脱支和重结晶法制备抗性糊精的结构和功能特性分析

徐美琪，李思漫，刘 欣，欧月灵，罗舒雯，李 琳，陈 旭,*，朱 杰,*

（1.东莞理工学院生命健康与技术学院，中国轻工业健康食品开发与营养调控重点实验室，东莞市特色食品精准设计重点实验室，食品营养健康工程与智能化加工研究中心，广东东莞 523808；2.华南农业大学，食品学院，广东广州 510642）

膳食纤维是人体第七类营养素，具有控制体重，稳定胆固醇水平，改善消化系统功能和维持心血管健康等诸多功能[1-3]。近年来，通过强化食品加工过程中的膳食纤维含量，成为饮食干预常见慢性疾病的有效途径[4]。抗性糊精是短链葡萄糖聚合物，作为低分子量水溶性膳食纤维，具有缓解血糖骤升[5]，降低血脂[6-7]，调节肠道菌群[8-9]，降低体重[10-11]，增强微量元素的吸收[12-13]等诸多生理功效而备受关注。抗性糊精还被广泛应用于饮料、糖果、巧克力、乳制品、焙烤食品、营养能量棒和肉制品等产品中[14]。

目前，最早和最常用的抗性糊精的制备方法是酸热法，主要是通过在高温下用盐酸或其他酸浸泡淀粉，再经过液化、酶水解、脱色、过滤、浓缩、喷雾干燥等系列操作，最终得到抗性糊精产品[15]。研究表明，较高的酸浓度和较长的加热时间有利于增加抗性糊精中膳食纤维含量，而有机酸的浓度对抗性糊精的化学结构也有很大影响[16]。然而，酸热法制备的抗性糊精存在纯度低、产品颜色深、耗时耗力、环境污染等问题。近年来，有学者关注复合酶法制备抗性糊精的绿色工艺。Zhan 等[17]采用分支酶和灰曲霉α-葡萄糖苷酶等酶作用于焦糊精，得到抗性含量为70.6%的抗性糊精。脱支和重结晶法复合酶解工艺主要是糊化后的淀粉在脱支酶的作用下使支链淀粉中的α-1,6 糖苷键断裂，形成长短不一的直链分子链产物[18]；然后在50 ℃或低温环境下高直链含量支链淀粉发生分子重排形成新的结晶体，得到抗性糊精。该方法对环境友好，产品色泽好，节省化学试剂，具有良好的工业应用前景。因此，本研究以蜡质玉米淀粉和普通玉米淀粉为原料，采用绿色环保的脱支和重结晶复合酶水解工艺制备抗性糊精，探究其结构特性和功能特性并构建关联，为抗性糊精的产业化生产和应用提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

普通玉米淀粉、蜡质玉米淀粉 东莞市东岳葡萄糖厂有限公司；普鲁兰酶（2 U/mg）、淀粉葡萄糖苷酶（0.3 U/mg）上海麦克林生化科技有限公司；猪胰酶（8 U/mg）、猪胰α-淀粉酶（8 U/mg）上海源叶生物科技有限公司；苯甲酸、醋酸、无水乙醇、氯化钙分析纯，天津市大茂化学试剂厂；葡萄糖氧化酶/过氧化物酶葡萄糖检测试剂盒（Glucose oxidase/peroxideenzymatic glucose assay kit，GOPOD）爱尔兰Megazyme 公司。

DSC-8000 型差示扫描量热仪 美国Perkin-Elmer 公司；D8-ADVANCE 型X 射线衍射仪 德国BRUKER-AXS 有限公司；TG20-WSI（I 类B 型）离心机 湘麓离心机仪器有限公司；TDL-60B 离心机 上海安亭科学仪器厂；DZF-6096 真空干燥箱上海一恒科学仪器有限公司；Nicolet iN10 显微红外光谱仪 美国Thermo Scientific；CM-5 分光测色计日本KONICA MINOLTA；SCIENTZ-18N 冷冻干燥机 宁波新芝生物科技有限公司；MR Hei-Tec 磁力加热搅拌器 德国 Heigolph 公司；752N 紫外分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；MA35 水分测定仪 赛多利斯仪器系统有限公司；BRUKER AVANCE 400 核磁共振波谱 德国布鲁克公司。

1.2 实验方法

1.2.1 抗性糊精的制备 参考Lee 等[19]方法略作修改，分别称取50 g 蜡质玉米淀粉（Waxy corn starch，WCS）和50 g 普通玉米淀粉（Normal corn starch，NCS），分别加入醋酸钠缓冲溶液（0.01 mol/L、pH4.5）至浓度为0.2 g/mL，在沸水下加热搅拌糊化30 min。待淀粉溶液冷却至50 ℃后，加入普鲁兰酶（5%，w/w，基于淀粉干基质量），在50 ℃水浴锅中连续磁力搅拌7 d，使其完全脱支和重结晶，得到粗抗性糊精样品。随后，将粗抗性糊精样品沸水浴蒸煮10 min，然后冷却到60 ℃，使用氢氧化钠溶液（0.1 mol/L）调节溶液pH6.9，加入猪胰α-淀粉酶（5%，w/w，基于粗抗性糊精含量），在37 ℃下磁力搅拌12 h。经酶水解后的抗性糊精离心三次（10000×g，15 min），沉淀物进行冷冻干燥，粉碎，过100 目筛密封保存备用。原淀粉对照样品分别标记为WCS 和NCS，抗性糊精样品分别标记为WRD 和NRD。

1.2.2 形貌特征观察 采用扫描电子显微镜对抗性糊精和原淀粉样品进行显微形貌观察。将抗性糊精和原淀粉样品均匀分散在贴有导电胶的样品台上，利用离溅射镀膜仪喷金，分别放大1000 倍和2000 倍观察样品的形貌特征。

1.2.3 热力学特性测定 利用差式扫描量热仪（DSC）测定抗性糊精和原淀粉样品的热力学特性。称取3 mg 的干基样品，以3:7 的比例加入蒸馏水溶解样品并密封在铝DSC 锅中，然后在常温条件下放置过夜。在10 ℃/min 的加热速率下，从25 ℃到120 ℃扫描样品，每个样品做三次平行，并使用空铝DSC 盘作为参考。

1.2.4 结晶特性测定 将抗性糊精和原淀粉样品在鼓风干燥箱内烘干至恒重，采用X-射线衍射仪对其结晶结构进行测定。衍射条件为：电压30 kV，电流30 mA，铜靶，扫描区域2θ为5°～35°，辐射线为Cu Ka，扫描速度2°/min，步长间隔为0.02°[20]。采用MDI Jade 6 软件对结晶区域和总面积区间分别进行积分计算，相对结晶度（Relative crystallinity，RC）按照公式（1）所示计算：

式中：Ac—结晶区部分面积；Aa—非晶区部分面积；Ac+Aa—总面积区间。

1.2.5 显微红外光谱分析 利用显微红外光谱仪对样品的官能团进行测定。取少量的抗性糊精和原淀粉样品置于显微玻片中铺平后，放到红外显微镜下，在3500～750 cm-1范围进行红外光谱扫描，调至最佳光圈，寻找合适的样品特征，选取光谱图。

1.2.6 溶解度测定 称量0.5 g 抗性糊精和原淀粉样品置于离心管中，加入25 mL 去离子水配成质量分数2%的样品悬浮液，在室温（25 ℃）条件下磁力搅拌30 min 防止样品沉淀，在3000×g 下离心15 min，取上清液置于培养皿中，在105 ℃真空干燥箱中烘至恒重并称重。按照公式（2）计算溶解度：

式中：A 为上清液蒸干后质量（g）；W 为样品质量（g）。

1.2.7 白度 利用分光测色计测定抗性糊精和原淀粉样品的白度特征值。每个样品至少重复测定3 次。按照公式（3）计算样品白度：

式中：L为亮度；a为有色物质的红绿偏向；b为有色物质的黄蓝偏向。

1.2.8 核磁共振氢谱分析 分别将50 mg 的抗性糊精样品及其原淀粉50 mg 溶于0.55 mL D2O 中，以此方法进行三次冷冻干燥处理使其与重水充分交换，复溶于D2O 中，记录在25 ℃、400 MHz 工作时的1H-NMR 谱。该核磁共振波谱仪配备了一个5 mm低温探头和一个碳增强三共振反向探测器与一个脉冲场梯度探头，128 次扫描，扫描宽度为16（10-6），采样4 s，延迟时间为1 s，获得1H-NMR 谱图，采用MestReNove 进行数据处理和绘图。

1.2.9 体外消化性测定 参考Chen 等[21]方法，分别称取600 mg 的抗性糊精及其原淀粉样品于离心管中，加入20 mL 乙酸钠缓冲液（pH5.2，0.1 mol/L），充分涡旋，沸水浴30 min，在水浴过程中要不断地振荡混匀使样品完全糊化。经冷却置于37 ℃水浴锅中磁力搅拌30 min。在离心管中加入5 mL 由猪胰酶（3×103U）和淀粉葡萄糖苷酶（40 U）组成的混合酶解液，振荡混匀，间隔20 min 和120 min 分别取出0.25 mL 酶解液，置于10 mL 66%的乙醇中灭酶，涡旋混匀。酶解液在3500×g 条件下离心10 min，采用GOPOD 法测定葡萄糖含量。

通过公式（4）计算相应的样品中葡萄糖含量：

式中：At=测试溶液的吸光值；Vt=测试溶液的总体积（mL）；C=标准葡萄糖的浓度（mg/mL）；As=标准葡萄糖的吸光值；Wt=样品的重量（mg）；D=稀释倍数40。

快速消化淀粉（Rapidly digestible starch，RDS）、慢消化淀粉（Slowly digestible starch，SDS）以及抗性淀粉（Resistant starch，RS）含量按照公式（5）～（7）计算：

式中：G20=淀粉水解20 min 酶解液的葡萄糖含量（mg）；FG=初始葡萄糖含量（mg）；G120=淀粉水解120 min 酶解液的葡萄糖含量（mg）；TS=样品总淀粉含量（mg）。

1.3 数据处理

各组实验均至少重复测定3 次，使用Excel 2019 进行RDS、SDS、RS、溶解度和白度等数据计算和分析，利用SPSS 25 软件进行标准偏差计算和单因素方差分析，使用Origin 2021 进行绘图。

2 结果与分析

2.1 两种抗性糊精的微观结构分析

抗性糊精和原淀粉样品的扫描电子显微镜图如图1 所示。NCS 和WCS 颗粒表面光滑，呈均匀圆球或多面体的典型A 型淀粉结构特征[22]。抗性糊精样品由于在制备过程中颗粒结构遭到破坏，表面形态较为粗糙，主要归因于淀粉颗粒糊化后，淀粉中的大部分氢键断裂，双螺旋打开，支链和直链溶出，然后在脱支酶的作用下，使支链淀粉中的α-1,6 糖苷键断裂，形成长短不一的直链分子链产物，通过分子重排结晶而形成不规则形状的小碎片聚集体。与NRD相比，WRD 表面更为粗糙，碎片化程度更高，可能是WCS 支链淀粉含量高（95%以上），在脱支和重结晶过程中脱支更完全，造成其含有的支链淀粉含量显著下降[23]。

图1 抗性糊精及其原淀粉的扫描电子显微镜图Fig.1 Scanning electron microscope diagram of resistant dextrins and their native starch

2.2 两种抗性糊精的热力学特性分析

抗性糊精及其原淀粉样品的热力学特征值如表1 所示。与天然淀粉相比，抗性糊精的糊化温度（起始温度To，峰值温度Tp和终止温度Tc）显著升高（P＜0.05），表现出良好的热稳定性，主要归因于酶解脱支释放出的线形短直链淀粉分子经过重结晶形成了热稳定性更强的结构[22]。WCS 和NCS 的焓值（ΔH）分别为：17.13±0.63 和21.41±0.89 J/g，而WRD和NRD 的ΔH 分别为9.79±1.15 和2.28±0.18 J/g。与原淀粉相比，抗性糊精的ΔH 显著降低（P＜0.05），说明原淀粉在脱支和重结晶过程中，其支链淀粉中的双螺旋结构经酶解脱支作用，结晶结构遭到了破坏。WRD 的焓值下降幅度低于NRD，这说明WRD 容易脱支形成较多的线性直链分子，有利于在结晶过程中淀粉分子的重排形成更加致密的聚集体，这可能是WRD 形貌更粗糙、碎片化程度更高的原因（图1）。

2.3 两种抗性糊精的结晶特性分析

抗性糊精及其原淀粉的X-衍射图谱及结晶度如图2 所示。NCS 和WCS 的结晶图谱在15°、17°、18°和23°有强衍射峰，且在17°和18°附近呈现双衍射峰，为典型的A 型晶体结构[24]。与原淀粉相比，不同种类玉米淀粉制备的抗性糊精的结晶型和结晶度呈现出不同的变化趋势。与WCS 相比，WRD 的晶型未发生明显变化，结晶度呈现增加趋势，表明经普鲁兰酶酶解脱支后支链淀粉的线性链容易形成双螺旋[25]。与NCS 相比，NRD 的结晶图谱在15°和18°的衍射峰强度下降，由23°的强衍射峰转变为22°和24°的双衍射峰，呈现出典型的B 型晶体结构，这是因为脱支的淀粉链在50 ℃下很容易结晶成B 型排列，而快速链缔合结晶通常也会诱导形成完美度相对较低的B 型晶体[19]。另一方面，WRD 的结晶高于NRD，这可能是WRD 在糊化和脱支过程中生成了更多的短直链分子链产物，脱支更完全，并在温和加热的条件下缓慢缔合形成了结晶度更高的A 型晶体[26]。

图2 抗性糊精及其原淀粉的X-衍射图谱Fig.2 X-ray diffraction patterns of resistant dextrins and their native starch

2.4 两种抗性糊精的显微红外光谱分析

抗性糊精及其原淀粉的红外光谱图如图3 所示。由图3 可知，原淀粉表现出在2920～2940 cm-1的C-H 伸缩振动峰，1640～1150 cm-1的C=O 伸缩振动峰，1000～990 cm-1处的吡喃糖环的特征吸收峰[27]。与原淀粉相比，抗性糊精的吸收峰位置未发生明显的变化，说明抗性糊精在形成的过程中未产生新的官能团，脱支和重结晶不会改变淀粉的结构，与张颖[28]和张婷等[29]的研究结果保持一致。但抗性糊精与原淀粉在吸收峰强度上存在差异，这可能归因于制备过程中发生的糖苷键断裂和聚合反应[30]。

图3 抗性糊精及其原淀粉的红外光谱图Fig.3 Infrared spectra of resistant dextrins and their native starch

2.5 两种抗性糊精的溶解度和白度分析

溶解度是评判抗性糊精在饮料等行业中应用的关键指标。抗性糊精及其原淀粉的溶解度和白度如图4 所示。与原淀粉相比，抗性糊精的溶解度显著增加（P＜0.05），这是因为在脱支酶的作用下，淀粉颗粒的无定形区、空间结构和结晶区被破坏，降解生成更多可溶性的小分子物质[31]，随后再聚合生成可溶性更高的抗性糊精。如图4 所示，NRD 的白度显著增加（P＜0.05），而WRD 的白度略有下降，这说明经复合酶解工艺制备的抗性糊精具有优良的产品色泽。

图4 抗性糊精及其原淀粉的溶解度（A）和白度（B）Fig.4 Solubility (A) and whiteness (B) of resistant dextrins and their native starch

2.6 两种抗性糊精的核磁共振波谱分析

核磁共振波谱能分析抗性糊精样品的分子结构及糖苷键的类型，本研究采用1H-NMR 分析抗性糊精及其原淀粉的糖苷键结构及其变化。抗性糊精及其原淀粉的一维氢谱如图5 所示。由图5（A）可知，与NCS 相比，NRD 在δ4.5～5.5×10-6区域内有5.39、5.21、4.63 和4.64 ppm 处出现了新的异头氢信号。由图5（B）可知，与WCS 相比，WRD 在δ4.5～5.5×10-6区域内有5.44、5.43、5.26、5.25、4.69、4.67 和4.69 ppm 处出现了新的异头氢信号。其中，4.79 ppm为D2O 质子峰，α型吡喃糖H-1 质子的化学位移大于4.95 ppm，β型吡喃糖H-1 质子的化学位移小于4.95 ppm[32]。与原淀粉相比，抗性糊精有β型吡喃糖和新的α型吡喃糖生成，表明原淀粉在糊化、脱支和重结晶过程中形成了新的糖苷键，进一步证实了抗性糊精在制备过程中发生了糖苷键的断裂和转糖苷化反应，而导致其糖环发生了振动[33]，这与上述红外光谱的分析结果相一致。

图5 抗性糊精及其原淀粉的一维氢谱图Fig.5 One-dimensional hydrogen spectra of resistant dextrins and their native starch

2.7 两种抗性糊精的体外消化性分析

抗性糊精及其原淀粉的体外消化特性如图6 所示。两种抗性糊精及其原淀粉的RDS 含量排序依次是：WCS＞NCS＞WRD＞NRD，SDS 含量排序依次是：NRD＞WRD＞NCS＞WCS，RS 含量排序依次是：NRD＞NCS＞WRD＞WCS。与原淀粉相比，两种抗性糊精的消化率明显下降，表现为RDS 含量显著下降，SDS 和RS 含量显著升高（P＜0.05）。两种抗性糊精相比之下，NRD 的SDS 和RS 含量最高均高于WRD，具有更好的抗消化性。导致其抗消化性增加的原因有以下三点：a.本研究制备的抗性糊精具有较高的热稳定性，这有助于提高其对淀粉消化酶的抵抗力[34]，是导致抗性糊精难消化的原因之一。经脱支得到的短直链线性分子通过去除淀粉中限制链结合的支链键而获得流动性，随着去分支的继续，淀粉分散度变薄，这促进了分子间的结合和双螺旋结构的形成[15]，从而使抗性糊精的热稳定性提高、抗消化性提高。b.酶水解纯化提高了RD 的结晶度，从而增加了抗性糊精对消化酶的抗性[35]。c.淀粉经糊化、脱支和重结晶过程发生了糖苷键的断裂和转糖苷化反应，经分子重排生成了一些抗消化的糖苷键例如β型吡喃糖和新的α型吡喃糖等，从而提高了抗性糊精对酶的抗消化性。

图6 抗性糊精及其原淀粉的体外消化特性Fig.6 In vitro digestive properties of resistant dextrins and their native starch

3 结论

本研究以普通玉米淀粉和蜡质玉米淀粉为原料，采用绿色环保的脱支、重结晶结合酶水解工艺制备抗性糊精。通过脱支、重结晶和酶水解得到的两种抗性糊精表面粗糙，呈不规则形状的小碎片聚集体，热稳定性高，溶解度增加，具有优良的色泽。NRD呈典型的B 型结晶结构，而WRD 呈典型的A 型结晶结构。在酶解脱支处理中，原有的糖苷键断裂，重新结晶聚合产生新的不易被淀粉酶消化的糖苷键，使抗性糊精的抗消化性增加，其中，NRD 的慢消化和抗消化性最好。本研究将为进一步拓宽抗性糊精的绿色环保制备方法及其产业化生产和应用提供新的思路和理论指导。