基于匹配频数统计矩法的六味地黄浓缩丸谱量学质量控制与评价研究

王玉钗 ，刘 湘 #，田 丽 ，李文姣 ，谯 茹 ，张伟龙 ，潘 雪 ，唐 昱 ，贺福元 , 3, 4*

1. 湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208

2. 中药成药性与制剂制备湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208

3. 湖南中医药大学 中医药超分子机理与数理特征化实验室，湖南 长沙 410208

4. 中药药性与药效国家中医药管理局重点实验室，湖南 长沙 410208

六味地黄丸（Liuwei Dihuang Pills，LD）为滋阴补肾[1]的著名方剂，用于肾阴亏损、头晕耳鸣、腰膝酸软等症状[2-4]，配方由熟地黄、山药、酒萸肉、茯苓、牡丹皮、泽泻[5]6 味中药组成的。六味地黄浓缩丸在OTC 领域销量较高，然而，由于六味地黄浓缩丸（Liuwei Dihuang Concentrated Pills，LDCP）的生产厂家众多，所用原药材质量不一，生产工艺复杂多变，造成其质量参差不齐，影响临床疗效，故其质量控制与评价一直是研究的难点与热点。

目前，研究者们多通过测定单指标或多指标成分含量的方法，来进行LDCP 的质量控制与评价研究，并通过系统聚类[6]、主成分分析、偏最小二乘法[7]和多指标含量测定[8-9]等方法对指纹图谱进行分析。然而，LDCP 原药材受遗传多态性，生长环境和制剂技术的影响，具有化学成分复杂多变、多成分协同发挥整体调控疗效的特点，单一或多个有效成分的含量不能完全代表LDCP 的整体质量。此外，整体性和模糊性是中药指纹图谱的2 大特性，中药药效不是几个单成分简单的线性加合，而是应该从色谱的整体特征考虑“谱-效”关系。药效的强弱与有效成分含量的大小相关联，故作为衡量药效强弱的“量”也应该从色谱图整体出发，在整体的基础上阐明“谱”与“量”的关系。前期研究中，本团队建立了指纹图谱与中药成分含量的谱量学研究体系，包括成分群含量与浸出物含量之间的关系[10-11]。该研究方法不以指纹图谱单个特征峰为信息单元，而是在超分子“印迹模板”理论的指导下，通过匹配频数统计矩法将色谱图划分为一簇簇的段带色谱峰成分簇，以成分簇为“物质单元”将成分群含量与浸膏物含量有机结合起来，通过对“物质单元”的分析对中药化学成分含量进行预测。在实际生产应用中，浸膏量是中药的药效物质基础，是看得见的产品，且出膏率的高低波动对含量有极大影响，最容易体现在内含指标成分含量也随之同比波动[12]。因此，本研究在匹配频数统计矩法的基础上，将谱量学应用于LDCP 的质量控制研究中，将各物质单元对出膏率的贡献进行排序，并预测LDCP 的出膏率与平均出膏率，确定LDCP 的出膏率范围，为LDCP 的质量控制提供新方法与新思路。

1 基本原理

1.1 中药成分群与色谱柱固定相按超分子“印迹模板”相互作用

超分子化学根源于配位化学，其以分子间多种弱相互作用力为研究对象，是研究非共价作用结合起来的分子有序组装体的化学[13]。基于超分子化学，中药可看成由单分子，超分子，聚合超分子以及巨复超分子构成的复杂超分子体系，中药成分群是这一超分子体系的“印迹模板”聚集客体，能够按照“印迹模板”规律与色谱柱固定相产生作用[14-15]，在指纹图谱上呈现凹凸状分布，越接近“印迹模板”的成分，面积越大，出现的频率越高，反映到多个样品指纹图谱匹配时的频数就越大。

1.2 “物质单元”的划分与整合

在超分子化学理论的指导下，匹配频数统计矩法首先根据匹配频数的统计学原理划分出色谱峰成分簇[16]，获得段带色谱总峰面积。其次根据各“印迹模板”成分簇对应的匹配频数，采用总量统计矩原理划分出两两“印迹模板”成分簇的界线，将同一“印迹模板”的成分簇整合为“物质单元”（段带色谱峰成分簇）进行表征。根据中药成分群在与色谱柱上的印迹作用规律，建立以“物质单元”印迹作用的总量统计矩参数为表征的评价体系。该法具有极大地压缩色谱峰数、降低中药物质基础表征单元数目、保留原指纹图谱总量统计矩特征，不改变样本间变异性等优点。据此进行“物质单元”的划分与整合，其物质单元划分与整合思路见图1。

图1 匹配频统计矩法划分与整合LDCP 指纹图谱“印迹模板”物质单元的研究路线图Fig.1 Research roadmap of division and integration of “imprinting template” material units of LDCP fingerprint by matching frequency statistical moment method

1.3 谱量学

前期研究中，本团队对大黄的特征成分簇谱量学进行了初步的研究[10]。研究表明，当物质的化学成分完全能在指纹图谱上进行表征时，其指纹图谱可以看成为由m个色谱峰的零阶矩（AUCT）对物质总浓度（CT）的反映。但由于中药成分复杂，含量高低不一，很多成分难以完全分离，故以吸光度大者为特征峰，与其周围的小峰构成物质单元，并将整张指纹图谱分成多个物质单元。然后，根据朗伯-比尔定律，物质的吸光度与浓度成正比，当进样量为一定值时，物质的含量与浓度呈正比，而物质的含量又峰面积成正比，与故原色谱峰的AUCT与其对应的成分浓度呈线性关系。通过匹配频数统计矩法划分与整合后的各物质单元的总AUCT与其物质单元内对应的成分的总浓度也呈线性关系，呈现线性叠加性。然后根据总量统计矩原理将CT与段带成分簇的AUCT进行了线性回归，发现二者之间具有良好的线性关系，从整体上分析了大黄化学成分总的含量，并建立了中药谱量学的数学模型与实验方法。在后续研究中，本团队又对百合进行了谱量学研究[11]，并将其浸出率与多批次百合的各物质单元总峰面积进行了关联分析，同样获得了良好的线性关系，并找出了各物质单元对浸出率的贡献大小。

2 仪器与材料

2.1 仪器

Acquity UPLC H-Class 型超高效液相色谱仪，美国Waters 公司；DZ-1AIV 型真空干燥箱，天津市泰勒斯仪器有限公司；H3-20KR 型台式高速冷冻离心机，湖南可成仪器开发有限公司；AUY220 型电子天平，岛津企业管理（中国）有限公司；SHZ-D（III）型循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；KH-300DE 型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；DZKW-D-2 型电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；FW-200 型高速万能粉碎机，北京中兴伟业世纪仪器有限公司。

2.2 试剂与药材

乙腈（批号22035335）、甲醇（批号22015112）均为色谱纯，美国天地试剂公司；甲酸，批号20181201，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇，批号20200105，分析纯，太仓沪试试剂有限公司；水，批号14310Z10J，华润怡宝饮料有限公司；0.22 μm 微孔滤膜，批号160531014，天津津腾实验设备有限公司；对照品莫诺苷（批号B20872，HPLC 质量分数≥98%）、马钱苷（B20822，HPLC质量分数≥98%）、丹皮酚（批号B20266，HPLC 质量分数≥98%），上海源叶生物科技有限公司；LDCP，批准文号：国药准字Z43020145，由九芝堂股份有限公司提供，50 个样品均符合《中国药典》2020 年版标准，每8 丸相当于3 g 饮片，产品批号见表1。

表1 50 批LDCP (S1～S50) 的产品信息和出膏率Table 1 Information and paste rate of 50 batches of LDCP (S1 - S50)

3 方法与结果

3.1 供试品溶液的制备

参考《中国药典》2020 年版[17]进行LDCP 供试品溶液制备：LDCP 粉碎后过4 号筛，精密称定粉末1.0 g，置于50 mL 圆底形瓶中，加入50%甲醇15 mL，称定并记录质量。90 ℃水浴回流提取1 h，用50%甲醇补足减失的质量，提取液于10 000 r/min离心机离心10 min，取上清液过0.22 μm 微孔滤膜，置于进样小瓶中，待测。

3.2 对照品溶液的制备

分别精密称定莫诺苷、马钱苷、丹皮酚各1.00 mg，置1 mL 量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，过0.22 μm 微孔滤膜，取各对照品溶液各200 μL，置1 mL 量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，制成混合对照品溶液。

3.3 色谱条件

色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（A），梯度洗脱：0～0.5 min，0.1%乙腈；0.5～20.5 min，0.1%～18.0%乙腈；20.5～23.5 min，18.0%～21.0%乙腈；23.5～30.5 min，21.0%～35.0%乙腈；30.5～34.5 min，35.0%～45.0%乙腈；34.5～36.5 min，45.0%～68.0%乙腈；36.5～37.5 min，68.0%～100.0%乙腈；柱温35 ℃；体积流量0.2 mL/min；进样量2 μL；全波长扫描200～400 nm，图例显示选取波长250 nm。

3.4 方法学考察

3.4.1 精密度试验 取“3.1”项下配制的供试品溶液（S1），在“3.3”项的色谱条件下连续进样6 次，考察各共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD 为0.05%～0.17%，各共有峰相对峰面积的RSD 为0.62%～2.23%，表明仪器精密度良好。

3.4.2 重复性试验 取LDCP 粉末（S1）6 份，每份精密称取1.0 g，按照“3.1”项下方法平行配制LDCP 供试品溶液6 份，在“3.3”项下色谱条件进样测定，考察各共有峰的相对保留时间与相对峰面积，结果显示，共有峰相对保留时间的RSD 为0.04%～0.12%，各共有峰相对峰面积的RSD 为1.30%～2.96%，表明方法重复性良好。

3.4.3 稳定性试验 精密称取LDCP 粉末（S1）1.0 g，按照“3.1”项下方法制备供试品溶液，按照“3.3”项下色谱条件，在制备后0、4、8、16、24、48 h 进样分析，考察各共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD 为0.26%～1.51%，各共有峰相对峰面积的RSD 为0.66%～2.34%，结果表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

3.5 出膏率测定

取LDCP 待测定溶液，置已干燥至恒定质量的蒸发皿中[18]，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥至恒定质量，移至干燥器中，冷却至室温，迅速精密称定质量，以干燥品质量计算各对应条件下的出膏率，结果见表1。

3.6 50 批LDCP 的UPLC 指纹图谱分析

取“2.3.1”项下方法制备的LDCP 供试品溶液和“2.3.2”项下制备的混合对照品溶液，按上述色谱条件进行测定，得到50 批LDCP 的UPLC 指纹图谱，将其导入《中药色谱指纹相似度评价系统》（2012 版）进行分析，得到指纹图谱叠加图（图2），以对照品指认出1 号峰为莫诺苷，2 号峰为马钱苷，3 号峰为丹皮酚（图3）。

图2 50 批LDCP (S1～S50) 的UPLC 指纹图谱Fig.2 UPLC fingerprint of 50 batches of LDCP (S1 - S50)

图3 50 批LDCP 对照谱峰 (R) 及混合对照品 (C) 的指纹图谱Fig.3 50 batches of LDCP reference peak (R) and mixed reference substance (C) fingerprint

3.7 50 批LDCP 指纹图谱物质单元的划分与整合

将50 批LDCP 指纹图谱进行全峰匹配后获得不同色谱峰的匹配频数，通过匹配频数法计算出50批LDCP 指纹图谱划分成“印迹模板”中心成分的最少匹配频数为32.92 个，所以取大于等于匹配数33 的匹配频数色谱峰为物质单元中心成分，共确定了35 个物质单元（A1～A35）；再根据总量统计原理划分出两两物质单元间的保留时间的界值，并计算出新的保留时间和峰面积，50 批LDCP 压缩后生成的新指纹图谱信息见表2（S1～S50）。

表2 50 批样品 (S1～S50) 划分与整合后的新指纹图谱Table 2 New fingerprints of 50 batches of samples (S1 - S50) after division and integration

3.8 匹配频数统计矩法划分与整合前后的指纹图谱的总量统计矩参数对比

导出50 批LDCP 的UPLC 指纹图谱，计算总量零阶矩、一阶矩、二阶矩[19]，并对划分与整合前后的指纹图谱进行总量统计矩参数比较，结果见表3。结果发现，表3 中峰数目整合前后的RSD 变化很大，均大于80%。整合前各批次峰数目不等，RSD为2.39%，整合后各批次峰数目相同，RSD 为0。总量零阶矩的RSD 为0，表明整合前后的色谱总峰面积保持不变；整合前后的总量一阶矩和总量二阶矩的RSD 均在5%以内，变化微小，表明总量统计矩参数总体稳定。

表3 50 批LDCP (S1～S50) 划分与整合前后的指纹图谱进行总量统计矩参数Table 3 Total statistical moment parameters of the fingerprints before and after the division and integration of 50 batches of LDCP (S1 - S50)

由此发现，匹配频数统计矩法在压缩色谱峰数的同时，还保留了原指纹图谱的总量统计矩特性，能以较高准确度来划分与整合LDCP 的指纹图谱，将其表征为物质单元，为简便、科学的指纹图谱分析方法。

3.9 谱量学方程的建立及实验验证

3.9.1 谱量学方程 根据朗伯-比尔定律，色谱峰面积与其成分浓度呈线性关系，整合后的各物质单元色谱总峰面积与物质单元内成分总浓度也呈线性关系，呈现线性的叠加性。故将出膏率（PT）作为因变量，将35 个物质单元（A1～A35）总峰面积作为自变量，用SPSS 软件进行多元线性回归，方程如下：PT＝23.390＋0.041 06 A1-9.100×10-3A2＋0.014 68 A3＋0.027 98 A4-0.033 61 A5-0.042 25 A6-6.608×10-3A7-0.025 90 A8-0.145 60 A9＋0.165 00 A10-0.027 50 A11＋3.408×10-3A12-0.021 03 A13-1.070×10-3A14＋2.833×10-5A15-8.774×10-3A16＋0.018 52 A17-1.882 9×10-3A18＋0.023 61 A19＋8.566×10-3A20＋0.013 94 A21-5.894×10-3A22-0.012 27 A23-0.014 91 A24＋1.792×10-3A25-1.571×10-4A26-3.942×10-3A27-0.054 80 A28＋0.083 15 A29＋0.119 30 A30-0.060 71 A31-0.083 42 A32＋0.014 96 A33-2.989×10-3A34＋0.063 17 A35（r＝0.915）。各物质单元总峰面积与回归系数乘积的绝对值为作用量，通过计算得到35 个物质单元（A1～A35）与常数项的贡献率，其结果按照作用量进行排序，结果见表4。

表4 35 个物质单元的作用量、贡献率、累积贡献率、回归系数排序Table 4 Order of action, contribution rate, cumulative contribution rate and regression coefficient of 35 material units

在表4 中，作用量可表示该物质单元对浸出物体系印迹量的占比，作用量越大，贡献率越大，代表该物质单元内的化学成分的种类或含量越大。本研究中，作用量最大值和最小值分别为物质单元A10和A15，表明物质单元A10内的化学成分出现的频率最高，其种类最丰富，而物质单元A15与之相反。回归系数的正负代表物质单元对浸出物的促进或抑制作用，正值代表促进浸出物溶出，负值代表抑制浸出物溶出。

在本研究中，物质单元A1、A3、A4、A10、A12、A15、A17、A19、A20、A21、A25、A29、A30、A33、A35促进浸出物溶出；而物质单元A2、A5、A6、A7、A8、A9、A13、A14、A16、A18、A22、A23、A24、A26、A27、A28、A31、A32、A34抑制浸出物溶出，两者相互作用，达到平衡时的出膏率为21.95%，RSD 为8.51%，符合中药制剂质量允许变化10%范围的要求。B 为仪器测定时总物质单元响应常数，是回归方程中不受自变量所影响，长期稳定存在的非随机部分。

3.9.2 实验验证 另取LDCP 样品（n＝3，批号202110011、202111009、20211169），按“2.3.1”项下处理得供试品溶液，进样后获得指纹图谱，并对其指纹图谱进行物质单元的划分，所得各物质单元总峰面积带入谱量学方程，计算PT分别为23.79%、20.79%、25.01%，其均值为23.20%。

通过分析均值与谱量学常数项B 的RSD 值，结果显示RSD 为1.15%，说明常数项B 与出膏率均值较为接近，能较好的预测LDCP 的平均出膏趋势。通常均值在加减偏差3 倍（70%～130%）左右为出膏率的允许范围，根据常数项B 值计算出的出膏率变化范围为16.37%～30.41%，故其LDCP 的出膏率应在该范围内波动，超出范围的则不符合LDCP 的质量控制要求。

4 讨论

本课题组前期已经建立了匹配频数统计矩法，并对大黄和百合进行了谱量学研究，得出了一套将超分子“印迹模板”物质单元与浸出物含量相关联的质量控制研究方法，本研究将该方法应用于预测LDCP 的出膏率和平均出膏率研究中，并对所得的物质单元进行作用量排序，有望对LDCP 的质量控制与评价提供新思路与新方法。

基于超分子“印迹模板”理论，通过匹配频数统计矩法将50 批LDCP 指纹图谱进行划分与整合，最终得到35 个物质单元，每个物质单元中的化学成分生物理化性质类似。运用统计学软件，将35 个物质单元总峰面积与出膏率进行线性回归，得到谱量学方程与和每个物质单元的回归系数。回归系数与相应的峰面积相乘得到作用量，可确定各物质单元对浸出物体系的印迹量占比与该物质单元内的化学成分的种类范围与含量高低。本研究中物质单元A10的作用量最大，说明该物质单元对出膏率的贡献率最高，越需要进行控制；物质单元A15的作用量最小，代表该物质单元对出膏率的贡献率最小，对LDCP 的整体质量影响不大。此外，谱量学方程中的常数项B，能较好地预测出膏率的平均出膏趋势，并根据常数项确定了出膏率的变化范围，依此可实现对LDCP 的质量控制与评价。

中药及其制剂具有整体性，依靠单一成分或同时以几个成分作为质量控制的指标成分的方法，不能全面客观地评价中药的质量，更不能保证药效，故从整体上实现对中药的质量控制与评价一直是当下的难点[20-22]。而基于超分子“印迹模板”理论，可弄清色谱柱与中药成分群的作用机制，根据匹配频数统计学原理从整体上把握成分群动态变化规律，在中药质量控制中具有重要作用，是破解目前中药质控碎片化，突破“找成分、测含量、订下限”模式的重要指导，突破单纯的“唯成分论”，是实现中药现代化的思路之一。

综上，本研究基于匹配频数统计矩法对LDCP进行了谱量质量控制研究，通过计算得到各物质单元的作用量排序，并预测了了LDCP 的出膏率与平均出膏率，确定了出膏率的变化范围。后续研究需要进一步对作用量较大的物质单元进行深入分析，并进行体内实验验证。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突