接骨木治疗骨质疏松症的活性成分及作用机制研究

郭盼 郭庆梅* 姚俊修 吴德军

1.山东中医药大学,山东 济南 250355

2.山东省林业科学研究院/山东省林木遗传改良重点实验室,山东 济南 250014

接骨木(SambucuswilliamsiiHance),又名扦扦活、九节风、续骨木、木蒴藋,为忍冬科接骨木属多年生落叶灌木或小乔木。接骨木始载于唐代《新修本草》,药性平和,味甘苦,归肝经,有续筋接骨、祛风利湿、活血止痛的功效,可用于治疗骨折肿痛、跌打损伤、外伤出血等疾病[1]。现代研究表明接骨木的活性成分包括木脂素类、环烯醚萜类、黄酮及黄酮苷类、酚酸类等,有抗骨质疏松、抗病毒、镇痛、促进骨折愈合等药理作用[1-2]。

随着人口老龄化程度的加剧,骨质疏松症逐渐成为世界范围内常见的骨骼疾病之一,传统医学认为骨质疏松症属“骨痿”“骨枯”等范畴,肾虚精亏,加之正虚邪侵及先天不足等因素,以致骨骼失养,骨量减少,骨折风险增加[3];现代医学研究显示其发病机制为成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收失衡。主要表现为骨量减少、骨强度降低、骨微结构破坏、骨脆性增加及骨折风险增加[4]。目前用于治疗骨质疏松症的药物有双膦酸盐骨吸收抑制剂、雌激素和选择性雌激素受体调节剂、降血钙素、组织蛋白酶K抑制剂、分子靶向药物、成骨药物、解偶联剂-雷尼酸锶和中药单体活性成分[5],但患者长期使用雌激素、双膦酸盐等部分西药后,患骨坏死、血栓、乳腺癌等疾病的概率会增加[6-7],因此寻找安全性高、毒副作用小的药物治疗骨质疏松症非常必要。近年来研究发现接骨木茎枝提取物具有较强的抗骨质疏松活性,而且接骨木治疗不会使大鼠的子宫重量增加,与雌激素替代疗法治疗骨质疏松症相比,减少了卵巢癌、乳腺癌等疾病发病的风险[2]。因此,探究接骨木提取物治疗骨质疏松症的活性成分及机制,可能会发现新的安全性更高的药物。本研究总结了国内外关于接骨木治疗骨质疏松症的活性成分和作用机制的最新研究进展,为进一步开发利用接骨木提供参考。

1 接骨木治疗骨质疏松症的活性成分

接骨木治疗骨质疏松症的研究主要集中于木脂素类、酚酸类、三萜类和黄酮类。其中以8-O-4' norlignan为主的8-O-4'类木脂素、以香草酸和阿魏酸为主的酚酸类、以白桦脂酸为主的三萜类、以葛根素为主的黄酮类均具有抗骨质疏松的活性。

1.1 木脂素类

接骨木中的木脂素具有抗骨质疏松、抗真菌、抗癌等药理作用[8-9]。近年来,接骨木中的木脂素类化合物在治疗骨质疏松症方面的研究得到了重视,研究人员发现木脂素可以预防卵巢切除术导致的大鼠骨质疏松,抑制骨密度降低,增加骨强度[8]。目前研究显示木脂素通过促进成骨细胞的增殖分化、抑制破骨细胞的生成和调控OPG/RANKL/RANK信号通路及MAPK非基因组ER途径等发挥抗骨质疏松作用[8,10-11]。

利用大孔树脂对接骨木茎枝60%乙醇提取物进行洗脱,研究不同洗脱物对骨质疏松的影响,结果表明50%和95%乙醇洗脱物抗骨质疏松活性最强,并且这两个洗脱物(因95%乙醇洗脱物的产率很低,以下称为接骨木50%乙醇洗脱物)主要为木脂素类,说明木脂素类有较强的抗骨质疏松作用[11]。在去卵巢(ovariectomized,OVX)致骨质疏松SD大鼠模型中,接骨木50%乙醇洗脱物在剂量为228 mg/kg时显著增加了碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)mRNA、骨钙素(bone glaprotein,BGP)mRNA及runt相关转录因子(runt related transcription factor 2,Runx2)mRNA的表达,同时降低抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)mRNA和组织蛋白酶K(cathepsin K,Ctsk)mRNA的表达,并且能通过增加骨小梁数量、骨连接密度及骨体积/总体积,减少骨小梁分离及降低结构模型指数,减弱OVX大鼠诱导的骨密度降低和骨小梁微结构的破坏;228 mg/kg的接骨木50%乙醇洗脱物也可通过增大屈服应力、屈服位移、极限荷载及模量等骨力学参数,显著抑制OVX大鼠骨强度的降低[8]。在OVX致骨质疏松C57BL/6J小鼠模型中,500 mg/kg和1 000 mg/kg的接骨木茎枝60%乙醇提取物显著降低尿钙含量,并提高血清钙水平,从而促进成骨细胞的矿化,且接骨木茎枝60%乙醇提取物治疗后,OVX小鼠的骨小梁数量增加及骨小梁分离减少[12]。1 000 mg/kg的接骨木茎枝60%乙醇提取物显著增加了核心结合因子α1(core binding factor α1,Cbfa 1)mRNA的表达,且该剂量下的骨密度、骨连接密度和骨小梁厚度增加[12]。8-O-4' norlignan{(7R,8 S)-1-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-2-[4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenoxy]-1,3-propane-diol,PPD}作为接骨木抗骨质疏松作用的活性成分,在一定的浓度范围(10-12～10-8mol/L)显著增加了小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1和大鼠骨肉瘤细胞UMR106的增殖;在10-9mol/L和10-8mol/L时,显著促进了MC3T3-E1细胞和UMR 106细胞的ALP活性;10-8mol/L的PPD增加了ALP mRNA、BGP mRNA的表达及促进骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)的钙沉积;在浓度为10-10mol/L和10-8mol/L时,PPD上调了Runx2 mRNA和骨保护素(osteoprotegerin,OPG) mRNA表达水平,并通过调控MAPK介导的非基因组雌激素受体(estrogen receptor,ER)信号通路发挥治疗骨质疏松作用[10]。

1.2 酚酸类

接骨木中酚酸类化合物也具有治疗骨质疏松症的作用,其可以促进成骨细胞的增殖,调控MAPK及OPG/RANKL/RANK等信号通路发挥保护作用。酚酸类抗骨质疏松活性的代表性成分有香草酸和阿魏酸。

一定浓度范围内(10-12～10-8mol/L)的香草酸(vanilic acid,VA)能刺激UMR106细胞增殖,10-8mol/L的VA上调UMR106细胞中ALP mRNA和OPG mRNA表达水平及增加BMSCs中的钙沉积,10-12mol/L的VA显著增加MC3T3-E1细胞的ALP活性,10-10mol/L和10-8mol/L的VA可增加UMR106细胞中BGP mRNA、Runx2 mRNA的表达和OPG/RANKL比例以及通过调控MAPK介导的非基因组ER信号通路,发挥治疗骨质疏松症的作用[13]。

在OVX致骨质疏松SD大鼠模型中,20 mg/kg 阿魏酸(ferulic acid,FA)能使骨小梁数量和连接增加,极限载荷和弹性模量升高,从而改善股骨生物力学性能[14]。氧化应激是导致骨质疏松的因素之一,FA能修复氧化应激导致的大鼠成骨细胞钙化结节数量减少及OPG等成骨功能相关基因表达水平的降低,从而恢复成骨细胞的增殖分化能力[15]。综上,FA能够在治疗骨质疏松症方面发挥作用,接下来的研究需要进一步证实阿魏酸的体内有效性与安全性,以期为抗骨质疏松药物的研发提供相关依据。

1.3 三萜类

白桦脂酸(betulinic acid,BA)是三萜类发挥抗骨质疏松作用的活性成分,目前研究表明BA主要通过抑制破骨细胞分化起到治疗骨质疏松的作用[16]。在骨髓巨髓细胞中,10 μmol/mL的BA明显下调了TRAP基因的表达,从而抑制核因子-κβ受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)诱导的破骨细胞分化;同浓度的BA也调控破骨细胞分化过程中的MAPK、c-Fos及NFATc1信号通路,抑制ERK、JNK、p38蛋白的磷酸化及c-Fos转录因子和活化T细胞核转录因子c1的表达,从而抑制破骨细胞分化,发挥抗骨质疏松作用[16]。另外,在小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7中,接骨木茎枝60%乙醇提取物在剂量为1、10、100 μg/mL时,能够减少破骨细胞生成的数量,且在10 μg/mL时作用最佳[12]。因此接骨木三萜类可以直接调节破骨细胞的分化,发挥抗骨质疏松作用。

1.4 黄酮类

在链脲佐菌素诱发的昆明小鼠骨质疏松实验中,与模型组相比,200 mg/kg和400 mg/kg的接骨木叶总黄酮提取物显著升高了血清钙和ALP水平,并降低P、TRAP及BGP水平,且总黄酮组的骨小梁增厚、骨密度增加、骨基质增多、成骨细胞数目增多及破骨细胞减少[17]。另外在维甲酸所致小鼠骨质疏松模型中,161 mg/kg和322 mg/kg的接骨木叶总黄酮提取物显著升高了血清钙及ALP水平,并且降低P、BGP及TRAP水平[18],以上结果表明接骨木叶总黄酮提取物对链脲佐菌素和维甲酸诱发的小鼠骨质疏松,均有一定的治疗效果。但研究建立的骨质疏松模型具有局限性,且相关机制研究较匮乏,笔者认为今后有必要通过体内外实验对接骨木叶抗骨质疏松的具体作用通路深入探究,为接骨木叶治疗骨质疏松提供理论依据。

在C57BL/6小鼠骨质疏松实验中,与OVX组相比,葛根素组骨小梁增多,骨髓腔变小,股骨组织结构更致密;葛根素上调了PTEN、Catalase及Foxo1的基因表达,其作用机制可能与PTEN-PI3K-AKT通路有关[19]。Ctsk是蛋白水解酶,能降解I型胶原蛋白,在骨吸收阶段发挥作用[20]。有研究发现,10 nmol/L、100 nmol/L及1 μmol/L的葛根素下调了TRAP mRNA及Ctsk mRNA表达,从而显著抑制破骨细胞的分化[21]。在OVX致骨质疏松Wistar大鼠模型中,35 mg/kg的葛根素显著升高了血清Ca、P水平,并且改善了OVX大鼠的骨组织结构,表现为骨小梁数量增多,骨皮质变厚,髓腔明显缩小等骨组织形态学参数的改变[22]。以上主要活性成分的相关化学结构见图1。

图1 接骨木中具有抗骨质疏松作用的化合物结构

2 接骨木治疗骨质疏松症的机制研究

MAPK有4个亚族:ERK、p38、JNK和ERK5,根据亚族的不同组成了4条不同的MAPK通路,其中ERK MAPK通路是调节成骨细胞分化与骨形成的重要信号传导途径[23]。OPG/RANKL/RANK系统在调控骨代谢上有重要作用,接骨木通过调节OPG/RANKL系统抑制破骨细胞的生成,进而抑制骨吸收[2]。OPG/RANKL/RANK信号通路和ERK MAPK非基因组ER信号通路在骨的形成和吸收上有一定的影响,目前研究已证明这几条信号通路与接骨木治疗骨质疏松有关。

2.1 OPG/RANKL/RANK信号通路

OPG、RANKL和核因子-κB受体活化因子(receptor activator of NF-κB,RANK)均是肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)受体超家族成员,其中OPG和RANK均是RANKL的受体,RANKL和RANK结合会促进破骨细胞分化,而OPG可以阻碍RANKL和RANK相互作用,竞争性结合RANKL抑制破骨细胞的产生[24]。体外UMR106细胞培养实验可知,接骨木茎枝60%乙醇提取物能显著上调UMR106细胞中OPG mRNA的表达以及下调RANKL mRNA的表达[2]。体内研究OVX C57BL/6J小鼠胫骨实验[12]中,1 000 mg/kg接骨木茎枝60%乙醇提取物抑制了雌激素缺乏导致的OPG/RANKL的降低。综上,接骨木在体内外均通过上调OPG/RANKL mRNA表达比值抑制骨吸收,从而发挥抗骨质疏松作用。

2.2 ERK MAPK非基因组ER信号通路

雌激素可以通过经典的ER途径和MAPK非基因组ER途径介导转录作用[25]。接骨木活性成分中的VA和PPD是植物雌激素,可以在成骨细胞中发挥雌激素样作用,肖辉辉等[10,13]对PPD及VA分别进行研究,结果发现二者均上调了ERK磷酸化及ERα的磷酸化位点丝氨酸118的表达,说明接骨木通过激活ERK MAPK非基因组ER信号通路来抑制骨质疏松的发生。接骨木治疗骨质疏松症的作用机制如图2。

图2 接骨木治疗骨质疏松的作用机制

3 接骨木治疗骨质疏松症的可能机制

大多数生理功能是由多个器官共同调节的,如骨骼的代谢与胃肠道等器官的调节密切相关[26-27],因此接骨木保护骨骼健康,可能与全身性代谢途径和某些潜在的代谢物有关。有研究报道了接骨木50%乙醇洗脱物治疗后,OVX大鼠的脂质、氨基酸、色氨酸等代谢产物发生了显著变化,推测这些代谢物可能参与了接骨木的抗骨质疏松作用[8,28]。

3.1 氨基酸代谢途径

支链氨基酸(branched chain amino acids,BCAA),尤其其中的亮氨酸,能增加骨小梁密度,对骨形成发挥正向作用[29-30]。色氨酸分为L和D两种,L-色氨酸能对成骨细胞的分化起作用[31]。在OVX老年大鼠模型中,228 mg/kg的接骨木50%乙醇洗脱物能上调BCAA和色氨酸水平[8],并且代谢组学分析表明,粪便中的酪氨酸和色氨酸代谢以及血液中的BCAA降解和骨质疏松症显著相关[32],因此氨基酸代谢可能有助于接骨木的抗骨质疏松作用。

色氨酸的代谢途径有两条,代谢物分别为犬尿氨酸和血清素,血清素又称5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT),根据合成部位的不同可分为肠源性血清素和脑源性血清素,合成肠源性血清素占全身的95%[33]。血清素不能透过血脑屏障,因此外周5-HT主要是肠源性血清素。肠源性血清素可以通过5-HTR1b/CREB/Cyclins信号级联来抑制成骨细胞增殖,叉头框转录因子1(forkhead box O1,FOXO1)与成骨细胞的CREB和转录激活因子4(activating transcription factor-4,ATF4)有关。与OVX组相比,140 mg/kg接骨木50%乙醇洗脱物显著上调了FOXO1的蛋白表达及下调ATF4的蛋白表达,从而减少了FOXO1与ATF4的相互作用,同时增加了FOXO1与CREB的作用,最终起到促进骨形成的效果[28]。色氨酸羟化酶1(tryptophan hydroxylase-1,TPH-1)是合成外周5-HT的限速合成酶,接骨木50%乙醇洗脱物对TPH-1高表达细胞进行体外处理,发现1 μg/mL的接骨木50%乙醇洗脱物显著降低了TPH-1 mRNA和蛋白的表达,抑制5-HT的合成[8]。Xiao等[28]在此基础之上,进行体内动物实验,发现在OVX致骨质疏松SD大鼠模型中,140 mg/kg接骨木50%乙醇洗脱物能显著抑制结肠中TPH-1蛋白的表达,从而显著降低了OVX大鼠的血清5-HT水平。肠道微生物可以调节肠道粘膜内5-HT的合成,并且其中的瘤胃菌科UGC-014和粪杆菌真核菌群与大鼠骨密度呈负相关,140 mg/kg接骨木50%乙醇洗脱物能显著降低瘤胃菌科UGC-014和粪杆菌真核菌群的丰度,抑制5-HT的合成,使OVX大鼠骨密度增加[28]。接下来可以探究接骨木中的主要木脂素对肠道微生物群和5-HT合成的调节作用,进一步证实木脂素的抗骨质疏松作用。

3.2 脂质代谢途径

骨骼的健康与脂肪的不饱和指数有关,饱和脂肪酸能利用非特异性过氧化作用生成活性氧,活性氧的积累会导致骨髓细胞的脂毒性,从而起到抑制成骨细胞的增殖和分化作用[34]。研究表明228 mg/kg的接骨木50%乙醇洗脱物上调了花生四烯酸、亚油酸和油酸这3种不饱和脂肪酸的水平,意味着228 mg/kg的接骨木50%乙醇洗脱物处理可能加速脂质从饱和脂肪酸向不饱和脂肪酸的代谢,因此脂质代谢可能是接骨木治疗骨质疏松症的重要代谢途径之一[8]。

3.3 抗氧化作用的介导

相比于OVX组,在使用228 mg/kg的接骨木50%乙醇洗脱物处理大鼠后,抗氧化剂血清尿酸水平得到恢复,超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的水平升高,对甲酚硫酸盐诱导活性氧产生的作用及氧化应激标记物丙二醛水平的增加受到抑制,氧化作用减弱,这表明接骨木50%乙醇洗脱物治疗骨质疏松症的作用很可能与抗氧化系统的介导有关[8]。接骨木治疗骨质疏松症的可能机制如图3。

图3 接骨木治疗骨质疏松症的可能机制[8]

4 结语

国内外研究表明接骨木能够治疗骨质疏松和骨折,有较强的骨保护作用,这与古籍记载的接骨木续筋接骨的功效相一致。对接骨木发挥骨保护作用的有效部位研究主要集中在茎枝和根皮,叶和果实仅有少量研究。其中接骨木根皮在治疗骨折方面有良好的活性,接骨木茎枝和叶在治疗骨质疏松症方面有较好的药理效果,此外接骨木果实中的红景天苷和芦丁均有一定的成骨作用,说明接骨木果实具有治疗骨质疏松症的潜力[35]。接骨木茎枝中含有多种治疗骨质疏松症的成分,比如木脂素类、酚酸类、三萜类,其中木脂素类和酚酸类能通过影响成骨细胞和破骨细胞标志物的表达及调控ERK MAPK通路等,多途径调节来减少骨质疏松的发生。木脂素通过上调ALP、OPG和Runx2的mRNA水平及下调Ctsk和TRAP的mRNA水平来刺激成骨细胞的分化、抑制破骨细胞的生成;通过增加OPG/RANKL,调节OPG/RANKL/RANK信号通路抑制破骨细胞生成;通过上调ERK磷酸化及增加ERα的磷酸化位点丝氨酸118的表达,调控ERK MAPK非基因组ER信号通路促进成骨细胞的增殖、分化。另外,在全身性代谢过程中,木脂素类治疗骨质疏松可能与氨基酸代谢、脂质代谢的潜在代谢物有关。

尽管现代研究对接骨木及其活性成分在抗骨质疏松方面的研究已不断深入,但仍存在以下问题:(1)对接骨木叶和果实治疗骨质疏松症的相关研究较少。在后期的实验研究中,可以比较接骨木茎枝和叶治疗骨质疏松症的效果及对接骨木果实进行药效学验证,为接骨木叶和果实的深入研究提供依据;(2)目前对接骨木抗骨质疏松作用的研究大多基于体外细胞实验和体内动物实验,缺乏相关的临床研究,且PPD、VA等接骨木活性成分的作用机制研究仍停留在体外实验,其量-效-毒关系及成药性也尚未系统阐述。后期应加强对接骨木治疗骨质疏松症的临床实验研究,同时对活性成分治疗骨质疏松症的作用进行体内有效性及安全性评价,为接骨木进入临床治疗骨质疏松症奠定基础;(3)接骨木治疗骨质疏松症的信号通路缺少深入系统性研究,且不够全面,中药多途径、多靶点的特点决定了接骨木治疗骨质疏松症的信号通路应有多条,其复杂性与交叉性可能是未来研究的重点与难点。后续对于接骨木治疗骨质疏松症的信号通路应进行全面系统性研究,为中医药治疗骨质疏松症提供强有力的科学证据。