驴消化道3种线虫的扫描电镜观察及其系统发育分析

菅 蕊,张文娜,张东红,解立斌,宋素洁,冯笑颜,剧慧栋,4

(1.承德医学院基础医学院,河北 承德 067000;2. 石家庄学院化工学院,河北 石家庄 050000;3. 河北资源环境职业技术学院,河北 石家庄 050000;4.河北省疑难细菌研究重点实验室,河北 石家庄 050000)

驴消化道寄生虫主要以圆线科线虫(Strongylidae Baird,1853)为主,严重威胁宿主的生命和健康,不同种类的线虫对宿主的致病机制有所不同,因此,准确迅速地识别寄生线虫可以有效地降低其对宿主的危害[1-2]。圆线科线虫在体前端的结构,尤其是头部乳突、口囊、内叶冠和外叶冠等结构,以及雄虫尾部生殖锥的形态是重要的形态学分类依据,扫描电子显微镜可以更准确地对驴寄生线虫的形态特征进行观察和描述[3-5]。

本试验首次对采自我国新疆维吾尔自治区的驴消化道内的马圆形线虫、无齿圆形线虫和杯状彼得洛夫线虫的体表形态进行详细的观察和描述,为上述3种线虫的分类鉴定提供更精确的形态学依据,并在形态学鉴定的基础上,基于线虫核糖体DNA内转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)基因对其进行系统发育分析,建立系统发育树,结果表明,马圆形线虫、无齿圆形线虫和杯状彼得洛夫线虫依据形态学鉴定结果与系统发育树中该种的分类学地位一致。

1 材料与方法

1.1 主要材料 马圆形线虫、无齿圆形线虫和杯状彼得洛夫线虫,采自我国新疆维吾尔自治区驴(Equusasinus)的肠道内容物,用80 ℃左右的热水将虫体烫直,将线虫保存于70%酒精中并记录宿主种名、寄生部位、采集时间和地点,利用光学显微镜观察虫体,通过形态学特征确定其种类分别是马圆形线虫、无齿圆形线虫和杯状彼得洛夫线虫。透明液(乳酸∶苯酚∶蒸馏水∶甘油=1∶1∶1∶2),河北师范大学生命科学学院动物系统学与分子进化实验室配制;DNA提取试剂盒,购自天根生化科技(北京)有限公司;PCR试剂盒和蛋白酶K,均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 主要仪器 扫描电子显微镜(HITACHI S-4800),日立公司产品;光学显微镜(Nikon E200MV),尼康公司产品。

1.3 线虫扫描电子显微镜样品的制备和观察 取保存于70%酒精溶液中的线虫标本用0.1 mol/L 的磷酸盐溶液清洗3次,每次15 min;使用戊二醛(浓度2.5%)溶液固定3 h;使用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液清洗3次,每次15 min;锇酸(浓度1%)溶液固定1 h;再用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液清洗3次,每次15 min;再进行脱水,用乙醇作为脱水剂,按照70%、80%、90%和100%的梯度进行2次脱水,每次脱水时间为20 min;将脱水的样品放入醋酸异戊酯中30 min。使用临界点干燥法进行干燥:(1)样品室预冷(注入液氮)→(2)样品放入样品室→(3)注入液态二氧化碳(样品室体积的70%)→(4)用二氧化碳置换样品中的醋酸异戊酯(温度调到20 ℃,压力应达到50～70 kg/cm2,保持20 min)→(5)临界处理,温度提高到40 ℃,压力应达到80～100 kg/cm2,保持5 min→(6)放气,速度在100～500 mL/min→(7)当压力低于30 kg/cm2时,切断加热器→(8)压力为0时,取出样品,用双面胶或导电胶将样品固定在专用的样品台上,进行喷金,扫描电子显微镜观察并拍照[6]。标本保存于河北师范大学生命科学学院。

1.4 线虫ITS基因的PCR扩增和序列分析 从70%酒精中分别取出每种线虫的1条雌虫,分别置于不同的1.5 mL离心管内做好标记,用蒸馏水漂洗3～5次,按照DNA提取试剂盒说明书操作提取DNA,分成两段扩增ITS目的片段,之后再进行拼接。2对引物分别为NC5、NC1R和NC13、NC2[7-9],由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其核酸序列分别为:NC5(5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′)(forward);NC1R(5′-AACAACCCTGAACCAGACGT-3′) (reverse);NC13(5′-ATCGATGAAGAACGCAGC-3′) (forward);NC2(5′-TTAGTT-TCTTTTCCTCCGCT-3′) (reverse)。预期PCR扩增片段每段长度约为500 bp,拼接后约为1 000 bp。

PCR 反应总体系(50 μL):DNA模板5 μL,上、下游引物各1 μL,2×TaqMasterMix 25 μL,ddH2O 18 μL。PCR扩增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。阳性PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序结果进行人工校对拼接,并在GenBank上进行BLAST比对分析。使用BioPerl 5.8软件对本试验测序结果与GenBank中圆线科线虫的ITS序列(共11条)进行同源性分析。为了分析上述3种线虫的分类学地位,分别用最大似然法(Maximum likelihood method)和贝叶斯法(Bayesian method),将Oesophagostomumdentatum(AJ619979)设置为外群,构建系统发育树探讨线虫间的亲缘关系[10],只标注支持度>50%(重复1 000次)。

2 结果

2.1 扫描电子显微镜观察

2.1.1 马圆形线虫[Strongylusequinus(Mueller,1780)]

采集地点:中国新疆维吾尔自治区

宿主:驴(Equusasinus)

雄虫和雌虫各观察3条,雄虫和雌虫在头端无明显差异。光学显微镜观察发现,虫体两端稍细,口领高0.22 mm(0.21～0.23 mm),宽0.7 mm(0.6～0.8 mm)。口囊呈椭圆形,深0.8 mm(0.6～0.9 mm),宽0.7 mm(0.6～0.8 mm)。在口囊基部有4个突出的齿,2个位于亚腹面,2 个位于亚背面。亚腹齿分开;亚背齿不分开,较粗大,并高于亚腹齿。背沟长。中部粗壮,红褐色,体表具角质横纹。扫描电子显微镜观察发现,排泄孔位于口囊前1/3处(图1 A和1 B),颈乳突1对,小刺状,位于体侧,长35 μm(30～39 μm)(图1 C和1 D)。内叶冠短宽约80枚,外叶冠细长,约180枚,头部直径650 μm(635～670 μm),口孔直径160 μm(150～175 μm)(图1 E)。亚中乳突4个,基部膨大,直径10 μm(7～13 μm),顶端细(图1F),头感器2个,有明显横沟状凹陷,直径24 μm(20～26 μm)(图1G)。雄虫交合伞具2个发达的侧叶和1个不发达的背叶,边缘平滑(图1H)。生殖锥具有指状附属物,长85 μm(80～90 μm)(图1I)。雌虫阴门位于虫体后1/4处,开口椭圆形,直径60 μm(50～65 μm)(图1J),尾部钝圆,肛门半月形,长150 μm(120～180 μm),距尾200 μm(170～220 μm)(图1K)。

图1 马圆形线虫的扫描电子显微镜观察

2.1.2 无齿圆形线虫[Strongylusedentatus(Looss,1900)]

采集地点:中国新疆维吾尔自治区

宿主:驴(Equusasinus)

雄虫和雌虫各观察3条,雄虫和雌虫在头端无明显差异。光学显微镜观察发现,口囊呈球形,宽1.0 mm(0.8～1.1 mm),在口囊的背壁上有1个背沟,深0.8 mm(0.7～0.9 mm),向前延伸开口于口囊的前缘。虫体粗壮,两端稍细,体表具角质横纹。扫描电子显微镜观察发现,口领高而明显,头部直径750 μm(700～790 μm),口孔直径150 μm(130～180 μm),外叶冠细长,约80枚(图2 A)。亚中乳突4个,基部膨大,直径8 μm(6～10 μm),顶端细(图2 B),头感器2个,无明显凹陷,直径14 μm(11～18 μm)(图2 C)。颈乳突1对,小刺状,位于食道中部后方。雄虫交合伞具2个发达的侧叶和1个不发达的背叶,边缘平滑,背肋先分为2支,再分为3支(图2 D和2 E)。生殖锥较长,具有2对附属物,第1对宽,乳头形,第2对细长,长60 μm(50～69 μm)(图2 F)。雌虫阴门位于虫体后1/4处,开口椭圆形,直径89 μm(80～99 μm)(图2 G),尾部钝圆,肛门半月形,长200 μm(180～210 μm),距尾250 μm(230～260 μm)(图2H)。

图2 无齿圆形线虫的扫描电子显微镜观察

2.1.3 杯状彼得洛夫线虫[Petrovinemapoculatum(Looss,1900)]

采集地点:中国新疆维吾尔自治区

宿主:驴(Equusasinus)

雄虫和雌虫各观察3条,雄虫和雌虫在头端无明显差异。光学显微镜观察发现,内叶冠起始于口囊前缘稍后方,数目多。口囊壁自前向后逐渐弯曲增厚,至后1/4左右最厚,后端又持续变薄。口囊侧壁中部有1个横脊伸向口囊内腔。口囊呈柱状,深度稍大,宽度稍小,口囊的前后宽度大体相等,前端部稍窄,中央偏前方最宽。食道长。扫描电子显微镜观察发现,口领低而平缓,与虫体间无明显分割,头径79 μm(70～85 μm),口孔直径37 μm(30～45 μm),外叶冠细小,刺状,为32枚(图3A)。颈乳突刺状,长30 μm(25～34 μm),与排泄孔大致在同一平面(图3B和3 C)。亚中乳突突出,长18 μm(15～20 μm)(图3D),头感器丘状凸起,宽10 μm(8～15 μm)(图3E)。雄虫交合伞背叶和侧叶较明显,边缘锯齿状,生殖锥发达且伸长,几乎与交合伞侧叶等长300 μm(280～350 μm),具1对小囊状附属物,交合刺远端有倒钩(图3F和3G)。雌虫阴门开口圆形,宽17 μm(14～20 μm),距肛门115 μm(100～125 μm),肛门开口月牙形,长75 μm(60～80 μm),尾长320 μm(305～330 μm),末端平滑渐细(图3H)。

图3 杯状彼得洛夫线虫的扫描电子显微镜观察

2.2 基于ITS序列的同源性分析和系统发育分析

2.2.1 同源性分析 将本试验中经PCR扩增和测序获得的马圆形线虫和无齿圆形线虫的ITS序列与NCBI中普通圆形线虫的ITS序列进行比对,结果显示,马圆形线虫与无齿圆形线虫的同源性分别为90.0%,两者与普通圆形线虫的同源性分别为78.4%和80.0%,表明马圆形线虫与无齿圆形线虫有很近的亲缘关系,而两者与普通圆形线虫的亲缘关系稍远,结合三者的形态学特征,三者应属于同一属。

本试验测得的杯状彼得洛夫线虫的ITS序列与NCBI中冠环属的冠状冠环线虫的ITS序列同源性较高,为99.5%,与盅口亚科其他属的代表种类的相似度介于80.0%～99.5%,其形态特征也符合盅口亚科线虫的鉴定特征,因此杯状彼得洛夫线虫应属于盅口亚科,但是杯状彼得洛夫线虫的形态特征与冠状冠环线虫及其他盅口亚科线虫的形态有较大差别,因此,虽然杯状彼得洛夫线虫与冠状冠环线虫具有相似度较高的ITS序列,但是两者应该为不同属。

2.2.2 系统发育分析 本试验测得的线虫的ITS序列和NCBI中圆线科线虫的11条ITS序列,包括2亚科9属11种,以最大似然法和贝叶斯法建立的系统发育树结果显示,马圆形线虫、无齿圆形线虫和普通圆形线虫聚为一支,杯状彼得洛夫线虫与盅口亚科其他种类聚为一支(图4)。

图4 基于ITS序列采用贝叶斯法(A)和最大似然法(B)构建的系统发育树

3 讨论

马圆形线虫、无齿圆形线虫和杯状彼得洛夫线虫是驴消化道常见的大型寄生虫,严重危害宿主健康,因此有必要对其进行详细的研究。目前,对于上述3种线虫的研究主要集中在分子鉴定、病理学研究、治疗药物研发和应用等,而对寄生虫的准确鉴定,尤其是基于形态学的鉴定是分子鉴定和其他研究的基础,本试验首次使用扫描电子显微镜对上述3种线虫进行观察描述和测量。

本试验扫描电子显微镜观察结果显示,马圆形线虫雄虫生殖锥具有2对指状突起,一长一短;无齿圆形线虫具有2对附属物,分别为乳头状和细长状的形态特征,补充了前人的描述。张路平等(2014年)[5]通过光学显微镜观测到马圆形线虫有内叶冠75～85枚,外叶冠172～189枚,无齿圆形线虫外叶冠75～80枚;本试验观测到马圆形线虫有内叶冠80枚,外叶冠约180枚,无齿圆形线虫外叶冠80枚;与张路平等(2014年)[5]结果相似。本试验观测到杯状彼得洛夫线虫的外叶冠呈刺状,32枚,不同于张路平等(2014年)[5]的35枚,支持Lichtenfels 等(2008年)[11]的结果(30～36枚)。另外,本试验首次利用扫描电子显微镜观察到马圆形线虫雄虫尾部的生殖锥具有指状附属物;无齿圆形线虫雄虫尾部生殖锥较长,具有2对附属物,第1对宽,乳头形,第2对细长;杯状彼得洛夫线虫雄虫尾部具1对小囊状附属物。

本试验基于圆线科ITS基因构建系统发育树,结果显示,马圆形线虫、无齿圆形线虫和普通圆形线虫聚为一支,说明三者具有较近的亲缘关系,这与三者具有相似的形态特征,同属于圆形亚科圆线属有关;盅口亚科各属的代表种类聚为一支,包含本试验中的杯状彼得洛夫线虫,说明杯状彼得洛夫线虫应属于盅口亚科,根据其形态特征将其归于彼得洛夫属是准确的;圆形亚科三齿属中的锯齿三齿线虫[Triodontophorusserratus(Looss,1900)]与盅口亚科聚为一支,但是锯齿三齿线虫与盅口亚科线虫的形态差距较大,说明系统发育分析在线虫分类学鉴定中存在一定的局限性,针对这种形态学鉴定结果与系统发育分析结果不相符的现象需要进一步研究。

消化道寄生线虫严重威胁驴的健康,人类误食感染寄生虫或寄生虫卵的驴肉有潜在感染寄生虫的风险。本试验使用扫描电子显微镜更准确、形象、立体的展示了3种线虫的体表形态特征,为准确鉴定线虫种类提供了影像学依据;同时,本试验还在形态学鉴定基础上进行了系统发育分析,同源性和系统发育树结果显示,本试验中的3种线虫的分子分类结果与形态学特征一致。