女贞子中主要活性成分红景天苷和特女贞苷的逆转铁过载促进骨形成相互作用研究

何丹丹 赵白秀 汪华君 蒋俊* 沈袁佳怡 何津津

1.南京中医药大学附属中西医结合医院,江苏 南京 210028

2.江苏大学药学院,江苏 镇江 212013

3.江苏大学附属医院,江苏 镇江 212000

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是最普遍的原发性骨质疏松症之一[1],其特征在于雌激素水平和骨密度降低,骨骼微观结构破坏,骨脆性和骨折易感性增加[2]。PMOP的常见和严重危害是多部位发生脆性骨折,尤其是髋部和椎骨骨折[3-4]。在世界范围内,超过50%的绝经后妇女患有PMOP[5],PMOP已经成为危害中老年妇女健康的重大疾病之一[6-7]。除雌激素缺失外,铁过载是PMOP所伴随的不可忽视的危险因素。女性每年约有36 mg铁通过月经排出[8],然而停经后5～10年内,铁蓄积可导致血清铁蛋白水平上升2～3倍[9]。研究表明,血液、组织中游离铁蓄积过多则会诱发骨量降低、破坏骨微结构和骨的生物力学强度[10]。因此,筛选出能下调铁过载、逆转铁代谢紊乱的有效中药是防治PMOP的创新策略。女贞子是木犀科植物女贞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果实[11],在2020年版《绝经后骨质疏松中医临床指南》中被强推荐为抗PMOP有效药物。女贞子中含有苯乙醇类、环烯醚萜类和三萜类等多种类型的活性化合物,且苯乙醇类和环烯醚萜类[12]的含量最高。红景天苷、特女贞苷分别是苯乙醇类和环烯醚萜类的代表性成分,也是药典中女贞子饮片的质控指标[13];特女贞苷、红景天苷的抗PMOP的药理作用已有报道[14-16],但两者间的药效学相互作用研究未见报道。

药效学相互作用形式包括协同作用、相加作用和拮抗作用,主要表现为药理效应改变引起的药效和(或毒性)的改变,表现在同一受体部位或相同生理系统上作用的相加(1+1=2)、协同(1+1>2)或拮抗(1+1<1)[17-18]。为阐述特女贞苷和红景天苷的抗PMOP效应以及两者间的相互作用,本研究采用柠檬酸铁铵建立铁过载诱导的斑马鱼骨质疏松模型,茜素红染色后以骨骼染色面积和累积光密度评价特女贞苷、红景天苷对铁过载诱导的骨形成抑制的逆转作用,并进一步采用等效线法、等辐射分析法探讨特女贞苷与红景天苷间的相互作用,为揭示女贞子中主要活性成分红景天苷和特女贞苷的抗PMOP的相互作用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

去铁胺(DFO,诺华制药有限公司);柠檬酸铁铵(FAC,迈瑞尔生化公司);茜素红(上海泰坦科技股份有限公司);红景天苷标准品(纯度≥98%,南京源植生物科技公司);特女贞苷标准品(纯度≥98%,南京源植生物科技公司);95%甲醛(纯度≥95%,上海泰坦科技股份有限公司);3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS222,纯度≥98%,Adamas-reagent)。

1.2 实验动物与试药

野生型斑马鱼胚胎(AB系),由南京一树梨花生物科技有限公司提供。E3培养液的配制按照之前的研究进行[19-20]。取适量红景天苷与特女贞苷,精密称定,用DMSO/E3溶液配制成浓度为100 μmol/L的储备液,再用梯度稀释法分别配制成不同浓度(1、5、25、50、100 μmol/L)的工作液。取适量FAC,将其溶解于E3溶液,配制成100 mg/L的溶液。

1.3 斑马鱼分组与处理

将受精后第2天(2 dpf)的斑马鱼幼鱼分成14组,置装有3 mL空白培养基的6孔板中(n=15)。具体分组如下:空白对照组(CON,E3培养液),二甲基亚砜组(DMSO),模型组(MX,100 μg/mL柠檬酸铁铵),阳性对照去铁胺组(DFO,100 μmol/L),红景天苷组(1、5、25、50、100 μmol/L),特女贞苷组(1、5、25、50、100 μmol/L),红景天苷与特女贞苷1∶1混合组(1、5、25、50、100 μmol/L)。斑马鱼具体的培养和给药方法见本课题组之前发表的论文[21]。

1.4 茜素红染色

连续给药4 d后,收集所有斑马鱼,每孔用4 mL MS-222 (100 mg/L)溶液麻醉30 min处死。随后用4 mL 10%甲醛PBS溶液固定斑马鱼的形态和组织,去除固定液后用50%乙醇溶液洗10 min,吸干后加入茜素红溶液(0.5% KOH)染色放置过夜。除去并洗净染色溶液,加入新鲜制备的漂白液(1% KOH和1.5% H2O2)漂白1 h,并放置于50%甘油/50% PBS溶液中保存。

1.5 骨矿化分析

按本课题组已成功构建的方法[22],在正置显微镜下(Olympus BX41,日本)观察斑马鱼骨骼的染色情况,对斑马鱼的骨矿化面积(AMB)和累积光密度(COD)进行定量分析。使用Image J软件计算AMB和COD,并用Graphpad Prism 9.0进行统计分析。

1.6 相互作用评价

按照Probit法[23]计算得红景天苷、特女贞苷及两者联合用药后的EC50及95%CI。采用等效线法、等辐射分析法[24]共同评价红景天苷与特女贞苷的药效学相互作用。①等效线法计算方法:等效线法是一种常用的药物相互作用评价方法,它适用于药物与效应呈剂量依赖关系的情况,其通过计算相互作用指数(interaction index,γ)来评价药物协同作用的不同程度。等效线法的计算公式为γ=a/A+b/B,其中a和b代表联合使用时两药的剂量,A和B代表单独使用时达到与联合使用时等效的两药的剂量。当γ=1时,两药呈相加作用;当γ<1时,两药呈协同作用;当γ>1时,两药呈拮抗作用。②等辐射分析法计算方法:横、纵轴标记单独用药EC50值和95%CI,连接两EC50值构成相加线,连接两置信限构成相加线的95%CI。当联合用药EC50处于相加线上或置信限内,表示相加作用;处于置信限下方,表示协同作用;处于置信限上方,表示拮抗作用。

1.7 统计学分析

使用Graphpad Prism 9.0进行统计分析,采用Graphpad Prism 9.0中Tukey检验确定各组之间的差异,实验数据用均数±标准差表示,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红景天苷和特女贞苷对骨矿化的影响

茜素红染色结合图像量化结果表明,与空白组和二甲基亚砜组相比,模型组AMB和COD显著减少(P<0.05)(图1、2),表明柠檬酸铁铵成功地抑制了斑马鱼的骨骼生长与骨矿化进程。与模型组相比,在不同浓度的红景天苷、特女贞苷及其混合溶液的干预下,斑马鱼AMB和COD显著增加(P<0.05),见图1、2。结果表明,红景天苷、特女贞苷及其混合溶液均有较好的逆转铁过载导致的骨形成抑制,且具有浓度依赖性。

图1 茜素红染色斑马鱼头骨腹侧视图(×150)

图2 红景天苷、特女贞苷对斑马鱼骨矿化的影响 (n=15)

2.2 相互作用评价

2.2.1等效线法。红景天苷、特女贞苷及其混合溶液对斑马鱼的骨矿化具有改善作用,红景天苷与特女贞苷混合使用时,呈现出骨骼染色面积的显著提高,且其混合之后的活性优于同浓度的红景天苷和特女贞苷,见表1。

表1 不同浓度红景天苷与特女贞苷及其混合溶液对骨骼染色面积的影响(n=15)

通过Probit法计算可得红景天苷、特女贞苷及联合用药的EC50分别为0.85、0.92、1.02 μmol/L。红景天苷、特女贞苷及其混合溶液的效应变化和量效关系见图3。用等效线法计算公式γ=a/A+b/B,计算得相互作用系数γ=1.16。γ>1,表明红景天苷与特女贞苷1∶1联合用药时,未见明显的协同作用。

图3 红景天苷、特女贞苷及其混合溶液的效应变化与量效关系图

2.2.2等辐射分析法。运用等辐射分析法对红景天苷与特女贞苷的相互作用进行评价,等辐射图相加线的两端分别为红景天苷与特女贞苷有效增加AMB的EC50,红景天苷和特女贞苷合用后的强度所在的点与相加线的两个端点连接形成等辐射线,见图4。混合组中相应成分的EC50比值分数总和为1.16,且其复合点落在95%可信限内(P>0.05)(表2)。等辐射分析法结果表明,红景天苷和特女贞苷联合用药呈现相加作用。

表2 红景天苷与特女贞苷单用及联合使用后对骨骼染色面积增加的EC50及95%CI

图4 红景天苷与特女贞苷组合使用的等辐射图

3 讨论

铁过载与骨代谢之间的关系是近年来的研究热点,铁过载产生大量活性氧会刺激破骨细胞分化,增加骨吸收,导致骨量流失;铁过载诱导的氧化应激可导致骨形成和矿化受损[25-26]。斑马鱼模型在高铁环境下骨矿化不全,早期表达的成骨基因下降,进而影响骨形成。铁过载斑马鱼硬骨发育障碍,骨量减少,下调成骨相关基因的表达,从而造成骨发育迟缓[27]。通过逆转铁过载促进骨形成可以成为治疗PMOP的一个新方案。中药女贞子的药理活性研究主要集中在抗OP、PMOP的作用[28-30],女贞子所含的化学成分也显示出良好的抗骨质疏松活性[29],特女贞苷对破骨细胞的形成具有抑制作用,特女贞苷效应的分子机制包括抑制NF-κB活化和下游因子c-Fos和NFATc1的水平,以及抑制JNK和p38磷酸化。因此,特女贞苷可能有助于治疗破骨细胞相关的骨病[14]。红景天苷可激活PI3K/Akt信号,减轻PMOP大鼠骨组织病理损伤,提高骨矿盐含量,改善骨生物力学[31],抑制氧化应激反应发挥骨细胞保护作用[16]。

本研究阐明女贞子中主要活性成分特女贞苷和红景天苷的药效学相互作用。目前,研究药物间的相互作用方法较多,如等效线法、等辐射分析法和周-特氏联合指数法等[32]。其中,等效线法和等辐射分析法是判断药物间相互作用的常用方法。本研究表明,红景天苷、特女贞苷及其混合溶液对骨矿化呈浓度依赖的改善作用。药效学相互作用评价结果显示红景天苷和特女贞苷呈相加作用关系。本研究为深入评价女贞子中多种活性成分之间相互作用机制奠定了基础,为临床上药物联合治疗PMOP提供广阔的发展空间。