试剂在45 ℃反应40 min,反应结束后迅速置于冰水浴中冷却5 min,经0.45 μm针头过滤器过滤后待上机分析;对于用水作为食品模拟液的浸泡液,从中取4.85 mL,加入0.15 mL冰乙酸,使其中冰乙酸体积含量达到3%,其余衍生化条件与酸性食品模拟液的浸泡液相同。

1.2.5 甲醛的迁移试验 采用GB 5009.156—2016中的全浸法,以水、3%冰乙酸的水溶液、4%冰乙酸的水溶液为食品模拟液,对一次性PLA吸管进行迁移测试。迁移测试模拟了一次性PLA吸管在冷饮、温饮、热饮3种温度条件下的使用情况,分别为5,40,100 ℃,浸泡时间3 h。迁移测试结束后,将浸泡液与DNPH进行衍生化反应,对反应液进行高效液相色谱分析,外标法定量,计算PLA吸管水及酸性食品模拟液中甲醛的迁移量,结果表示为每千克食品模拟液中甲醛迁移的毫克数。在设定的迁移试验条件下,未观察到PLA吸管任何物理性能(如变形、融化、溶胀等)的改变。

1.2.6 多因素方差分析 以摩尔量倍数和冰乙酸含量为“固定因子”,以甲醛反应率为“因变量”,选用“全因子”模型,分析所有因子的主效应和交互效应。

1.2.7 数据统计分析及图谱绘制软件 仪器分析软件:Agilent OpenLAB CDS-Acquisition(版本2.4.0.628);统计分析软件:IBM SPSS Statistics 26;图谱绘制软件:Origin 2021。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

2.1.1 流动相和柱温 有研究[18-19]表明,流动相的极性和柱温会影响甲醛-2,4二硝基苯腙的保留时间和峰面积,增加流动相中乙腈的比例、升高柱温,苯腙的保留时间会提前。试验中,当V水∶V乙腈为50∶50或52.5∶47.5,柱温为20～40 ℃时,苯腙较快出峰,保留时间为4～8 min,但是色谱峰普遍拖尾,影响定量结果的准确度,与Graceffa等[20]的试验结果一致。当V水∶V乙腈为60∶40、柱温为20～40 ℃时,苯腙的出峰时间较晚,为11～14 min,影响检验的时效性。因此,试验重点考虑了V水∶V乙腈为55∶45或57.5∶42.5的色谱条件(见表1)。由表1可知,当柱温为40 ℃时,苯腙的峰面积响应值最高,但Eclipse Plus C18柱长期在40 ℃使用容易老化。因此,试验重点研究了柱温在35 ℃及以下,V水∶V乙腈为55∶45或57.5∶42.5的色谱条件。经统计分析,该色谱条件下,苯腙的峰面积差异不显著(P=0.469>0.05),保留时间差异显著(P=0.000<0.05),最终选择出峰时间较快的色谱条件,即V水∶V乙腈为55∶45,柱温35 ℃,此时,苯腙色谱峰的保留时间为7.845 min。从样品色谱图(图1)来看,甲醛-2,4二硝基苯腙与杂质实现了有效分离,分离度为1.9,此外,食品模拟液中含有少量的甲醛,需要在结果的计算中扣除。

A. 迁移试验后加标的模拟液 B. 甲醛标准溶液 C. 迁移试验后的模拟液 D. 模拟液

2.1.2 检测波长 用DAD检测器对甲醛-2,4二硝基苯腙标准品进行光谱扫描,在356 nm处有最大光吸收。紫外光谱扫描通常会有2 nm左右的偏移,且检测波长在354～360 nm并不会影响目标化合物的检测灵敏度[21-22],因此选择355 nm作为甲醛-2,4二硝基苯腙的检测波长。

2.2 甲醛衍生条件优化

2.2.1 反应温度和反应时间 研究了反应温度在25～85 ℃、反应时间在0～60 min,甲醛与DNPH的反应率,结果见图2。温度和时间在一定程度上能促进甲醛的衍生化反应,但是过高的温度和过长的时间则不利于衍生化反应。当反应温度为25,35 ℃时,甲醛与DNPH衍生形成甲醛-2,4二硝基苯腙的反应率达不到90%。当温度升高至45 ℃及以上时,甲醛的衍生化反应率能达到100%,由于测量误差,甲醛-2,4二硝基苯腙的反应率在100%上下波动,但是差异并不显著(P=0.400>0.05)。但是在85 ℃反应40 min以后,甲醛的衍生化反应率则迅速下降,并且在60 min时大幅降低至70%,同时可观察到红棕色的沉淀。在反应刚开始时,温度对甲醛衍生化反应率的影响较低,所有温度组中甲醛的衍生化反应率均低于71%,10 min后,25,35 ℃试验组甲醛的衍生化反应率分别达到了76%和85%,其他试验组的衍生化反应率则迅速升高至100%附近。40 min时,除了25,35 ℃试验组甲醛的衍生化反应率稳定在86%和83%,其他试验组的衍生化反应率则基本稳定在100%。因此,优化的反应温度为45 ℃,反应时间为40 min。

图2 反应温度和反应时间对甲醛反应率的影响

2.2.2 DNPH溶液中冰乙酸含量和DNPH用量 研究了DNPH溶液中冰乙酸含量分别为1%,1.5%,2%,3%,4%,DNPH用量分别为甲醛物质的量的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10倍时,甲醛与DNPH的反应率,采用全因子试验设计,每组重复试验3次,用统计分析软件估算主效应和交互效应,结果见表2。由表2可知,不仅物质的量倍数和冰乙酸含量的主效应显著(P=0.000<0.05),物质的量倍数和冰乙酸含量的交互效应也显著(P=0.002<0.05)。进一步对物质的量倍数和冰乙酸含量进行简单效应分析,结果见图3和图4。图3中,同一冰乙酸浓度,甲醛反应率随DNPH物质的量的增加而增加[23],同一摩尔量,冰乙酸含量在1.5%和4.0%,即对应的DNPH溶液酸度分别为pH 3.07,2.05时,甲醛反应率有最大值,与Rezende等[15]和Lin等[24]的试验结果一致。羰基化合物与质子化肼的反应涉及3种反应机理[25]:① 羰基化合物与质子化肼形成加合物,中性肼在亲核反应中攻击羰基碳;② 质子化肼直接攻击羰基碳形成质子化腙;③ 酸催化下肼攻击羰基碳,C—N的形成与脱水进程具有pH依赖性,而腙的形成则是这几种反应机理互相竞争的结果。当冰乙酸含量为1.0%(pH 4.02)时,pH值较高,羰基质子化和脱水进程受阻,表现为较低的反应率。随着冰乙酸含量的增加,pH值降低,反应率增加。当冰乙酸含量增加至2%(pH 2.75)时,中性肼有进一步质子化的趋势,氮孤对电子的亲核攻击受阻,反应率降低。此后,随着冰乙酸含量的进一步增加,质子化肼直接攻击羰基碳的反应进程占主导地位,反应率也随之逐渐上升。同样的趋势在图4中也可以观察到。由于DNPH的量过低,甲醛的反应率不能达到100%,DNPH的量过高,形成的巨大色谱峰产生的峰拖尾会干扰目标化合物的分析[26],因此,优化的DNPH用量为甲醛物质的量的4倍,冰乙酸含量为1.5%。

图3 不同物质的量的倍数在冰乙酸含量上的简单效应

图4 不同冰乙酸含量在物质的量倍数上的简单效应

表2 方差分析之DNPH的酸度和物质的量的倍数对甲醛反应率的影响†

2.3 方法参数的确认

如图5所示,甲醛-DNPH腙标准溶液在1.008～70.560 μg/mL的质量浓度范围内线性方程为y=55.247 0x-3.849 4,相关系数为0.999 5,对应的甲醛检出限为0.066 mg/kg,定量限为0.22 mg/kg。在国标甲醛检测方法[12]中,乙酰丙酮分光光度法的检出限为0.02 mg/dm2,变色酸分光光度法的检出限为0.04 mg/dm2,按照1 kg为6 dm2的换算系数,这两种比色法的甲醛检出限分别为0.12,0.24 mg/kg,可见,液相色谱法更为灵敏。

图5 甲醛-2,4二硝基苯腙标准曲线

将甲醛的衍生化产物在常温条件下放置4.5,9.0,13.5 h,浓度变化无显著性差异(P=0.959>0.05),此检测方法具有一定的稳定性。

分别向水、3%冰乙酸的水溶液、4%冰乙酸的水溶液3种食品模拟液中加入2.0,20.0,40.1 μg/mL的甲醛标准溶液,与DNPH溶液进行衍生化反应,试验重复6次,结果见表3。甲醛加标的平均回收率在92.6%～104.1%,标准偏差(SD)在0.4%～3.3%,回收率和精密度试验的结果均符合标准规定[27]的检测方法确认的技术要求。

表3 甲醛衍生化反应的回收率与精密度

2.4 PLA吸管中甲醛迁移量

对市售的3种PLA吸管进行迁移试验,甲醛迁移的结果见表4。随着迁移温度的升高,甲醛迁移量逐渐增加[23],在100 ℃的高温组中,甲醛迁移量远高于40 ℃的常温组和5 ℃的低温组,甲醛在酸性模拟液中的迁移量显著高于在水中的(P=0.00<0.05),但是在两种酸性模拟液中的迁移量没有显著差异(P=0.308>0.05)。经检测,PLA吸管中的甲醛在100 ℃的酸性模拟液中迁移量最高,为1.839 mg/kg,远小于甲醛特定迁移量15 mg/kg的限量要求[8-9]。可见,试验的PLA吸管无论是用于低温饮品、常温饮品、热饮或是水、酸性饮品,其甲醛迁移量并不是一个显著的能引起安全问题的因素,但是,对PLA吸管客观准确的安全性评估仍取决于今后的产品市场抽检。

表4 PLA吸管中甲醛的迁移情况†

3 结论

采用优化的2,4-二硝基苯肼柱前衍生化法检测聚乳酸吸管中甲醛迁移量,方法的检出限为0.066 mg/kg,灵敏度优于国标检测方法。以3种市售的PLA吸管为试验样品,设计了水、3%冰乙酸水溶液、4%冰乙酸水溶液3种食品模拟液,5,40,100 ℃ 3种迁移温度,迁移时间为3 h的迁移试验,研究了PLA吸管中甲醛在该迁移条件下的迁移行为,检测结果表明,甲醛最大迁移率为1.839 mg/kg,符合国家标准规定的特定迁移率的限量要求。将来需要对市场上更多来源的PLA吸管进行甲醛的迁移试验,以准确评估这种新型食品接触材料的安全性。