杆菌肽在兽医临床的研究进展

王育丹,霍美霞,刘海燕,黄玲利,3

(1. 华中农业大学动物医学院 国家兽药残留基准实验室,湖北 武汉 430070;2. 国家兽药安全评价实验室,湖北 武汉 430070;3. 农业农村部兽药残留检测重点实验室,湖北 武汉 430070)

杆菌肽(Bacitracin,BAC)是一种多肽类抗生素,由地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的某些菌株所产生[1],作用于革兰阳性菌和部分革兰阴性菌(螺旋体、放线菌等),在动物体内代谢快,残留少,主要产品为杆菌肽锌(Bacitracin zinc,BZ)和亚甲基水杨酸杆菌肽(Bacitracin methylene disalicylate,BMD)。近年来,由于抗菌药物使用不科学和不合理,动物源性细菌耐药性不断增加,对动物源性食品安全和公共卫生安全造成了威胁。我国在2019年发布第194号公告,禁止了除中药外的促生长类药物的使用。本文着重对杆菌肽的残留检测和兽医临床应用的研究进展进行综述,为杆菌肽的临床应用提供理论支撑。

1 杆菌肽理化性质

杆菌肽,又叫枯草菌肽、枯草菌素,分子式为C66H103N17O16S,分子量为1 421.68。该药物呈淡黄或白色粉末状,有引湿性,味苦,无臭味,易溶于水,可溶解于乙醇、乙醚和丙酮溶液,与多种重金属盐类发生沉淀,耐酸性、煮沸、胃蛋白酶或胰蛋白酶消化。干式杆菌肽粉剂和非水性软膏在室温下非常稳定,若不冷藏,杆菌肽在水溶液和水溶性碱中很快就会变质。

杆菌肽存在多种异构体,是1个十二肽混合物,由1个噻唑啉环和1个七肽环构成,环状结构和链状结构分别由7个氨基酸和5个氨基酸组成[2],杆菌肽结构如图1所示。

图1 杆菌肽的结构式

杆菌肽主要产品有BZ和BMD,主要成分为杆菌肽A和杆菌肽B,含量占杆菌肽的95%以上[3]。其中,杆菌肽A的活性成分含量最高,由7个多肽组成,呈环状结构,含有1个位于酰基肽N末端的噻唑啉环[4]。

2 杆菌肽作用机制和特点

杆菌肽作用于大部分革兰阳性菌和螺旋体等部分革兰阴性菌。研究发现,杆菌肽对各种细菌的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)分别为产气荚膜梭菌256 μg/mL[5]、金黄色葡萄球菌16 μg/mL、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌32 μg/mL、耐甲氧西林表皮葡萄球菌32 μg/mL[6]、粪球肠菌32～48 μg/mL、变形链杆菌78.12 μg/mL[7]。

将大麻素大麻二酚(Cannabinoid cannabinol,CBD)与杆菌肽合用,CBD可增强杆菌肽对革兰阳性菌(葡萄球菌属、单核细胞增生李斯特菌和粪肠球菌)的作用,且MIC降低了至少64倍[8]。将粘菌素与杆菌肽联合使用,可以使金黄色葡萄球菌的MIC降到1/2 MIC[9]。研究表明,猪链球菌和产气荚膜梭菌等对杆菌肽具有耐药性,许多革兰阳性菌生物体中存在“Bce型”三磷酸腺苷结合盒(ATP binding cassette,ABC)转运蛋白,该蛋白能形成具有双组分系统的蛋白质复合物,这些组分共同感知并对细胞表面的杆菌肽产生抗性[10]。Ma等[11]通过比较基因组学和蛋白质同源性分析发现,有毒的猪链球菌菌株都含有SstFEG编码的1种潜在的外排泵,SstFEG参与猪链球菌在动物感染模型中的定植,通过其潜在的竞争性生存优势对抗宿主的杀菌作用。

杆菌肽的抑菌机制主要有3种:(1)阻碍细菌细胞壁的合成,Siewert等[12]研究表明,杆菌肽通过脂质载体的去磷酸化而阻碍脂质载体进入细胞,从而抑制肽聚糖的合成,最终抑制细菌细胞壁的合成;(2)损害细菌细胞膜的通透性,导致细胞无法维持渗透压平衡,从而引起细菌破裂死亡[13];(3)诱导细菌核酸降解,尤其是RNA,Ciesioka等[14]采用几种模型RNA和DNA寡聚物检测杆菌肽的核酸降解活性,结果表明,杆菌肽通过诱导鸟苷残基中RNA的降解而干扰了细菌蛋白的合成。近年来也有研究表明,杆菌肽还可以影响细菌生物膜的形成,Zaidi等[7]使用1/2 MIC,即39.06 μg/mL的杆菌肽处理变形链球菌后,其生物膜的形成显著降低。

杆菌肽经口服后几乎不被胃肠道吸收,在器官和组织中的分布可忽略不计。在大鼠、鸡和猪中,约95%的口服剂量通过粪便排泄,仅3%或更少通过尿液排泄。杆菌肽通过主要代谢产物脱酰胺杆菌肽代谢为氨基酸和较小的肽,在微生物学上不起作用。粪便中的主要代谢物为杆菌肽A、B1、B2、F、脱酰胺杆菌肽和分解代谢肽,尿液和胆汁中仅存在水解裂解产物(二肽和三肽)[15]。

3 杆菌肽安全性

3.1 杆菌肽的毒理学特征 根据给药途径的不同,杆菌肽表现出不同程度的毒性反应。注射时毒性最强,口服时毒性最弱。杆菌肽经不同途径给药对小鼠、大鼠和鹌鹑的急性毒性半数致死量(Median lethal dose,LD50)如表1所示[16]。

表1 杆菌肽经不同途径给药对不同动物的LD50[16]

全身应用杆菌肽时会损伤肾脏,主要表现在肾小管,同时抑制肾小球的滤过功能,引起严重的肾毒性反应,有时甚至会出现蛋白尿和管型尿等现象,肾功能逐渐退化,严重者可导致急性肾小管坏死和动物死亡。当杆菌肽使用剂量接近LD50时,会对小鼠的肾小管造成损害,偶尔对猴子造成损害,但对大鼠和犬的损害较小;局部应用时,可能会导致过敏,主要表现为皮肤红肿、皮疹和局部瘙痒,偶尔出现严重的全身过敏[16]。

3.2 杆菌肽在靶动物的安全性 杆菌肽具有优良的安全性。BZ按250 mg/(kg·bw)剂量给药,对4周龄仔猪无明显的临床和病理损伤,表明BZ对仔猪无毒副作用。杆菌肽的污染物致突变性检测(Ames)试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和睾丸染色体畸变试验的结果也均为阴性[17]。

孙晨明等[18]研究了BMD预混剂对鸡的安全性,按临床推荐剂量55 mg/(kg·bw·d)的1、3和5倍剂量混饲连续给药42 d,结果显示,所有受试动物均存活,临床表现、病理剖检和血液生理生化指标均无异常。贺文庆[19]研究了BMD预混剂对鸭的安全性,按临床推荐剂量50 mg/(kg·bw·d)的1、3和5倍剂量混饲连续给药42 d,结果显示,所有试验组动物均未死亡,且临床表现、病理剖检和血液生理生化指标均正常。胡雪[20]研究了BMD可溶性粉对兔的安全性,受试药以杆菌肽计,按临床推荐剂量6 mg/(kg·bw·d)的1、3和5倍剂量混饮连续给药21 d,结果显示,兔发育正常,病理剖检也未见异常。上述研究表明,BMD按推荐剂量给药,对靶动物鸡、鸭和兔具有较大的安全性。

4 杆菌肽在动物体内的残留消除研究

欧盟规定:牛奶中杆菌肽的残留不超过100 μg/kg,兔可食性组织中杆菌肽的残留量不超过150 μg/kg[15]。美国规定:在牛、猪、鸡、火鸡、稚鸡、鹌鹑以及奶和蛋中,杆菌肽的残留量不超过500 μg/kg[21]。我国《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》标准规定:杆菌肽在猪、牛和家禽的可食性组织及禽蛋和奶中的最大残留量不超过500 μg/kg[22]。

4.1 杆菌肽残留检测方法 目前,杆菌肽残留检测方法主要有微生物检测法、免疫分析法、高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)、毛细管电泳色谱法和液相色谱-串联质谱法(Liquid chromatography mass spectrometer,LC-MS/MS),具体原理和优缺点见表2。

表2 杆菌肽残留检测方法

4.1.1 微生物检测法 王正彬等[23]建立了杆菌肽在草鱼、鳗鲡和对虾肌肉中的测定方法,该方法选择藤黄微球菌(Micrococcusluteus)为检测菌种,以0.1%甲酸水-甲醇(7∶3)提取药物,正己烷除脂,当不同水产品肌肉组织中杆菌肽添加浓度在0.5～2.5 μg/g时,各组织回收率均在70%以上,变异系数均在15%以下。郭桂芳等[24]建立了猪可食性组织中杆菌肽的残留检测方法,当猪组织样品中杆菌肽添加浓度在 0.025～0.1 IU/g时,回收率均在80%以上,检测限(Limit of detection,LOD)为0.025 IU/g(相当于410 μg/kg)。

4.1.2 免疫分析法 那冠琼[25]通过人工合成免疫原免疫小鼠后成功制备单抗,建立了检测牛奶中BZ残留的胶体金试纸条;牛奶样品中杆菌肽添加浓度在0.97～10.29 ng/mL范围内,裸眼LOD为25 ng/mL,仪器扫描灰度值LOD为0.82 ng/mL,平均回收率在80%以上,变异系数小于15%。刘宏军等[26]制备了ELISA检测试剂盒,可用于检测猪肉、猪肝和牛奶中杆菌肽的残留,检测范围在1.0～81.0 μg/L,猪肉、猪肝和牛奶的 LOD分别为20、20和26 μg/kg,线性关系良好(r>0. 99),平均回收率在70%以上,变异系数在15%以下,表明该ELISA检测试剂盒具有灵敏度高、检测快速和稳定等特点。

4.1.3 高效液相色谱法 焦洋[27]建立了检测脂质体中杆菌肽含量的高效液相色谱法,以磷酸盐缓冲液-甲醇(60∶40,pH 6)为流动相等度洗脱,检测波长为254 nm,药物浓度在0.061～1.830 μg/mL范围内,检测浓度与目标峰面积线性关系良好,平均回收率达100.53%。常用的液相检测器主要有紫外检测器(Ultraviolet detector,UVD)、荧光检测器(Fluorescence detector,FLD)、蒸发光散射检测器(Evaporative light-scattering detector,ELSD)和化学发光检测器(Chemiluminescent detector,CD)。其中,FLD灵敏度高,选择性强,应用广泛,可用于能激发荧光的化合物的检测,而多肽类药物多数无荧光反应,经衍生后方可使用该方法,常用的衍生化制剂有异氰硫基苯和邻苯二甲醛。Capitan-Vallvey等[28]建立了检测动物饲料中杆菌肽含量的高效液相色谱-荧光检测法(High performance liquid chromatography-fluorescence detection,HPLC-FLD),以邻苯二甲醛为衍生制剂,该方法的LOD为2.5 mg/L,定量限(Limit of quantification,LOQ)为7.5 mg/L。

4.1.4 毛细管电泳色谱法 Injac等[29]建立了测定饲料中BZ含量的胶束电动毛细管电泳色谱法,在毛细管中因电场力的驱动,目标物和其他物质在胶束相和水相间发生分配行为,从而迁移分离,该方法的LOD为4.72 mg/L。因毛细管管径的限制,雷霄云等[30]通过对毛细管加压,与灵敏度更高的激光诱导荧光检测器联用,用4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并呋咱[4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole,NBD-F]衍生后,建立了用于多肽类抗生素残留检测的毛细管电色谱-激光诱导荧光联用技术(Capillary electrochromatography-laser induced fluorescence,CEC-LIF),该技术适用于检测牛奶和饲料中包括杆菌肽在内的3种环状多肽,该方法的LOD为10 ng/mL,回收率介于72.9%～112.4%,可满足相关残留检测要求。

4.1.5 液相色谱-串联质谱法 LC-MS/MS是检测饲料中兽药含量和分析兽药残留的重要手段。高嫣珺等[31]建立了动物可食性组织和禽蛋中杆菌肽残留的高效液相色谱-串联质谱法(High performance liquid chromatography mass spectrometry,HPLC-MS/MS)检测方法,药物浓度在50～1 000 ng/g,组织中杆菌肽添加浓度与目标峰面积有较好的线性关系,平均回收率大于70%,批内和批间变异系数均小于15%。除上述方法外,超高效液相色谱-串联质谱法(Ultra high performance liquid chromatography mass spectrometry,UPLC-MS/MS)可提高分析效率和检测灵敏度,使样品在短时间内完成分离。杜业刚等[32]建立了一种可同时测定动物源性食品中8种多肽类抗生素的检测方法,结果显示,在10～1 000 μg/L范围内,线性关系良好,回收率和变异系数均满足检测要求。Bladek等[33]开发并验证了可用于测定动物肌肉、牛奶和鸡蛋中多肽抗生素残留的新型UPLC-MS/MS方法,该方法首次基于碱性提取剂来检测动物源性食品中多肽类抗生素,与采用酸性萃取相比,该方法具有新颖性,可对10～1 000 μg/kg线性范围内的多肽进行定量,回收率在70%～99%,变异系数小于15%,具有较好的实用性。

4.2 杆菌肽在动物体内的残留消除特征 全家兴[3]将BMD可溶性粉按6 mg/(kg·bw),2 次/d,连续10 d混饲给药,研究杆菌肽在兔子可食性组织中的残留消除规律,结果表明,杆菌肽在兔子可食性组织中无残留。贺文庆[19]将BMD按250 mg/kg浓度添加在饲料中,连续饲喂20 d后,对鸡的可食性组织中的药物残留进行检测,结果表明,BMD在鸡体内无残留。

5 杆菌肽临床应用

在畜禽上,杆菌肽主要用作饲料添加剂,用于提高饲料的转化率和畜禽的体重,也可用于治疗畜禽肠道感染性疾病。2019年,我国农业农村部发布第194号公告,规定自2020年1月1日起,杆菌肽不可再作为促生长剂进行使用。

研究发现,杆菌肽可用于治疗畜禽胃肠道疾病,临床上主要用于防治畜禽的坏死性肠炎,产品主要是BZ和BMD。胡雪[20]开展的药效学试验证明,在推荐剂量6 mg/(kg·bw·d),连续混饮给药10 d,BMD能有效治疗兔坏死性肠炎,且无不良反应。沈建忠等[34]研究也表明,BMD对C型魏氏梭菌有明显的抑菌作用,MIC为1.5 μg/mL,在推荐剂量每公斤饮水中分别加入50、100和200 mg BMD,连续混饮给药7 d,对鸡坏死性肠炎具有良好的疗效。Kyriakis等[35]将仔猪断奶后到156 d分为3个阶段,以3种剂量将BZ混饲给药,发现36个治疗组的表现均优于对照组,且高剂量组(300或200 ppm)优于低剂量组(200或100 ppm、100或50 ppm)。将BMD按275 mg/kg添加在母猪围产期(产前2周～产后3周)饲料中,可用来控制仔猪的梭菌肠炎[36]。同时,美国也已经批准BMD用于控制猪痢疾。

杆菌肽对动物肠道健康也有一定的影响。Chen等[37]用不同浓度的BMD进行日粮补充,饲喂断奶兔35 d,结果显示,在补充剂量为50～100 mg/kg的情况下,BMD能够提高肠道吸收能力,改善肠道酸碱度,利于有益细菌的存活,维持肠道的健康。Proctor等[38]按100 mg/kg剂量将BMD加入30日龄仔鸡的日粮中连续18 d后,仔鸡肠道微生物多样性提高,肠道稳定性增强,同时坏死性肠炎等胃肠道疾病暴发期间的潜在病原体减少。

6 展望

近年来,各国对兽药滥用和细菌耐药性问题越来越重视,我国已禁止杆菌肽在兽医临床中作为促生长制剂使用。美国、韩国等多个国家已经批准其产品BMD用于猪梭菌性肠炎的治疗,大量研究也已经表明,BMD可以用于治疗鸡和兔的坏死性肠炎。基于杆菌肽无残留和安全性好等特点,未来可促进该药物转治疗注册的申请,在畜禽的胃肠道疾病方面发挥治疗作用。同时,由于杆菌肽广泛的应用和耐药性的产生,建立方便、快捷和灵敏的残留检测方法,对于其在临床的合理使用尤为重要。