沙雷氏菌PFMP-5发酵条件的优化

丁 磊，徐玉梅，王建明

（山西农业大学农学院，山西太谷030801）

沙雷氏菌PFMP-5发酵条件的优化

丁 磊，徐玉梅，王建明

（山西农业大学农学院，山西太谷030801）

利用生防菌防治温室大棚根结线虫已逐渐成为当前保护地栽培蔬菜病害防控治理的一种新方法。试验主要对山西农业大学植物病理学重点实验室分离得到的对根结线虫有明显防效的生防细菌菌株PFMP-5的发酵条件进行优化。结果表明，最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为蛋白胨，最适合菌株的发酵时间为30 h，最佳pH值为7，最佳发酵温度为28℃，最佳接种量为5%，最佳装液量为150 mL，最佳转速为180 r/min，最佳NaCl浓度为6%。

根结线虫；沙雷氏菌；发酵条件优化；PFMP-5

黏性沙雷氏菌（Serratia marcescens），又称灵杆菌（Bacilus prodigiosus），革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，属肠道菌科沙雷氏菌属，菌体较小，周生鞭毛或极生鞭毛，能运动[1-3]。菌株呈球形，有荚膜，菌落较整齐，在28℃下培养有红色色素产生，菌落有黏性，呈中心颗粒状且有恶臭气味，广泛存在于水、土壤和食品中[4-5]。

从1990开始逐渐有研究人员发现，黏质沙雷氏菌可使烟草、黄瓜等植物产生抗病性和抵抗多种病原物[6]。PRESS等[7]研究发现，黏质沙雷氏菌可诱导烟草、黄瓜等植物产生抗性和抵抗多种病原物的侵袭。黏质沙雷氏菌次生代谢物灵菌红素可破坏TMV病毒粒体，使其失去侵染能力[8]。齐放军等[9]和杨琼等[10-11]分别报道了从罹病甜菜夜蛾虫体上分离到黏质沙雷氏菌致病菌株QL01，QL09和B30，对甜菜夜蛾幼虫有致死作用。邓彩萍等[12-13]从光肩星天牛（Anoplophora glabripennis（Motschulsky））刻槽中分离的黏质沙雷氏菌BH-1对光肩星天牛低龄幼虫（浓度为7.8×1010cfu/mL）的致死率可达80.6%。金虹等[14]报道了黏质沙雷氏菌对宽须蚁蝗（Myrmeleotettix palpalis（Zubovsky））若虫的毒杀作用。黏质沙雷氏菌菌株SRM和EML-SE1分别对棉铃虫（Helicoverpa armigera Hübner） 和小菜蛾（Plutella xylostella L.）幼虫有较高的致病力[15-16]。黏质沙雷氏菌PS-1是首次从罹病黄曲条跳甲（Phyllotreta striolata（Fabricius））幼虫体分离筛选的、对黄曲条跳甲有很高致病性的菌株[17]。

郭坚华等[18]研究表明，在温室和田间小区试验中，沙雷氏菌对辣椒青枯病都有一定的防治效果。陶科等[19]研究证明，沙雷氏菌HR-3是蝗虫的致病菌。山西农业大学植物病理学根结线虫课题组前期研究发现，一株生防细菌PFMP-5对根结线虫有很好的毒杀作用。

本研究主要对PFMP-5菌株的发酵条件进行优化，旨在为该菌后期的大规模生产提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 培养基的制备

蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，蔗糖10 g，水1 000 mL，将制成的液体发酵培养基分别装入三角瓶中（150 mL/瓶），然后将培养基放入高压灭菌锅115℃灭菌30 min。

1.2 单一因素试验

发酵条件的优化主要采用单一因素试验分析，主要优化指标及其设计包括：碳源（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖及淀粉），氮源（硝酸钾、硫酸铵、谷氨酸、蛋白胨、硝酸铵），pH值（4，5，6，7，8，9），温度（26，28，30，32，34℃），接种量（1%，3%，5%，7%，9%），培养时间（6，12，24，30，36，48 h），装液量（90，110，130，150，170 mL），转速（0，60，120，180，240 r/min），NaCl浓度（4%，6%，8%，10%，12%），在30℃的条件下恒温培养24 h，定期用分光光度法测定其OD600吸光值，每处理重复3次，以确定各个因素的最佳值。

1.3 数据分析

采用SPSS软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对沙雷氏菌PFMP-5生长的影响

从图1可以看出，沙雷氏菌PFMP-5对5种碳源均有不同程度的利用，其中对乳糖的利用率最低，OD600值仅为0.74。对麦芽糖、葡萄糖的利用率相差略微，对蔗糖的利用率最高，其OD600值达到了1.35。因此，最佳碳源为蔗糖。

2.2 不同氮源对沙雷氏菌PFMP-5生长的影响

从图2可以看出，对沙雷氏菌PFMP-5的生长抑制性最强的是硝酸铵，其OD600值仅有0.91。硝酸钾、硫酸铵和谷氨酸对菌株的生长影响较小，OD600值分别为2.40，2.04和3.06，蛋白胨对沙雷氏菌PFMP-5的生长最有益，经检测其OD600值为3.54。因此，最佳氮源为蛋白胨。

2.3 不同发酵时间对沙雷氏菌PFMP-5生长的影响

从图3可以看出，沙雷氏菌PFMP-5在培养6～12 h时处于其生长的调整期，12～30 h属于生长繁殖的对数期，菌量增长速度很快。培养30 h后，沙雷氏菌PFMP-5开始生长缓慢。表明最适合菌种的发酵时间为30 h。

2.4 不同pH值对沙雷氏菌PFMP-5生长的影响

由图4可知，pH值的变化对沙雷氏菌PFMP-5的生长影响非常明显，以pH值7为最高点，两边呈下降趋势，强酸和强碱的环境都会抑制沙雷氏菌PFMP-5的发酵。当pH值为7时，OD600值最高，可达3.93。因此，该菌株培养的最佳pH值为7。

2.5 不同发酵温度对沙雷氏菌PFMP-5生长的影响

从图5可以看出，培养温度对沙雷氏菌PFMP-5的生长繁殖有明显的影响。28℃作为一个最高点，之后随着温度的升高，OD600值在下降，当温度达到34℃时，OD600值最低，仅为0.22。同样，温度低于28℃也不利于该菌的生长。在28℃时该菌生长最快，OD600值为0.50。因此，该菌株的最佳发酵温度为28℃。

2.6 不同接种量对沙雷氏菌PFMP-5生长的影响

由图6可知，接种量对PFMP-5的生长状况影响较大。其中，接种量1%，3%，5%，7%，9%的OD600值依次为1.15，1.68，2.30，1.66，1.53，因此，5%为最佳接种量。

2.7 不同装液量对沙雷氏菌PFMP-5生长的影响

由图7可知，装液量的多少对沙雷氏菌PFMP-5的生长状况影响不大。OD600值在150 mL时最高，装液量增加至170 mL时，OD600值降低，为2.35，装液量下降至130，110，90 mL时，OD600值也随之降低，分别为2.38，2.22，1.08，因此，发酵最佳装液量为150 mL。

2.8 不同转速对沙雷氏菌PFMP-5生长的影响

由图8可知，转速对沙雷氏菌PFMP-5的生长有明显影响，当转速为0，60 r/min时，该菌数量处于低水平，其OD600值分别为0.63和0.72。逐渐增加转速值至120，180 r/min时，沙雷氏菌PFMP-5增长加快，其OD600值分别为1.36和2.21，而转速值增至240 r/min时，沙雷氏菌PFMP-5数量开始下降，OD600值为1.68，因此，发酵培养的最佳转速为180 r/min。

2.9 不同NaCl浓度对沙雷氏PFMP-5生长的影响

由图9可知，NaCl浓度对沙雷氏菌PFMP-5的生长影响明显。当NaCl浓度为6%时，OD600值最高，达到2.08。调低NaCl浓度至4%时，OD600值降至1.45。而当NaCl浓度高于6%时，OD600值降至1.0左右。所以，最适NaCl浓度为6%，此时对沙雷氏菌PFMP-5的生长繁殖最有利。

3 结论与讨论

本研究通过沙雷氏菌PFMP-5菌株的发酵时间、接种量、装液量、NaCl浓度、pH值、发酵温度、转速、碳源及氮源等发酵条件筛选试验，筛选出该菌的最优发酵条件为：最佳碳源是蔗糖，最佳氮源是蛋白胨，最适合菌株的发酵时间为30 h，最佳pH值是7，最佳发酵温度为28℃，最佳接种量为5%，最佳装液量为150 mL，最佳转速为180 r/min，最佳NaCl浓度为6%。

此外，沙雷氏菌在医药卫生、环境保护、纺织染料方面具有广阔的应用前景和巨大研发价值，尤其是沙雷氏菌的次生代谢产物灵菌红素，已发现具有多种生物活性作用，能抗癌、抗微生物、抗疟疾、抗霉、免疫抑制的作用[20-21]。尤其在抗癌方面，因其具有癌组织的高针对性和对正常细胞则表现的低毒害作用，是一种非常有潜力的抗癌物质[22]。但是有关沙雷氏菌防治植物病害的报道仍然较少，本研究将沙雷氏菌初步应用于根结线虫的室内防治中，但是要将其应用到根结线虫的生产防治中还需要进一步的探索和实践。

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Optimization of Ferment Conditions of Serratia marcescens PFMP-5

DINGLei，XUYumei，WANGJianming

（College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Biocontrol of root-knot nematodes（Meloidogyne）by bacteria has become a new method of vegetable disease management in greenhouse.A bacterial strain PFMP-5 isolated with high preventive and therapeutic effect to root-knot nematodes.In this paper,the optimum composition ofculture medium and cultivation parameters of strain PFMP-5 was studied.The result showed that the optimum condition were as following:the optimal carbon source was sucrose,the optimal nitrogen source was peptone,the optimal ferment time was 30 hours,the best pH was 7,the optimal ferment temperature was 28℃,the proportion of inoculum was 5%,the ideal volume was 150 mL,the rotation speed was 180 r/min and the best NaCl concentration was 6%.

root-knot nematodes;Serratia marcescens;optimization offerment conditions;PFMP-5

Q93-335；S476

A

1002-2481（2017）03-0386-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.03.16

2016-10-26

山西省科技攻关项目（20120311019-3）；山西省应用基础研究计划项目（201601D202072）

丁 磊（1991-），男，山西隰县人，在读硕士，研究方向：线虫分类及综合治理。王建明为通信作者。