皮蛋加工过程中凝胶及风味形成机制

程 静，李丽婵，陈 旭，蔡茜茜, ，余 劼，余立扬，汪少芸,

（1.福州大学生物科学与工程学院，福建福州 350108；2.福建光阳蛋业股份有限公司，福建福清 350300）

皮蛋具有风味独特，营养丰富，易于吸收的特点。皮蛋在腌制过程中，由于强碱的作用，蛋白质降解成多种小分子活性肽，因此皮蛋具有多种功能活性，如抗炎、抗氧化、抗癌等[1-2]。皮蛋的生产工艺最初是通过将新鲜的禽蛋包裹在泥、植物灰、纯碱、生石灰和PbO 的混合物中4～6 周制备而成，但这种加工工艺复杂且含有对人体有害的铅，限制了皮蛋的发展。随后，皮蛋的生产使用NaOH 来代替纯碱和生石灰；使用浸泡法代替传统的“涂泥法”；使用ZnSO4、CuSO4、Fe2（SO4）3等来代替PbO 以降低其加工的复杂性和不安全性。

凝胶化是蛋白质的特性之一，是指蛋白质变性后，分子链展开，随后通过疏水相互作用、二硫键和氢键等相互聚集和结合形成高度有序的凝胶结构。而皮蛋的加工原理就是利用了蛋白质的凝胶特性，通过利用强碱穿透蛋壳，作用于蛋清和蛋黄诱导其发生物理或化学变化。在物理层面表现为蛋清和蛋黄的凝固和变色。在化学层面表现为皮蛋的蛋白质和脂肪分解成多种肽、氨基酸和挥发性物质，然后通过各种相互作用或反应形成具有凝胶结构和特殊风味的物质。穿过蛋壳进入皮蛋的强碱受到金属离子的调控[3-4]，主要调控方式为：a.蛋白质在高pH 条件下分解产生H2S，H2S 向外迁移至皮蛋壳与渗透到皮蛋壳内部的金属离子反应生成沉淀颗粒从而堵塞蛋壳的气孔，防止碱的过度渗透破坏凝胶。b.通过影响分子间作用力与蛋白质相互作用促进蛋白质凝胶的形成，从而控制碱液的渗透速率[5]。Ksp 是难溶电解质的溶解度，其值越小说明形成的沉淀越稳定[6]。相同温度下，各种金属硫化物的Ksp 值的大小为：KspFe2S3＞KspZnS＞KspPbS＞KspCuS。由于沉淀的Fe2S3颗粒不稳定，因此Fe2（SO4）3的腌制效果较差，其次是ZnS。虽然CuS 和PbS 的Ksp 较小，但铅对人体毒性较大，因此CuSO4常被用来生产皮蛋。

近来学者们综述了皮蛋的营养活性以及常规的加工工艺，对皮蛋的应用与普及具有很大的推动作用。然而，目前还没有对皮蛋加工过程中凝胶和风味形貌形成机制的系统综述。本文针对金属化合物对碱液的调控机制、凝胶、色泽、风味形貌以及松花形成的机制展开了系统全面的综述，旨在为皮蛋的生产加工技术和产品开发提供理论支持。

1 皮蛋凝胶形成机制

皮蛋凝胶主要包括蛋清凝胶和蛋黄凝胶。因为蛋清和蛋黄的成分差别显著，使其凝胶形成机制也有较大差异。综述皮蛋凝胶形成机制，对皮蛋加工工艺改进和功能性皮蛋产品开发具有重要的理论指导意义。

1.1 皮蛋清凝胶的形成机制

鸭蛋清中含有大量的蛋白质，主要包括卵清蛋白、卵转铁蛋白、卵粘蛋白、卵类粘蛋白、溶菌酶等[7-9]，这些蛋白质是凝胶形成的物质基础[10-11]。基于这些蛋白质成胶性的研究中，Hu 等[12]将卵清蛋白琥珀酰化后使其富集电负离子，然后进行碱处理，使蛋白分子膨胀，蛋白质内部的疏水结构暴露，最后通过热诱导使其形成凝胶。Wang 等[13]研究表明，卵转铁蛋白可以与溶菌酶通过静电相互作用形成438 nm的球形微粒；与卵清蛋白在静电相互作用下可以组装形成137 nm 的球形纳米凝胶。Xue 等[6]研究表明，在强碱的诱导下蛋清蛋白发生膨胀，在表面聚集大量的负电荷，蛋白之间的静电斥力增加，从而抑制蛋白质的聚集形成透明凝胶。Eiser 等[14]从材料科学的角度出发，阐明了蛋清在加工过程中的物相变化，推断出皮蛋清凝胶是一种胶体粒子通过长程静电斥力和短程吸引力而聚集形成的高度无定形且结构稳定的精细链状结构，以上研究均证明蛋清蛋白具有凝胶特性。

皮蛋凝胶形成过程中，其凝胶机制如图1A 所示，腌制初期，强碱进入蛋清中导致蛋白质变性和展开，但初级和次级结构尚未受损，由此产生的构象变化暴露了分子内的疏水基团，使蛋清中的游离水逐渐增加，黏稠度逐渐降低。随着腌制的进行，一些蛋白质基团被电离，与周围的其他离子形成离子键。同时蛋白质二级结构受损，氢键断裂，暴露的巯基会生成二硫键。这时大量的游离水通过离子键与电离后的蛋白质再次结合形成结合水，促进皮蛋清凝胶的形成。除碱外，金属离子还可与蛋白质结合影响其二级结构，增加β-折叠，促进蛋白质的交联[15]，且不同金属离子对皮蛋清凝胶具有不同的影响。Shao 等[15]表明，铜离子主要通过影响蛋清蛋白间的疏水相互作用和二硫键来影响凝胶的微观结构和质构特性。铜离子低于0.1%时，在一定程度上有利于凝胶形成均匀、致密网状结构。Deng 等[16]在不同金属离子对皮蛋清凝胶特性的影响研究中发现，凝胶样品中氢键含量较低，表明氢键极少参与蛋清凝胶的形成，二硫键、离子键最多，疏水作用次之。蛋清凝胶中的离子键主要来自蛋白质分子离子基团与水分子之间的离子键；蛋白质之间的静电斥力；以及蛋白分子和金属阳离子之间的静电吸引力。金属离子主要通过以下三种方式显著影响蛋清凝胶中的离子键、二硫键和疏水相互作用：a.与蛋清蛋白中的巯基反应导致巯基含量降低，从而导致二硫键的含量降低；b.屏蔽蛋白质分子之间的静电作用力，导致离子键降低；c.改变蛋白质的二级结构，导致蛋白β-折叠结构增多，疏水相互作用增加。Deng 等[16]还发现高价离子容易增大皮蛋清凝胶的颗粒，促进凝胶聚合物的形成，而低价金属离子有利于改善凝胶特性，增加皮蛋清可溶性蛋白含量，提升凝胶的持水力、硬度和弹性。此外，腌制后的蛋清，水分明显减少，这也有利于皮蛋凝胶的形成。

图1 皮蛋凝胶的形成机制Fig.1 Formation mechanism of preserved egg gel

尽管皮蛋清凝胶形成的机理已经阐明，但仍有许多问题需要解决。首先，虽然皮蛋清凝胶的形成和维持的主要力是离子键和二硫键，但这一过程中蛋白质（或其他物质）之间的结合模式或结合位点还不清楚。第二，金属离子促进蛋白质交联的具体机制是什么。这对皮蛋清凝胶的研究和开发具有重要作用。未来的研究可以更多地运用分子对接和分子动力学模拟来分析小分子蛋白质与小分子化合物（如水、金属离子和碱）之间的相互作用，并探索结合模式和结合位点，从而对皮蛋清凝胶的形成机理进一步研究，为皮蛋制品的加工与开发提供理论指导。

1.2 皮蛋黄凝胶的形成机制

皮蛋黄在腌制一段时间后可分为凝胶状的外蛋黄和溶胶状的内蛋黄，其凝胶机制见图1B。在腌制过程中，内蛋黄的蛋白条带没有显著变化；而外蛋黄的蛋白条带逐渐减弱，出现高分子量和低分子量条带，这表明，外蛋黄蛋白逐渐分解成低分子量肽或氨基酸，并有部分重新聚集形成高分子聚合物[17]。维持内蛋黄溶胶结构的力主要有离子键和氢键，而维持外蛋黄的力主要是离子键、疏水相互作用、二硫键和其他形式的共价键[17]。从微观结构来看，内蛋黄形成了均匀且致密的网络结构，而外蛋黄形成了不规则的凝胶结构但比内蛋黄更致密[18]。内蛋黄和外蛋黄的蛋白质二级结构也发生了改变，内蛋黄和外蛋黄的分子内β-折叠含量随着分子间β-折叠的增加而显著降低，表明蛋白质分子先展开后聚集[17]。内蛋黄和外蛋黄的β-转角增加，而α-螺旋和无规卷曲减少。这可能是因为在参与聚集的蛋白质分子凝胶化过程中，α-螺旋转化为β-转角。虽然内部蛋黄没有形成凝胶，但内部蛋黄中蛋白质和脂质的相互作用形成了稳定和均匀的粘性流体。碱处理后内蛋黄的离子键显著降低，主要由于在弱碱环境下，带负电荷的蛋白质分子表面会形成静电排斥力。而添加的金属阳离子能在一定程度上削弱蛋白质分子之间的排斥力，促进蛋白质聚集。在内部蛋黄中，氢键的数量随腌制时间的增加而增加。一方面由于外蛋黄凝胶形成时一部分水迁移到了内部蛋黄中，同时也阻碍了内蛋黄中的水向外部迁移；另一方面由于内部蛋黄形成凝胶时一部分结合水变成自由水，导致内蛋黄保持较高的水分含量，导致氢键含量增加。由于静电斥力降低促进了二硫键的形成，导致内蛋黄中的二硫键逐渐增加。但二硫键的含量相对较少。因此，离子键和氢键可能是稳定内部蛋黄溶胶系统的主要分子间作用力。

蛋黄是一种天然的脂蛋白组合体。通过简单的离心可以被分成上下两层，上层为蛋黄浆部分，下层为颗粒部分[18]。为了进一步研究皮蛋黄的凝胶机制，Yang 等[18]使用碱分别处理蛋黄、蛋黄浆和颗粒，结果发现三者都能形成凝胶，且颗粒凝胶的硬度大于蛋黄和蛋黄浆凝胶，这表明颗粒凝胶具有更稳定的网络结构。碱处理后，蛋黄、蛋黄浆和蛋黄颗粒的蛋白条带变浅，且在高分子量处出现条带，表明碱处理使蛋白质降解后重新聚合成大的聚合物。维持蛋黄浆凝胶的力主要是离子键和氢键，而维持颗粒凝胶的力主要是离子链、疏水相互作用和二硫键。Xue 等[6]表明蛋黄浆凝胶的分子间相互作用力的组成和变化规律与内部蛋黄基本相同，而蛋黄颗粒凝胶的组成和变化规律与外部蛋黄凝胶基本相同。Yang 等[18]通过电泳实验发现蛋黄浆由大量的低密度脂蛋白（LDL）和少量的卵黄蛋白组成；颗粒由大量的高密度脂蛋白（HDL）、少量的LDL 和卵黄高磷蛋白组成[18-19]。Yang 等[17]也对皮蛋的内蛋黄和外蛋黄的组成进行了分析，结果也发现内蛋黄主要成分为LDL，外蛋黄主要成分为HDL[18]，分别与蛋黄浆和颗粒的成分类似。Yang 等[20]表明HDL 和LDL 在强碱处理下都可以形成凝胶。且HDL 和蛋黄颗粒凝胶均具有较大的硬度。LDL 是一种球形分子，在强碱的作用下，LDL 结构被破坏，甘油三酯、胆固醇酯、胆固醇和蛋白质被释放，然后通过化学键紧密结合，形成非球形LDL 聚集体。LDL 聚集体之间存在静电排斥，因此内部蛋黄经常呈现溶胶状态。HDL 通过离子键、疏水作用力、二硫键和其他共价作用力可以形成均匀且致密的网络结构。最后，在强碱和金属离子的作用下，HDL 和LDL 中的脂质和蛋白质逐渐迁移，最终形成蛋黄凝胶，如图1B 所示。

虽然蛋黄凝胶的形成机制已经有一些研究，但研究仍然存在不足。首先，蛋黄具有复杂的结构，蛋黄干物质中含量最多的是脂质，其次是蛋白质，但目前蛋黄凝胶形成的主要研究对象仍然是蛋白质，缺乏对脂质的研究。除此外，金属离子以及水分迁移规律对蛋黄凝胶的形成也具有重要作用。未来，为了进一步探索蛋黄凝胶的形成机制，应综合考虑各方面因素，尤其是脂质在皮蛋黄凝胶形成中的作用。可以利用同位素标记研究皮蛋黄凝胶形成过程中脂质和蛋白质的变化过程。

2 金属化合物在皮蛋加工过程中的迁移规律及动态调节过程

2.1 金属化合物在皮蛋加工过程中的迁移规律

金属化合物在皮蛋的生产加工中具有重要作用，其在腌制过程中会随着腌渍液逐渐渗透到皮蛋内部，探明金属化合物的迁移规律对优化皮蛋的加工工艺具有重要意义。有研究表明新鲜鸭蛋的蛋壳、蛋清和蛋黄均含有一定量的铜，其可能来自饲料[21]。CuSO4和CuSO4/ZnSO4腌渍的蛋清中的铜含量均呈现先增加后减少，再增加的趋势。蛋清中铜含量下降可能由于不溶性铜硫化物沉积在蛋壳的气孔和蛋壳膜上，减缓了铜从腌渍液向蛋清的渗透，而蛋清中的铜会继续向蛋黄中渗透，因此蛋清中铜含量下降。随着蛋清和蛋黄之间的渗透压逐渐减小，铜从蛋清渗透到蛋黄的速度也会降低，直到达到动态平衡，蛋清和蛋黄中的铜保持稳定。随着外蛋黄的凝固，铜从腌渍液渗透到蛋清的速率大于蛋清向蛋黄渗透的速率，导致蛋清中的铜再次升高。随着腌制的进行，蛋清和外蛋黄中的铜逐渐渗透到内蛋黄中，导致内蛋黄中铜含量逐渐增加。用CuSO4/ZnSO4腌制的皮蛋壳中的铜含量随着腌制天数的增加而升高，且低于用CuSO4腌制皮蛋蛋壳的铜含量。可能由于锌产生的不溶性物质稳定性差，在强碱作用下会重新溶解，从而失去堵孔效果[22]，这些孔再次被形成的更稳定的铜硫化物堵塞，从而导致蛋壳中铜含量在腌制后期快速增加[3]。CuSO4/ZnSO4腌制的皮蛋壳中的锌含量随着腌制天数的增加而增加。蛋壳中的锌含量先迅速增加，随后略有波动，可能由于ZnS 稳定性差，在强碱作用下溶解，锌盐的形成和溶解存在动态平衡。在腌制后期，由于孔隙逐渐填满，溶解的沉淀物减少，导致蛋壳中锌含量再次增加。蛋清中锌含量呈现先升高再降低后不变的趋势。与蛋清中铜含量的降低类似，锌含量的降低可能由于CuSO4/ZnSO4产生的不溶性化合物堵塞蛋壳和蛋壳膜孔阻碍了锌的渗透，而蛋清中的锌仍然以相同的速度向蛋黄渗透，导致锌含量下降。在腌制后期，由于铜和锌形成的不溶物质的堵塞作用、蛋清凝胶以及外部蛋黄的凝固，使蛋清中的锌含量几乎不变。内蛋黄中锌含量逐渐增加。由于铅对人体健康具有严重危害，因此铅在皮蛋中的迁移规律这里不做说明。除铜和锌外，钾、钙、铁等金属化合物也会影响皮蛋清凝胶的形成[16]，但其在皮蛋中的迁移规律目前还没有研究。未来，可以研究钾、钙、铁等金属化合物在皮蛋中的迁移规律，以期开发出无重金属化合物皮蛋加工技术。

综上所述，皮蛋腌制过程中，腌渍液的金属元素会渗透到皮蛋清和皮蛋黄中，因此要合理食用皮蛋。除此外，研究者可以探索具有与铜和锌相似迁移规律的金属离子，在保持皮蛋品质和风味的同时减少重金属离子的使用。

2.2 金属化合物在皮蛋加工过程中对碱液的动态调控

在皮蛋的凝固过程中，碱渗透的速度和量直接决定了皮蛋的质量。如果渗透量过低，则蛋白质变性不足以使皮蛋正常凝固；相反，渗透量过高会进一步作用于形成的皮蛋凝胶，破坏凝胶结构。动态调节碱的渗透，能保护凝胶免受碱的损害。重金属化合物（如CuSO4、ZnSO4、PbO）经常会被加入到腌渍液中去调控碱的渗透。然而，添加金属化合物会在皮蛋中引入大量的这种金属元素，特别是在皮蛋清中。由于PbO 对人类的严重危害，已禁止其在皮蛋生产中使用[23]。目前使用最多的腌制皮蛋的重金属化合物是CuSO4和ZnSO4[24]。金属化合物已被证实在皮蛋加工过程中具有“堵孔”的调节作用，其具体作用机制是金属化合物逐渐与蛋白降解产生的H2S 反应形成金属硫化物沉淀颗粒，形成的沉淀颗粒会黏附在蛋壳上，堵塞皮蛋蛋壳上的微孔或加工过程中的碱腐蚀孔，从而动态调节碱的渗入[5]。虽然已经有很多皮蛋相关的研究，但仍然缺乏对不同的金属元素在腌制过程中对碱液的调控，以及“堵孔”具体过程的系统综述，这对于无重金属皮蛋加工技术的开发具有重要意义。Tan 等[3]研究了腌制液的碱度，结果发现腌制液的碱度先迅速下降再缓慢下降。在开始阶段，大量的NaOH 通过蛋壳的孔隙渗透到皮蛋中，导致腌制液的碱度迅速下降。随着腌渍的进行，由于“堵孔”效应阻止了碱的渗透，导致腌制液的碱度缓慢下降。而长时间浸泡在碱中会对蛋壳和蛋壳膜产生一定的腐蚀作用，形成“腐蚀孔”[25]。“堵塞孔”和“腐蚀孔”共同作用调节碱液的渗透。在“腐蚀孔”形成初期，硫化物沉积速率大于腐蚀速率，腌渍液碱度下降速率减小。随着腌渍时间的增加，沉积速率和腐蚀速率达到动态平衡，腌渍液碱度的下降速率基本不变。随着腌渍时间进一步增加，碱度显著降低，可能是由于连续浸泡导致腐蚀速率高于堵塞速率，导致腐蚀孔数量和孔径增加。由CuSO4制备的腌渍溶液的碱性略高于由CuSO4/ZnSO4制备的，表明Zn 的存在可能使堵塞效率降低。一方面由于锌盐形成的沉淀物容易溶解在碱溶液中，另一方面是由于Zn 和NH3形成了可溶且不稳定的络合离子[Zn（NH3）4]2+。进入皮蛋内部的腌制液，首先会引起皮蛋清pH 的急剧升高，而随着腌制的进行，pH 显著降低，主要由于“堵孔”效应引起的腌制液渗透到蛋清的速率小于蛋清渗透到蛋黄中的速率。随着腌制的进行，碱度变化不明显，可能由于从腌制液进入蛋清的碱液和从蛋清进入蛋黄的碱液达到了动态平衡。随后，金属离子产生的不溶性化合物“堵孔”速率增加，从腌制液进入蛋清的碱液小于从蛋清进入蛋黄的碱液[4]，这时蛋清pH再次降低。随着腌制的进行，蛋清和蛋黄中的碱浓度达到动态平衡，而少量的碱仍能从腌制溶液中渗透到蛋清中，导致蛋清不断脱水，蛋清pH 再次升高。

综上所述，金属离子可以动态调控碱液的渗透，通过“堵孔”和“腐蚀孔”以及渗透压差来调节碱液的渗透。

2.3 腌制过程中皮蛋壳上孔隙堵塞物质的成分分析

人们普遍认为，在腌制液中加入金属化合物的目的是“堵孔”，防止碱液破坏凝胶[4,26]。为了探索皮蛋中孔隙堵塞物质的具体成分，并阐明金属化合物的作用机制，Tan 等[3]通过人工合成模拟了皮蛋腌制过程中蛋壳表面斑点的形成（图2A）。简而言之，把鸭蛋一端开孔，倒出蛋清和蛋黄并加入CH3CSNH2、NaOH 和甘油混合溶液，90 ℃水浴1 min，然后将其放入含金属化合物的腌制液中。该实验利用反应方程 式：CH3CSNH2+3OH-⇌CH3COO-+NH3+H2O+S2-来模拟皮蛋中含硫氨基酸降解产生的H2S。结果发现，皮蛋壳内未添加CH3CSNH2的蛋壳表面没有明显斑点，而含有CH3CSNH2的蛋壳表面均出现明显的黑点，并逐渐增加。这表明黑点的形成和S2-相关。使用SEM 观察到新鲜蛋壳表面有许多分布不均匀的气孔（图2A），这些孔是腌制液渗透的通道，也是鸭蛋内外物质运输和交换的通道[27]。蛋壳的横截面图显示，新鲜鸭蛋壳侧面有明显开放的气孔通道（如箭头所示）。而CuSO4和CuSO4/ZnSO4腌制的皮蛋蛋壳和模拟皮蛋蛋壳的气孔中或多或少可见沉积物（图2A）。为了确定蛋壳上黑点的主要成分，Tan 等[3]使用XPS 分析了黑点中的元素组成。结果发现新鲜蛋壳主要含有C、N、O 和Ca。CuSO4腌制的皮蛋蛋壳以及模拟皮蛋蛋壳斑点中主要元素为C、N、O、Ca、Cu、S 等以及少量的P 和Zn。蛋壳非黑点的Cu 和S 含量低于黑斑区，表明蛋壳上的黑点与Cu 和S 有关。由于CuSO4/ZnSO4腌制液中含有CuSO4和ZnSO4，在CuSO4/ZnSO4腌制的皮蛋蛋壳和模型皮蛋蛋壳上的黑点中不仅发现了与CuSO4腌制的含有类似的元素外，还发现含有的Zn 主要以Zn2+的形式存在，S 主要以S2-形式存在。综上所述，与之前的假设类似，蛋壳上形成的黑点主要是金属硫化物。

图2 金属化合物对皮蛋加工过程中的动态调控[3]Fig.2 Dynamic regulation of metal compounds in Pidan processing[3]

2.4 金属化合物对蛋清凝胶的动态调控

金属离子对皮蛋凝胶的形成具有重要作用，Deng 等[16]研究了不同金属离子与皮蛋清蛋白凝胶的结合，如图2B 所示。结果发现，低浓度的Ca2+、Zn2+、Fe3+可以促进蛋清凝胶形成有序的微观结构，并能提高皮蛋清的凝胶强度，但在高浓度下，它们起到了相反的作用。用K+腌制的皮蛋（与Ca2+、Zn2+、Fe3+相比）具有更高的凝胶强度和保水能力，和更致密的微观结构。此外，低浓度的Cu2+可以通过改变蛋白质的二级结构来促进蛋白质分子之间的交联，而高浓度的Cu2+会通过消耗巯基来抑制蛋白质凝胶的形成[15]。在腌制的初始阶段，低浓度的Cu2+会促进强碱的渗透，从而加速皮蛋的形成。基于上述研究，可以推测，低浓度的金属离子可以通过促进蛋白质聚合物的形成来促进皮蛋的形成，这对于皮蛋的成熟至关重要。

3 腌制过程中皮蛋颜色的形成机制

成熟的皮蛋清是黄褐色或棕色凝胶，而皮蛋黄是黑绿色或黄色凝胶，在蛋白质凝胶化过程中，蛋清和蛋黄开始变色。皮蛋的颜色形成极其复杂，受许多因素的影响，如温度、pH 和时间[8]。

3.1 皮蛋清颜色的形成机制

关于皮蛋清颜色的形成机制研究，Zhao 等[4]使用全自动白度仪检测了皮蛋清的颜色，分别使用L*表示亮度、a*表示红色/绿色和b*表示黄色/蓝色。结果发现腌制初期，蛋白质在碱的作用下变性并降解为小分子量蛋白质、肽和氨基酸导致L*显著降低，随后蛋清蛋白发生交联聚合形成棕色半透明的凝胶。蛋清颜色的a*值和b*值先增加，后略有下降，颜色逐渐从白色变为棕色。其颜色的形成机制见图3A。由于蛋白质被碱分解，产生H2S 和NH3，与腌制液中的金属化合物和一些具有较大氧化还原活性的蛋白质复合物反应，可以形成各种色素物质，导致皮蛋清凝胶显示为暗棕色[4]。分别使用三种不同金属离子进行腌制皮蛋时发现，CuSO4腌制的皮蛋清的L*值显著高于用CuSO4/ZnSO4和PbO 腌制的皮蛋。单独使用CuSO4腌制的皮蛋清的a*和b*值显著高于其他两组。这表明金属化合物与蛋白质、肽或氨基酸的复合反应可能形成不同的金属离子复合物，从而导致皮蛋清颜色出现差异。除此外，皮蛋清中的还原糖与氨基酸、肽或蛋白质的游离氨基相互作用，通过糖基化或糖化可将糖共价连接到氨基酸或者蛋白质的氨基形成糖化蛋白，经美拉德反应获得多种中间产物，最终形成棕色物质，皮蛋的老化过程有利于棕色的形成[27-28]。Tan 等[7]在研究中也表明皮蛋清L*值的降低和颜色的形成是由于美拉德反应。Ganesan等[28]将储存老化过程中的皮蛋放置在不同浓度的葡萄糖溶液中，结果发现与未浸泡葡萄糖的皮蛋比，浸泡葡萄糖的皮蛋游离氨基酸含量降低，还原糖含量增加，主要由于葡萄糖的渗透以及在碱性环境下游离氨基与还原糖发生了美拉德反应，最后导致蛋清褐变增加[28]。在贮藏期间用葡萄糖处理的皮蛋清中，b*和a*值较高，这很可能是由于黄色或棕色色素的形成。a*值的增加可能是由于棕色色素的形成，这可能来自蛋清的美拉德反应[28]，这与皮蛋清的褐变增加一致。因此，葡萄糖在蛋清颜色的形成过程具有至关重要的作用。Wang 等[9]使用UPLC-EIS-MS/MS 检测到皮蛋蛋清中53 个糖基化蛋白上的142 个位点，而在鸭蛋清中只检测到2 个糖基化蛋白上的9 个位点，并表明皮蛋在碱性条件下更容易发生糖基化。红茶色素以及在高pH 条件下红茶中黄酮醇易发生氧化褐变这也有助于皮蛋清颜色的形成[29-30]。除此外，水分含量的降低也会使褐色加深，有利于皮蛋清颜色的形成[31-32]。

图3 皮蛋颜色形成机制Fig.3 Formation mechanism of Pidan color

3.2 皮蛋黄颜色的形成机制

皮蛋黄成分比较复杂，目前对皮蛋黄颜色形成的机理研究较少。Wang 等[33]表明皮蛋黄深绿色是由于硫化铁的形成，卵黄高磷蛋白中的Fe3+被蛋白降解产生的S2-还原成Fe2+，同时S2-与Fe2+结合形成FeS，这使皮蛋黄呈现深绿色。当皮蛋切成两半时，出现四个不同的颜色层，既有深色也有浅色。从外部到内部，第一层是深色，第二层是浅色，第三层是最暗的，第四层是最浅的。深色和浅色是由于不同层中的铁含量不同，铁含量越高，颜色越深。梁庆祥等[34]认为蛋黄在碱性环境下降解产生的两种富含二硫醚（-S-S）和巯基（-SH）的氨基酸（胱氨酸和半胱氨酸）与蛋黄中的金属离子结合会产生特殊的颜色，如黑色的硫化铁。除此外，在强碱和H2S 存在的存在下，蛋黄色素的混合物会变成绿色。李树青等[35]认为碱不稳定的蛋黄蛋白质会在碱性条件下降解产生胱氨酸，与游离的胱氨酸一起分解产生S2-和NH3。S2-与蛋黄内氧化还原性大的铁-卵黄高磷蛋白络合体反应，使Fe3+还原为Fe2+。过多的S2-与Fe2+结合，生成FeS，使蛋黄呈绿色复合物。此外，蛋黄本身也含有颜色，这些绿色复合物与蛋黄的颜色一起赋予了蛋黄独特的颜色[6]。

基于先前的研究，图3 中显示了皮蛋清和皮蛋黄颜色的形成机制。无论是皮蛋清还是皮蛋黄，蛋白质在其颜色形成中都具有重要作用。然而，由于蛋白质的复杂性，在皮蛋颜色形成过程中仍有许多问题需要研究。与蛋清相比，蛋黄的组成更加复杂，很难确定哪些物质起主要作用。同时，颜色形成过程中的美拉德反应过程较为复杂且难以控制。因此目前对皮蛋颜色的形成机制研究较少，尤其是对皮蛋黄颜色形成机制的研究。未来，可以构造腌制模型，研究纯蛋白与还原糖或金属离子在强碱作用下的反应，以及红茶成分对皮蛋清和皮蛋黄颜色形成的影响，以此来探索皮蛋颜色的形成机制。

4 皮蛋风味的形成机制

风味是食品的主要属性，也是食品的重要研究领域，对食品风味的研究可开发出更好的产品以满足人们的需求。食品中的风味物质主要由非挥发性物质和挥发性物质构成[36]。目前对皮蛋的风味研究中，主要是对挥发性物质的研究[37]。赵燕等[38]采用GCMS 鉴定出皮蛋清中含有26 种风味物质，新鲜鸭蛋蛋清中含有27 种风味物质，共同含有的风味物质为17 种。与新鲜鸭蛋清相比，皮蛋清含有较多的酯类，且大多是短链脂肪酸酯，它们都具有独特的水果风味。在皮蛋清中含有三种醛类物质，短链醛具有脂香和清香，高分子量的醛具有橘子皮的清香味。在皮蛋清中还含有少量酮，其是杂环化合物形成的中间体，在杂环化合物的形成中具有重要作用，其通过影响杂环化合物的形成影响皮蛋的风味。除此外，皮蛋清中还含有少量的醇类、含硫化合物以及胺类化合物，均具有特殊的风味，对皮蛋清气味的形成具有重要作用。使用类似的方法，邓文辉等[39]鉴定出皮蛋黄中含有74 种挥发性物质，而新鲜禽蛋黄中含有71 种，共有物质26 种，两种蛋黄中脂肪含量均最高。脂肪氧化能促进皮蛋风味形成。皮蛋黄中还含有许多具有特殊风味的酯类、短链脂肪酸、不饱和长链脂肪酸、苯甲醛、苯乙醛以及一些高分子量的醛类等。除此外，皮蛋黄中还含有一些酮类有助于风味物质形成以及含有具有独特清香气味的醇类、含硫化物和含氮化合物。皮蛋腌制前后风味发生了巨大的变化，而腌制后的皮蛋清和皮蛋黄的风味也各不相同。这可能由于皮蛋黄中含有较多的脂质，其是食品中风味物质形成的重要前体[19]，因此皮蛋黄中的挥发性风味物质比皮蛋清中更多。Zhang 等[36]通过顶空固相微萃取法、溶剂辅助风味蒸发法等方法，鉴定出皮蛋黄中含有53 种气味活性化合物，结合芳香提取物稀释分析法，进一步确定了皮蛋蛋黄中对整体香气起主要作用的物质是1-辛烯-3-酮、己醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、（E）-2-壬醛、（E,E）-2,4-癸二烯醛和（E,Z）-2,6-壬二烯醛[39]。总之，皮蛋中的风味物质主要来源于脂质氧化和蛋白质降解的杂环化合物（含氮、氧和硫）和挥发性物质（含羰基）。

目前皮蛋风味形成机制主要可以理解为，禽蛋中大量的蛋白质、脂肪和少量的糖类[6,40]，在强碱作用下分别降解或氧化形成短肽、氨基酸、还原糖以及一系列烃类、醇类、醛类、酯类等，如图4 所示。Gao等[41]使用纳米-HPLC-MS/MS 鉴定出皮蛋黄中含有5 种鲜味肽。氨基酸和脂肪酸不仅可以作为挥发性风味物质和挥发性风味物质的前体物质影响风味物质的形成，而且氨基酸和脂肪酸之间以及它们反应所形成的中间产物之间也可以发生一系列反应生成挥发性风味物质从而影响皮蛋风味的形成。关于氨基酸除了本身具有独特的风味（酸、甜、苦、咸、鲜），彼此间可以相互协同共同促进食品风味的形成，还可以作为风味前体物质，通过脱氨、转氨、脱羧、与还原糖发生美拉德反应，与油脂发生交互作用以及发生Strecker 降解产生一系列风味物质[42]。与氨基酸相比，游离氨基酸更容易发生Strecker 降解或与其他物质发生美拉德反应生成挥发性物质。氨基酸可以和还原糖发生美拉德反应形成醛、酮、内酯、呋喃、噻吩等挥发性物质。一些支链氨基酸会在反应中产生具有奶酪香味的α-酮酸，进一步会降解为具有特殊风味的醇、醛和羧酸类物质。一些芳香族氨基酸转化的风味物质一般具有花香味、苦杏仁味以及一些化学物味、腐臭味等风味。

图4 皮蛋风味形成机制Fig.4 Formation mechanism of Pidan flavor

与氨基酸作用类似，脂肪酸也可以直接作为呈味物质和挥发性风味物质的前体物影响皮蛋风味的形成。皮蛋腌制过程中脂肪会被水解产生游离脂肪酸，由于其不稳定更容易被氧化或被酶/微生物利用产生大量挥发性化合物如醇、醛、酮、羧酸等。尤其是具有不饱键的游离脂肪酸更容易被氧化，这些不饱和的游离脂肪酸是形成风味物质的主要前体物质，如亚油酸、花生四烯酸等。其在发生氧化时会产生许多具有特殊风味的不含支链的醛，而且很不稳定，容易被酶或微生物代谢生成的酶类氧化或还原产生挥发性风味物质的另外两个重要成分——酸或醇。脂肪酸在氧化过程中除了可以生成风味物质外，其氧化产物还可以与美拉德反应中的中间体反应产生含有取代基的杂环化合物，如吡嗪、噻吩等具有独特的风味的物质。氨基酸和脂肪酸除了可以单独影响皮蛋风味外，还可以通过美拉德反应相互作用影响皮蛋的风味。主要是氨基酸上的氨基与脂肪酸转化得到的羰基化合物上的羰基发生反应。美拉德反应过程较为复杂，形成的产物中大部分具有独特的风味，还有一些可以进一步反应生成具有独特风味的物质。如乙二醛、丙酮醛和甘油醛等，容易自身发生缩合反应，或与其它化合物反应。美拉德反应终产物中主要是含氧、氮和硫的杂环化合物，如呋喃、吡咯、吡嗪等。这些风味物质的风味特征与参加美拉德反应的氨基酸、脂肪酸和还原糖的种类密切相关。

目前对于皮蛋风味的形成机制研究还相对较少，皮蛋中特有的挥发性成分和非挥发性物质仍不清楚，关键反应机制尚未完全分析。这限制了对皮蛋风味的调控和研发。今后，研究者可以通过控制风味前体来模拟风味成分的反应，并将结果与原始的皮蛋风味成分进行比较，最终选择具有特征风味的成分，为皮蛋风味控制提供理论依据。

5 皮蛋松花的形成机制

皮蛋成熟后会形成具有松枝状的松花，这有利于皮蛋感官品质的提高。松花大多分布在皮蛋清凝胶的浅表层，少数分布在蛋清凝胶和蛋黄凝胶之间。马力等[43]发现松花的红外光谱与MgOH 完全一致，因此认为MgOH 是构成松花晶体的主要成分。随后，Tung 等[44]采用SEM 结合能量散射光谱分析仪发现松花由钾、镁、钠等的磷酸盐组成。松花晶体中镁离子占40.3%，还含有少量的磷酸钾、磷酸镁和磷酸钠[6]。皮蛋中的镁离子会促进松花的形成，其含量与松花的形成呈正相关。据报道，蛋壳主要由碳酸钙、碳酸镁、磷酸钙和磷酸镁组成，在腌制过程中，皮蛋黄和蛋壳中的镁离子会逐渐转移到皮蛋清中，导致皮蛋清中的镁含量显著增加。在强碱作用下皮蛋清中大量的镁离子会在皮蛋清表面形成氢氧化镁水合物，氢氧化镁水合物与少量其他物质形成美丽的松花图案，如图5 所示。目前，松花是人工直接采集的，这会破坏松花的结构和性能，而影响实验结果。因此，今后的研究中，可以通过改变采集松花的方法来保持松花的完整性，以便于收集松花。此外，对于提高皮蛋的感官质量，可以通过在腌制液中加入适量的镁离子来调节松花的形成。

图5 皮蛋松花的形成机制Fig.5 Formation mechanism of Pidan Songhua

6 结论

为了推进皮蛋的发展，人们对其进行了大量的研究，主要包括皮蛋生产工艺的优化改进，皮蛋凝胶的形成机理，以及皮蛋或皮蛋提取物的功能活性。然而，尽管皮蛋已被广泛研究，但目前关于加工过程中皮蛋的具体形成机制及腌制液对皮蛋形成的影响的机制研究仍然极其薄弱，仍需进一步研究。在皮蛋凝胶形成机制中，对于皮蛋清凝胶，可以通过简化腌制系统来研究单个蛋白质，并且可以使用分子对接技术来研究蛋白质与蛋白质、水、金属离子或碱性溶液之间的相互作用。在皮蛋黄凝胶的研究中，应考虑脂质在皮蛋黄凝胶形成中的作用。可以通过激光共聚焦技术研究皮蛋黄凝胶形成过程中蛋白质和脂质的迁移以及凝胶形成机制。在皮蛋颜色形成的研究中，可以简化皮蛋的成分，通过控制其他成分，改变其中一个成分来研究其在皮蛋颜色形成中的作用。可以借助分子对接和分子动力学模拟蛋白质与还原糖或金属离子的反应过程。在皮蛋风味的研究中，可以通过添加或减少蛋白质、脂质和多糖的前体物质来模拟关键风味成分的反应，最终识别出特征挥发性和非挥发性物质，为皮蛋风味的控制提供理论依据。在皮蛋松花的研究中，可以从液化皮蛋中收集完整的松花，来研究其具体成分。