长时间血清饥饿胁迫对猪骨骼肌卫星细胞代谢和自噬的影响

高 娟,范博钧,吴雅婕,王 怡,杨跃飞,鞠辉明

(1. 扬州大学广陵学院,江苏 扬州 225000;2.扬州大学兽医学院 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏 扬州 225009)

骨骼肌卫星细胞(Skeletal muscle satellite cells,SMSCs)最早由Mauro于1961年发现,是分布于成年个体肌肉组织内,肌细胞基底膜与肌膜之间,未分化的、处于静止状态的肌前体细胞[1]。当肌肉受到损伤或者发生肌肉退化疾病而引起应激时,SMSCs可以通过肌源性分化而形成肌纤维[2]。细胞自噬通过形成自噬体,将蛋白质和糖原颗粒等生物大分子或线粒体等细胞器回收至溶酶体,最终将其降解为氨基酸和单糖等小分子[3]。细胞自噬实现了能量物质的循环再利用,是高度保守的过程[4]。研究表明,骨骼肌在饥饿状态、废用性萎缩、缺氧和锻炼时,其自噬通量会增加[5-7]。多个因子和信号通路已被证明有助于自噬通量的调节。其中,活性氧(Reactive oxygen species,ROS)参与自噬通量的控制,且直接与骨骼肌的再生和修复密切相关[8]。一定量的ROS对于调节细胞生长和维持细胞的各种生物学功能是必不可少的,但一些退行性疾病、骨骼肌疾病、糖尿病和衰老等会导致ROS平衡被破坏,进而影响骨骼肌代谢[9]。目前,虽然有证据表明肌肉纤维恢复过程与SMSCs自噬密切相关[5,10],但自噬影响肌肉再生和修复的具体途径和精确机制仍有待系统研究。本试验通过长时间控制SMSCs培养体系中的血清浓度,检测不同程度血清饥饿胁迫对细胞代谢和自噬的影响,以期为后续探索营养胁迫影响猪骨骼肌发育和肌肉生成的差异机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 DMEM高糖培养基,购自Hyclone公司;PBS和青霉素链霉素双抗,购自美国Gibco公司;anti-LC3b和anti-p62抗体,均购自美国Abcam公司;anti-AMPK、anti-mTOR、anti-p-mTOR和anti-Tubulin抗体,均购自美国Proteintech公司;anti-p-AMPK抗体,购自美国GeneTex公司;细胞凋亡试剂盒、线粒体膜电位试剂盒、活性氧检测试剂盒和三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)检测试剂盒,均购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 主要仪器 CO2恒温细胞培养箱(Heracell 150i),购自美国Thermo公司;蛋白电泳仪(PowerPacTM Basic),购自美国Bio-Rad公司;流式细胞仪(CytoFLEX),购自美国Beckman Coulter有限公司;全自动化学发光图像分析系统(Tanon-5200),购自中国天能公司;多功能酶标仪(BioTek Synergy),购自美国Biotek Synergy公司。

1.3 细胞来源 原代姜曲海猪SMSCs 由本实验室分离鉴定并保存。

1.4 细胞分组和处理 SMSCs培养于含20%胎牛血清的DMEM培养基中,随机分为5个组:培养基中含20%血清的细胞为正常对照组(20%S组),培养基中分别含15%、10%、5%和不含血清的细胞分别为15%S、10%S、5%S和0%S组。各组细胞在不同血清浓度条件下培养96 h,进行细胞代谢相关指标和自噬相关蛋白检测。每组3个样本重复,进行3次试验重复。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡率、线粒体膜电位和ROS水平 收集各组细胞,制备细胞悬液,800 r/min离心5 min,弃上清。按照试剂盒说明书操作,使用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率、线粒体膜电位和ROS水平。

1.6 细胞内ATP水平测定 收集各组细胞,制备细胞悬液,800 r/min离心5 min,弃上清。按照ATP检测试剂盒操作说明书操作,测定各组细胞中ATP水平。

1.7 Western blot检测细胞自噬相关蛋白的表达 收集各组细胞,提取细胞总蛋白。测定各组细胞总蛋白浓度,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、转印、封闭后加入一抗,包括LC3b、p62、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR和Tubulin,4 ℃过夜振荡孵育。洗膜后根据一抗选择相应的二抗,使用全自动化学发光图像分析系统进行显影。用Image J和Analysis软件测定杂交条带的灰度值。目标蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值为各目标蛋白的相对表达量[11]。

1.8 统计学分析 试验数据均用“平均值±标准差(Mean±SD)”表示,应用GraphPad Prism 7软件对数据进行单因素方差分析,组间差异采用t检验,以P>0.05为差异不显著,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 流式细胞术检测细胞凋亡率 结果如图1所示,20%S、15%S、10%S、5%S和0%S组SMSCs细胞凋亡率分别为(6.33±0.19)%、(7.58±0.7)%、(8.14±0.53)%、(8.51±0.3)%和(11.46±0.32)%;与20%S组相比,0%S和5%S组细胞凋亡率极显著上调(P<0.01),10%S组细胞凋亡率显著上调(P<0.05),15%S组细胞凋亡率差异不显著(P>0.05)。

2.2 流式细胞术检测细胞中线粒体膜电位 JC-1探针红、绿荧光比率代表线粒体膜电位值,结果如图2所示,20%S、15%S、10%S、5%S和0%S组细胞线粒体膜电位值分别为(12.72±0.55)%、(8.01±0.38)%、(6.77±0.16)%、(3.57±0.22)%和(2.81±0.04)%;与20%S组相比,0%S、5%S、10%S和15%S组细胞线粒体膜电位均极显著下降(P<0.01)。

图2 各组细胞线粒体膜电位检测和分析

2.3 流式细胞术检测细胞ROS水平 结果如图3所示,20%S、15%S、10%S、5%S和0%S组细胞ROS水平分别为(15.87±0.42)%、(29.96±0.46)%、(31.95±0.54)%、(39.46±1.42)%和(60.68±0.42)%;与20%S组相比,0%S、5%S、10%S和15%S组细胞ROS水平均极显著提升(P<0.01)。

图3 各组细胞ROS水平检测和分析

2.4 细胞内ATP水平测定 结果如图4所示,20%S、15%S、10%S、5%S和0%S组细胞中ATP水平分别为(4.12±0.23)、(8.01±0.3)、(9.86±0.36)、(12.64±0.55)和(23.59±2.03) nmol/L;

图4 各组细胞ATP水平检测

与20%S组相比,0%S、5%S、10%S和15%S组细胞中ATP水平均极显著提升(P<0.01)。

2.5 Western blot检测细胞自噬相关蛋白的表达 以Tubulin为内参,Western blot检测自噬标志蛋白LC3b、p62和AMPK/mTOR信号通路相关蛋白的表达。其中,LC3b-Ⅱ与LC3b-Ⅰ蛋白条带灰度值的比值代表LC3b蛋白的水平,通过p-mTOR/mTOR和p-AMPK/AMPK的比值变化分析AMPK/mTOR信号通路是否参与自噬的发生。结果如图5所示,细胞中LC3b蛋白的相对表达量随血清浓度降低而升高,p62蛋白的相对表达量随血清浓度降低而降低。与20%S组相比,15%S、10%S、5%S和0%S组LC3b蛋白的相对表达量均极显著上调(P<0.01);10%S、5%S和0%S组p62蛋白的相对表达量均极显著降低(P<0.01),15%S组p62蛋白的相对表达量显著降低(P<0.05)。p-mTOR/mTOR比值随血清浓度降低而降低,p-AMPK/AMPK比值随血清浓度降低而升高。与20%S组相比,10%S、5%S和0%S组p-mTOR/mTOR和p-AMPK/AMPK比值均差异极显著(P<0.01),15%S组差异显著(P<0.05)。

图5 Western blot检测细胞自噬及其信号通路相关蛋白的表达

3 讨论

SMSCs对动物个体出生后的肌肉发育、维持和再生具有重要作用,其受到损伤或者某些因素刺激后具有增殖和分化的能力,这直接决定了骨骼肌的生长发育和产肉性状。SMSCs在体内外的生长代谢需要一定营养能量的支撑,在体外细胞培养体系中添加一定浓度的血清可满足细胞的能量需求,血清中含有细胞生长所需的生长因子、维生素、核酸衍生物、激素和其他多种未知营养物质[12]。为了全面研究不同营养条件下动物个体肌肉发育的差异,在细胞水平检测SMSCs在不同营养条件下代谢水平的变化非常重要。细胞代谢是细胞内用于维持生命的各种各样的化学反应的总称,通过测定细胞中线粒体膜电位、细胞凋亡率、ROS和ATP水平可以较好地评估环境对细胞代谢的影响[13-16]。本试验结果显示,随着SMSCs培养体系中血清浓度的降低,细胞凋亡率升高、线粒体膜电位降低、ROS和ATP水平升高,这种变化趋势与血清浓度降低的程度呈正相关,说明长时间(96 h)血清饥饿胁迫能加速细胞代谢、促进细胞凋亡,对细胞有毒害作用。本团队前期研究了短时间(24 h)血清饥饿胁迫对SMSCs代谢的影响,发现低程度的血清饥饿(15%S)在加速细胞代谢的同时,对细胞凋亡影响不大,而更严重的血清饥饿胁迫(10%S、5%S和0%S)则会导致细胞代谢加快的同时,加速细胞凋亡[17]。

自噬是细胞通过分解亚细胞内容物以维持营养和能量动态平衡的一种保护机制。一定程度的自噬有助于细胞的修复和再生,而过度的自噬则会对细胞功能产生负面影响,进而导致细胞凋亡[18]。目前已有证据表明,自噬可以调节SMSCs的分化[19-20],然而不同程度的自噬可能对细胞的代谢及分化功能产生不同影响,最终可能成为影响动物个体肌肉发育的重要因素,但相关工作尚未见报道。营养饥饿是诱导自噬的最典型的应激源,本试验通过控制SMSCs培养基中的血清浓度来模拟营养物质缺乏,检测SMSCs发生自噬的程度。作为细胞自噬标志蛋白,p62和LC3b常被用于检测自噬发生。LC3b是自噬标志物,自噬形成时胞浆型LC3b(即LC3b-I)会酶解掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型(即LC3b-II)。p62水平升高通常标志着自噬活性受到抑制[21-23]。本试验结果显示,长时间血清饥饿胁迫后,细胞中p62蛋白相对表达量降低,而LC3b蛋白表达趋势正好与p62相反,说明血清浓度降低能够诱导细胞发生自噬,而且自噬程度与血清饥饿程度呈正比。AMPK/mTOR信号通路是细胞自噬发生的经典信号通路之一,AMPK激活后磷酸化mTOR调节相关蛋白,进而降低mTOR的磷酸化,mTOR的生物学功能被抑制,AMPK的活化和mTOR的抑制两者互相协作,共同启动自噬[24-25]。本试验结果显示,SMSCs培养体系中血清浓度降低后,p-AMPK/AMPK比值显著上升的同时,p-mTOR/mTOR比值显著降低,而且变化趋势和血清饥饿程度呈正比,表明SMSCs在血清饥饿胁迫后可通过AMPK/mTOR 通路激活细胞自噬,而且自噬的程度和血清降低的程度呈正相关。

本试验发现了长期降低SMSCs培养体系中血清浓度可以加速细胞代谢和凋亡,并且通过AMPK /mTOR信号通路激发细胞自噬,上述变化的程度和血清减少的程度呈正相关。本试验结果有助于后续研究不同程度饥饿胁迫对动物肌肉发育的影响,探究新的动物饲养模式。