山羊肺源肠外致病型大肠杆菌和粘质沙雷氏菌混合感染的病原分离鉴定、毒力因子基因检测和耐药性分析

徐海军,张 磊,爨淑楠,张娅菲,贾 哲,张圣尧,王书明

(1.皖西学院生物与制药工程学院,安徽 六安 237012;2. 安徽金丰源畜牧科技有限公司,安徽 六安 237000)

大肠杆菌是一类重要的条件性病原菌。与以往主要引起肠道感染不同,近年来,肠外致病型大肠杆菌(Extraintestinal pathogenicEscherichiacoli,ExPEC)引起的畜禽肠外器官感染日渐增多,对畜牧生产的健康发展造成严重危胁。张召兴等[1]从243份养殖场流产貉的阴道分泌物和死胎等病料组织中分离到87株ExPEC;蒋增海等[2]从河南省61家猪场送检的病猪肺脏和肝脏等病料中分离到17株ExPEC,检出率为27.86%;马帅等[3]从黑龙江省和山东省不同养殖场患肺炎狐和貉的肺部分离到15株ExPEC;徐海军等[4]从发病山羊的肺脏中分离到1株ExPEC。ExPEC携带多种毒力因子,致病机制复杂,引起的症状和病变多种多样,给基层临床准确诊断其感染带来了很大困难。粘质沙雷氏菌是一种条件性致病菌。陈永林等曾报道1例山羊混合感染大肠杆菌和粘质沙雷氏菌的病例[5]。本试验报告了1例罕见的ExPEC和粘质沙雷氏菌混合感染导致的成年山羊急性死亡,对分离菌进行致病性试验和药敏试验,并对分离到的ExPEC进行了系统进化群分析和毒力因子基因检测,以期为临床诊治该病提供参考。

1 材料与方法

1.1 病例来源 安徽省六安市东河口镇某养羊户发病死亡成年山羊。

1.2 实验动物 SPF级昆明小鼠,雄性,4周龄,购自安徽医科大学实验动物中心[生产许可证号:SCXK(皖)2017—001]。

1.3 主要试剂和药品 胰大豆蛋白胨琼脂培养基(Tryptic soybean peptone agar,TSA)、胰大豆蛋白胨肉汤和伊红美兰培养基,均购自北京奥博星生物技术有限责任公司;药敏纸片,购自杭州滨和微生物试剂有限公司;Taq酶、dNTP Mix和DNA Marker等,均购自 TaKaRa 公司;Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒和SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒,均购自生工生物工程(上海)股份有限公司;头孢噻呋钠和恩诺沙星注射液,均购自安徽金丰源畜牧科技有限公司。

1.4 主要仪器 SW-CJ-2FD型洁净工作台(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);HGPN-II-270型隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械有限公司);HC-2518R型冷冻高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司);DYCP-31DN型DNA 电泳槽和DYY-5型稳压电泳仪(北京六一仪器厂);2720型PCR 仪(Applied Biosystems公司);FR980型凝胶成像仪(上海复日科技仪器有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 病史调查 2021年7月7日,六安市东河口镇某养羊户送检1只刚死亡不久的成年山羊。该养羊户共饲养了6只山羊,其中3只为1年龄大羊,另3只为小羊。养羊户7月6日14:00时将羊群带到附近树林放牧,大羊用绳子系住颈部,绳子另一端拴在树干,防止其逃跑。小羊未用绳子拴住。16:00养羊户去察看时,发现有2只大羊已死亡,另1只大羊倒卧在地,大声呻吟,15 min后也死亡;3只小羊表现正常。养羊户遂带刚死的1只大羊来就诊。

1.5.2 病理剖检观察 对送检的病死羊进行病理剖检,观察病理变化。

1.5.3 细菌分离、纯化和染色镜检 无菌采集病死羊的肺脏组织,涂布接种于TSA平板,37 ℃培养 18 h,将长出的菌落转接于TSA平板,37 ℃恒温培养 18 h进行纯化。将纯化菌落转接于伊红美蓝琼脂平板上,37 ℃恒温培养 18 h,观察分离菌生长情况和菌落形态。对纯化菌落进行革兰染色镜检。

1.5.4 分离菌16S rRNA 基因PCR扩增 参照徐海军等[4]的方法通过PCR扩增分离菌16S rRNA 基因,并进行测序和序列相似性比对鉴定。

1.5.5 致病性试验 参照徐海军等[4]的方法,制备浓度为 1.0×108CFU/mL 的分离菌悬液,每种分离菌取10只小鼠腹腔注射0.5 mL菌液进行攻毒,另取10只小鼠腹腔注射等体积磷酸盐缓冲液,作为空白对照,测定分离菌对小鼠的致病性。

1.5.6 药敏试验 参照徐海军等[4]的方法,采用纸片法测定分离菌对常用抗菌药的敏感性。

1.5.7 防治措施 对3只小羊用药敏试验筛选到的敏感抗菌药进行预防性治疗,同时对羊舍加强消毒,及时清理粪便。

1.5.8 分离菌系统进化群分析和32个毒力因子基因检测 参照参考文献[6]合成系统进化群分群基因(chuA、yjaA和TspE4.C2.)和ExPEC 32个毒力基因(papA、sfaS、focG、iutA、hlyD、afa、fyuA、ireA、vaT、irp2、irp1、tsh、ler、iss、papC、kpsMTII、focD、iroN、ompA、ompT、fimH、hylA、gafD、cnf1、bmaE、cvaC、ibeA、iucD、traT、iha、nfaE和malX)的引物。参照徐海军等[4]的方法通过PCR扩增上述基因,并进行测序和相似性比对鉴定。

2 结果

2.1 病理剖检观察 送检病死山羊部分结肠肠段严重出血(图1A),心内膜有散在出血斑(图1B),瘤胃黏膜局部充血(图1C)。其他脏器未见明显病变。

图1 病死山羊部分脏器病变观察

2.2 细菌分离、纯化和染色镜检 从病死山羊肺脏分离到很厚的灰白色菌苔(图2A),划线接种至TSA平板培养后长出灰白色和红色2种菌落(图2B)。纯化培养后灰白色菌落形态特点为隆起、圆形、边缘整齐、表面光滑湿润、不透明(命名为Grey0707,图2C);红色菌落形态特点为隆起、圆形、边缘整齐、不透明(命名为Red0707,图2D)。Grey0707和Red0707在伊红美蓝平板上均生长良好,菌落颜色分别呈暗红色和黑色,均有金属光泽(图2E)。革兰染色镜检结果显示,Grey0707和Red0707均为革兰阴性杆菌(图3)。

图2 分离菌的培养特点

图3 分离菌革兰染色镜检(1 000×)

2.3 分离菌16S rRNA基因PCR扩增 Grey0707菌株 16S rRNA 基因经PCR扩增后测序,获得长为 1 447 bp 的核苷酸片段,相似性比对结果显示,Grey0707菌株与Escherichiacoli(E.coli) strain Pk1 (KX354348.1)和E.colistrain 1018 (MK729002.1)的16S rRNA基因序列相似性均达到99.7%。因此,判定Grey0707为埃希氏菌属的大肠杆菌(Escherichiacoli)。

Red0707菌株16S rRNA 基因经PCR扩增后测序,获得长为 1 439 bp 的核苷酸片段,相似性比对结果显示,Red0707菌株与Serratiamarcescensstrain WVU-006(CP041129.1)和Serratiamarcescensstrain S3 (MK411566.1)的相似度均达到100%。因此,判定Red0707为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。

2.4 致病性试验 分离菌Grey0707攻毒后24 h,小鼠均表现精神萎靡、行动迟缓等发病症状,攻毒后第2、3天分别死亡8 只和1只,之后未再死亡,致死率为 90%。剖检死亡小鼠,可见其血液暗红,肝脾肿大;从肝脏分离到的致病菌经测序比对,与Grey0707为同一细菌。对照组小鼠表现正常,肝脏中未分离到细菌。结果表明,菌株Grey0707对小鼠有很强的致病性。同法测定Red0707的致病性,结果显示,Red0707对小鼠无致病性。

2.5 药敏试验 Grey0707和Red0707的药敏试验结果分别见表1和表2。由表1可知,Grey0707对头孢曲松和丁胺卡那敏感,对磷霉素中度敏感,对粘杆菌素、多西环素、新霉素、庆大霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、阿莫西林和红霉素等药物耐药。由表2可知,Red0707对恩诺沙星、丁胺卡那、庆大霉素和磷霉素中度敏感,对头孢曲松、粘杆菌素、新霉素、阿莫西林、多西环素、氟苯尼考和红霉素等药物耐药。结果表明,2种分离菌对常用抗菌药的耐药性均较严重。

表1 分离菌Grey0707的药敏试验结果

表2 分离菌株Red0707的药敏试验结果

2.6 防治效果 养羊户总共才饲养了6只山羊,3只大羊都已发病死亡。根据药敏试验结果,建议养羊户用头孢噻呋钠和恩诺沙星注射液对剩下的3只小羊进行肌肉注射预防,每天1次,连用3 d;清除羊舍中垫草和粪便,然后用消毒药进行消毒。1周后回访得知,3只小羊未再发病。

2.7 Grey0707系统进化群分析和毒力因子基因检测 系统进化群分群分析结果显示,Grey0707携带yjaA基因,不携带chuA和TspE4.C2.基因(图4)。参照大肠杆菌系统进化性组别检索表[7],确定该菌为A群。

图4 Grey0707系统进化群分群基因和毒力因子基因的PCR扩增

毒力因子基因检测结果(图4)显示,Grey0707携带外膜蛋白相关毒力基因(ompA、ompT、traT和iss)、游离铁摄取相关毒力基因(iutA、iroN和iucD)、粘附素相关毒力基因(fimH、afa和gafD)。Johnson等[8-9]认为,ExPEC至少应具备5种毒力标记基因(papA/papc、sfa/foc、afa/dra、iutA和kpsMTII)中的2种毒力标记基因。本试验分离到的大肠杆菌携带2种毒力标记基因(afa和iutA),因此可判定为ExPEC;该菌还携带其他多种类型的毒力因子,这可能与其致病性较强有关。

3 讨论

大肠杆菌根据其不同的分子特性和致病机制被分为共生型、肠道致病型和肠外致病型三类。近些年来,ExPEC引起动物感染的报道日益增多[10-13],已成为严重危害养羊业健康发展的重要细菌性疾病之一[14]。本试验分离到1株致病力特别强的ExPEC,可引起成年山羊急性突然死亡。让人费解的是同群饲养的小羊却未发病,实属罕见。虽然本病例中死亡山羊肺部的眼观病变并不明显,但细菌分离时却长出非常厚的灰白色菌苔,表明肺部的细菌感染非常严重。ExPEC大量感染时会产生大量内毒素,这可能会造成内毒素性休克,甚至快速死亡。在急性败血症时,由于致病因子毒力极强,可能会出现脏器无明显病变而突然出现死亡的现象。本病例的结肠、心内膜和瘤胃黏膜有明显病变,但其他脏器未见明显病变,这可能反映了不同脏器对分离菌的致病作用存在耐受性差异。本试验毒力因子检测结果显示,分离获得的大肠杆菌携带了10种毒力因子,包括粘附素相关基因(fimH、gafD和afa)、游离铁摄取相关基因(iroN、iucD和iutA)和外膜蛋白相关基因(ompA、ompT、traT和iss)。粘附是ExPEC感染的关键环节。Grey0707携带1种I型菌毛基因(fimH)和2种非菌毛粘附素基因(gafD和afa),可能有利于其结合肠上皮细胞,进而进入肠外组织并引起感染。动物体内游离铁浓度很低。虽未检测到Grey0707携带溶血相关基因,但其携带气杆菌素铁载体系统基因(iucD和iutA)和iroN基因,这可有效保障该菌在体内获得充足的铁离子用于生长。此外,Grey0707携带了4种外膜蛋白基因,其中ompA编码的蛋白参与细菌的粘附、毒性、侵袭性和生物膜形成[15];traT编码的蛋白是一种菌体外膜脂蛋白,与菌体的补体抗性和致病力关系密切[16];ompT编码的蛋白对细菌的定植和粘附至关重要[17-18];iss编码的蛋白与大肠杆菌的抗补体作用有关,该蛋白表达水平越高,大肠杆菌对血清的抵抗能力越强,致病力越强[19-20]。可见,本试验分离到的ExPEC毒力因子丰富且类型多样,这可能是其引起本病例成年山羊迅速发病死亡的内在因素。

本病例在对分离菌进行纯化培养时,发现有少量红色菌落生长,该菌随后被鉴定为粘质沙雷氏菌。粘质沙雷氏菌广泛存在于环境中,在机体免疫功能下降时可引起肺部和尿道感染以及败血症[21-23]。在家畜上,陈永林等[5]曾报告山羊混合感染大肠杆菌和粘质沙雷氏菌的病例[5]。金红岩等[24]从健康牦牛牛乳中分离到粘质沙雷氏菌,但对小鼠没有致病性。本病例分离到的粘质沙雷氏菌对健康小鼠亦未表现致病作用,与其属于条件性致病菌的特点相一致。但在有ExPEC感染的情况下,粘质沙雷氏菌可能会对大肠杆菌起到协同致病的作用,从而导致本病例中非常罕见的成年山羊突然急性死亡。

在耐药性方面,本试验分离到的ExPEC除对头孢曲松、丁胺卡那和磷霉素相对敏感外,对其他抗菌药均表现明显的耐药性。大肠杆菌是一种非常容易产生耐药性的细菌。临床上用药时应务必根据药敏试验结果选择敏感的抗菌药进行治疗。粘质沙雷氏菌的耐药情况表现较为复杂。本试验结果显示,粘质沙雷氏菌(Red0707株)对恩诺沙星、丁胺卡那、庆大霉素和磷霉素中度敏感,对头孢曲松、粘杆菌素、新霉素、阿莫西林、多西环素、氟苯尼考和红霉素等药物耐药。金红岩等[24]从耗牛牛乳中分离到的粘质沙雷氏菌对头孢哌酮、头孢他啶、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、丁胺卡那、新霉素和多西环素敏感,而对庆大霉素和哌拉西林中度敏感,对头孢拉定、头孢呋辛、头孢唑林、头孢氨苄、氨苄西林、苯唑西林、青霉素和卡那霉素等耐药。苏华田等[21]从重症监护(Intensive care unit,ICU)患者体内分离到的粘质沙雷菌对青霉素类和1、2、3代头孢菌素类抗菌药的耐药率较高(>60%),对氨基糖苷类的耐药率较高(>80%),对喹诺酮类的耐药率较低(<30%),对头孢吡肟和亚胺培南敏感。可见,粘质沙雷氏菌常出现对同一类别抗菌药物中的不同抗菌药物表现不一致的耐药性,但总体上看对喹诺酮类药物较敏感。

4 小结

本试验报道了1例罕见的ExPEC和粘质沙雷氏菌混合感染导致成年山羊突然急性死亡病例。攻毒试验结果显示,分离获得的大肠杆菌对小鼠致死率为90%,粘质沙雷氏菌对小鼠无致病性。药敏试验结果显示,分离获得的大肠杆菌对头孢曲松和丁胺卡那敏感,粘质沙雷氏菌对恩诺沙星、丁胺卡那、庆大霉素和磷霉素中度敏感。分离到的ExPEC属于A群,并携带毒力因子基因ompA、ompT、traT、iss、iutA、iroN、iucD、fimH、afa和gafD。推测ExPEC与粘质沙雷氏菌混合感染可能产生协同致病作用。家畜感染ExPEC的病例日益增多,需引起高度重视。