扁刺峨眉蔷薇化学成分及其酪氨酸酶抑制活性研究

付 茂 ，杜彩霞 ，陈俊磊 ，倪 铭 ，李欢阳 ，苑春茂 ，杨 珏 ，黄烈军 ，顾 玮 *

1. 贵州医科大学 省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550014

2. 贵州省天然产物研究中心，贵州 贵阳 550014

3. 贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550025

黑色素是动植物中均含有的一种生物色素，由黑色素细胞生成并储存，黑色素的含量及分布影响了皮肤颜色，当皮肤受到紫外线强烈照射时，紫外线诱导可产生氧自由基，促进酪氨酸酶表达，刺激局部皮肤生成黑色素，从而导致皮肤色素沉着。酪氨酸酶是一种含铜的氧化还原酶，酪氨酸经其催化形成多巴醌，经DHI 氧化酶和DHICA 氧化酶的作用形成黑色素，是黑色素合成过程的主要限速酶[1-2]。研究表明[3]，抑制酪氨酸酶活性可以减少皮肤黑色素的生成，具有良好的美白功效。

蔷薇属植物在贵州分布广泛，目前中国已经发现并记录的蔷薇属植物有96 种，其中贵州省内已经发现并记录的蔷薇属植物资源有42 种，占中国蔷薇植物资源的43.8%[4]。蔷薇属植物作为贵州的优势资源，除了在药用、食品工艺、城市景观等方面发挥着重要作用，以期发现其更多的利用价值。已有研究表明[5]，蔷薇属植物中含有大量酚酸类、黄酮类、三萜类等化合物，其中，有研究发现刺梨多糖、刺梨黄酮和刺梨多酚三种提取物均有显著的抑制酪氨酸酶活性[6]。基于蔷薇属很多植物同时具有药食两用的价值，安全性较高，因此，推测蔷薇属植物在作为美白化妆品原料方面具有较高的开发潜力。

扁刺峨眉蔷薇Rosaomeiensisf.pteracanthaRehd. et Wils.是蔷薇科（Rosaceae）蔷薇属RosaL.直立灌木，别名扁刺、翅刺峨眉蔷薇、红果螳螂果，是峨眉蔷薇R.omeiensisRolfe 的变型，区别是其新枝直立细弱，密被针刺及宽扁大形皮刺，常近于相连而呈翅状，幼时深红，半透明[7]。据本课题组前期实地调研得知，该植物果实可以食用，在当地俗称“沙糖果”，且根茎叶和果实均可入药，在贵州民间主要用于治疗肠胃炎、痢疾、支气管炎等。其果实味甜可以食用，晒干磨粉掺入面粉可作食品，又可入药，有止血、止痢、涩精之效，和《高黎贡山药用植物名录》中所记载的刺石榴果（峨眉蔷薇果实）药用功效一致[8]。目前尚未有其化学成分及药理活性的相关报道。本研究为首次研究扁刺峨眉蔷薇的化学成分，并期望通过B16F10 细胞模型，评价扁刺峨眉蔷薇中化学成分对酪氨酸酶活性的影响，以阐明扁刺峨眉蔷薇在美白功效方面的利用价值。

本实验从扁刺峨眉蔷薇75%甲醇提取物的醋酸乙酯萃取部位中共分离得到21 个化合物，分别鉴定为野鸦椿酸（euscaphic，1）、negundonorin A（2）、覆盆子酸（raspberry acid，3）、刺梨苷（kajiichigoside F1，4）、野蔷薇苷（rosamultin，5）、2α,3α-dihydroxy-19-oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-28-oic acid（6）、胡萝卜苷（β-sitosterol-β-D-glucopyranoside，7）、小麦黄素（tricin，8）、8-甲氧羰基儿茶素（8-methoxycarbonylcatechin，9）、柚皮素（naringenin，10）、槲皮素（quercetin，11）、3,3′-O-二甲基鞣花酸（3,3′-di-O-methylellagic acid，12）、1-hydroxy-2,6-bis-epipinoresinol（13）、东莨菪素（scopoletin，14）、3-吲哚甲醛（indole-3-carboxaldehyde，15）、短叶苏木酚酸甲酯（methyl brevifolin-carboxylate，16）、3,4,5-trimethoxyphenyl-(6′-O-galloyl)-O-β-D-glucopyranoside（17）、没食子酸甲酯（methyl gallate，18）、原儿茶酸（protocatechuic acid，19）、β-羟基-3-甲氧基-4-羟基苯乙酮（β-hydroxypropiovanillone，20）、异香草酸（isovanillic acid，21）。21 个化合物均为首次从扁刺峨眉蔷薇中分离得到。对部分化合物进行酪氨酸酶活性评价，结果表明，在B16F10 细胞模型中，多数化合物表现出显著的酪氨酸酶抑制活性（P＜0.05），且活性高于阳性药曲酸。

1 材料与仪器

柱色谱硅胶（40～80、200～300、300～400 目）和薄层柱色谱硅胶GF254（青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20 凝胶（Pharmacia 公司，美国）；HITACHI 高效液相色谱仪（Primaide，日立高新技术集团，日本）；反相填充材料RP-18（Merck 公司，德国）；HPLC 色谱柱为Zorbax SB-C18（半制备柱，250 mm×9.4 mm，5 μm，安捷伦公司，美国）；INOVA-600 MHz 核磁共振波谱仪（Bruker 公司，德国）；HP 1100 型液相色谱质谱联用仪（惠普公司，美国）；API Qstar Pulsar 质谱仪；BioTek Epoch 全波长酶标仪（BioTek 公司，美国）。本实验所用石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、丙酮、甲醇等有机溶剂均为工业级，重蒸后使用；色谱级的甲醇（云南新蓝景化学工业有限公司）。小鼠黑色素瘤细胞B16F10 来源于ATCC；DMEM 培养基（Solarbio 公司，中国）；胎牛血清（Gemini 公司，美国）；胰酶（Solarbio 公司，中国）；四甲基偶氮噻唑蓝（麦克林生化科技，中国）；曲酸（麦克林生化科技，批号C12718847）。

扁刺峨眉蔷薇全株于2021 年7 月采自贵州省毕节市大方县，经贵州省天然产物研究中心顾玮副研究员鉴定为扁刺峨眉蔷薇R.omeiensisf.pteracanthaRehd. et Wils，凭证标本（GZCNG-2021-0235）保存于贵州省天然产物研究中心。

2 方法

2.1 提取与分离

取扁刺峨眉蔷薇干燥植株54.0 kg 进行粉碎，用75%甲醇-水溶液75 ℃提取5 次（每次4 h），滤过，合并提取液，减压浓缩得到提取物浸膏，共6.0 kg，加水将其溶解成混悬液，将醇提取物依次用石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取溶液至无色，减压浓缩各部分萃取液得到石油醚部分、醋酸乙酯部分和正丁醇部分。将醋酸乙酯部位（1.2 kg）用硅胶柱色谱（40～80 目）进行分离，洗脱溶剂为三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇（30∶1、20∶1、15∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1）、甲醇，结合TLC 检测，将醋酸乙酯部分分为6 个组分（Fr. A～F）。

Fr. B（96.0 g）通过RP-18 柱色谱，用甲醇-水（10∶90～100∶0）洗脱得到9 个组分。Fr. B.1（8.8 g）用硅胶柱色谱（100～200 目）进行分离，三氯甲烷-甲醇（50∶1～1∶1）梯度洗脱得到Fr. B 1.1～B 1.9，Fr. B 1.3（151.0 mg）用硅胶柱色谱（300～400目）进行分离，三氯甲烷-甲醇（80∶1～1∶1）梯度洗脱得到得到化合物、15（2.5 mg）、14（4 mg），Fr.B 1.6（2.34 g）用硅胶柱色谱（200～300 目）进行分离，三氯甲烷-甲醇（50∶1～1∶1）梯度洗脱得到Fr. B 1.6.1～B 1.6.8，Fr. B 1.6.2（253 mg）经Sephadex LH-20凝胶柱色谱得到化合物21（30 mg）。Fr. B 1.6.7（253 mg）经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱得到化合物9（5 mg）。Fr. B 1.6.4（1.06 g）经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱得到Fr. B 1.6.4.1～B 1.6.4.10，Fr. B 1.6.4.10（153 mg）用硅胶柱色谱（300～400 目）进行分离，三氯甲烷-丙酮（50∶1～1∶1）梯度洗脱得到化合物20（35 mg）。Fr. B 1.6.4.8（200 mg）经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱得到4 个组分，Fr. B 1.6.4.8.4（90 mg）用硅胶柱色谱（300～400 目）进行分离，三氯甲烷-甲醇（100∶1～1∶1）梯度洗脱得到得到化合物3（15 mg）、2（13 mg）。Fr. B.3 中析出白色粉末，滤出得到化合物12（9.3 mg），Fr. B.3（14 g）用硅胶柱色谱（100～200 目）进行分离，三氯甲烷-丙酮（50∶1～1∶1）梯度洗脱得到Fr. B3.1～B3.11，Fr. B3.1.7 中重结晶得到化合物8（11.2 mg），Fr. B 3.4（3.36 g）经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱得到8 个组分，Fr. B 3.4.4（1.78 g）用硅胶柱色谱（200～300 目）进行分离，三氯甲烷-丙酮（50∶1～1∶1）梯度洗脱得到化合物1（300 mg），Fr. B.4 中析出无色结晶，得到化合物6（28.2 mg），Fr. B 1.7（4.5 g）经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱得到化合物11（8 mg），Fr. B 1.7.9（1.34 g）用硅胶柱色谱（200～300 目）进行分离，石油醚-醋酸乙酯（30∶1～1∶1）梯度洗脱得到Fr. B 1.7.9.1～B 1.7.9.8，Fr. B 1.7.9.6（1.1 g）用硅胶柱色谱（200～300 目）进行分离，石油醚-醋酸乙酯（20∶1～1∶1）梯度洗脱得到化合物13（200 mg），Fr. B. 2（1.03 g）用硅胶柱色谱（200～300 目）进行分离，三氯甲烷-丙酮（50∶1～1∶1）梯度洗脱得到Fr. B 2.1～B 2.8，Fr. B 2.6（207 mg）经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱得到化合物10（43 mg），Fr. B 2.4（300 mg）经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱得到5 个组分，Fr. B 2.4.3（150 mg）经半制备RP-HPLC（甲醇-水54∶46，2.0 mL/min）得到化合物18（tR＝32.1 min）、19（tR＝41.0 min）。

Fr. D（335 g）用RP-18 柱色谱，甲醇-水（10∶90～100∶0）洗脱得到26 个组分。Fr. D.4（20 g）用硅胶柱色谱（200～300 目）进行分离，三氯甲烷-甲醇（50∶1～1∶1）梯度洗脱得到得到化合物16（110 mg）。Fr. D 4.4（3.3 g）经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱得到7 个组分，Fr. D 4.4.3（832 mg）用硅胶柱色谱（200～300 目）进行分离，三氯甲烷-甲醇（80∶1～1∶1）梯度洗脱得到得到Fr. D 4.4.3.1～D 4.4.3.9，Fr. D 4.4.3.6 经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱得到化合物17（30 mg）。Fr. D.12（2 g）经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱得到3 个组分，Fr. D 12.3（500 mg）经半制备RP-HPLC（甲醇-水63∶37，2.0 mL/min）得到化合物5（100 mg，tR＝15.1 min）、4（9 mg，tR＝12.0 min）。Fr. D.25（1.1 g）用硅胶柱色谱（200～300 目）进行分离，三氯甲烷-甲醇（20∶1～1∶1）梯度洗脱得到化合物7（200 mg）。

2.2 扁刺峨眉蔷薇化合物对B16F10 细胞酪氨酸酶活性的影响

2.2.1 实验分组 将B16F10 细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM 培养基中，37 ℃、5% CO2饱和湿度环境下培养，待细胞生长至融合状态，以胰酶消化传代，每2 天传代1 次。收集对数生长期细胞，调整细胞密度至5×104个/mL，接种于96 孔板中，每孔100 μL，细胞浓度为5×103个/孔，37 ℃、5%CO2饱和湿度环境下培养24 h 后，将细胞分为空白组、正常组、实验组、阳性对照组（曲酸），实验组加入含有不同浓度化合物的培养基100 μL，正常组细胞中加入100 μL 不含药物的培养基，空白组不接种细胞，代之等量培养基，其余各组分别加入100 μL 含有相应剂量药物培养基。每组设置3 个重复，于37 ℃、5% CO2孵育48 h。

2.2.2 MTT 比色法测定化合物对B16F10 细胞的毒性 参考已报道实验方法[9]并稍作修改，按“2.2.1”项下方法处理细胞48 h 后，每孔加入10 μL 的MTT溶液，放培养箱4 h 后，弃去上清液，每孔加入100 μL DMSO，震荡10 min，待结晶充分溶解后，酶标仪测定570 nm 下吸光度值（A570），实验重复3 次。计算细胞存活率。

细胞存活率＝(实验组A570-空白组A570)/(正常组A570-空白组A570)

2.2.3 多巴氧化法测定化合物对B16F10 细胞内酪氨酸酶活性的影响 参考已报道实验方法[10-11]并稍作修改，按“2.2.1”项下方法处理细胞48 h 后，弃去上清液，用PBS 洗涤2 次，每孔加入质量分数为1%的Triton X-100 溶液100 μL，迅速放入-80 ℃冰箱冻存1 h，随后移至室温下裂解细胞，37 ℃预温后每孔加入浓度为10 mmol/LL-DOPA 100 μL，37 ℃培养箱放置2 h，酶标仪检测475 nm 下吸光度值（A475），实验重复3 次。

酪氨酸酶活性＝(实验组A475-空白组A475)/(正常组A475-空白组A475)

2.3 统计学分析

采用SPSS 25.0 统计软件进行统计学分析。计量资料采用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 结构鉴定

化合物1：白色粉末（三氯甲烷-甲醇），分子式C30H48O5，ESI-MSm/z: 487 [M-H]-。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 0.77 (3H, s, H-23), 0.85 (3H, s, H-24), 0.91 (3H, d,J= 6.7 Hz, H-30), 0.97 (6H, s, H-25,26), 1.17 (3H, s, H-29), 1.33 (3H, s, H-27), 2.48 (3H, s,H-18), 3.30 (1H, d,J= 2.3 Hz, H-3), 3.91 (1H, dt,J=11.2, 3.2 Hz, H-2), 5.27 (1H, t,J= 3.2 Hz, H-12)；13CNMR (150 MHz, CD3OD)δ: 41.1 (C-1), 65.8 (C-2),78.7 (C-3), 38.0 (C-4), 47.9 (C-5, 17), 17.9 (C-6), 32.7(C-7), 39.7 (C-8), 46.8 (C-9), 38.1 (C-10), 23.3 (C-11),128.0 (C-12), 138.7 (C-13), 41.3 (C-14), 27.9 (C-15),25.7 (C-16), 47.6 (C-17), 53.7 (C-18), 72.2 (C-19), 41.7(C-20), 25.2 (C-21), 37.6 (C-22), 28.2 (C-23), 21.6 (C-24), 15.2 (C-25), 16.1 (C-26), 23.5 (C-27), 180.9 (C-28), 25.9 (C-29), 15.5 (C-30)。以上数据与文献报道的基本一致[12]，故鉴定化合物1 为野鸦椿酸。

化合物 2：无色油状物（甲醇），分子式C29H40O5，ESI-MSm/z: 467 [M-H]-。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 0.94 (3H, d,J= 6.7 Hz, H-29), 1.13(3H, s, H-26), 1.21 (3H, s, H-27), 1.24 (3H, s, H-30),1.32 (3H, s, H-25), 1.57, 2.45 (2H, m, H-16), 2.00 (3H,s, H-23), 2.35, 2.82 (2H, m, H-6), 2.58 (1H, s, H-18),5.40 (1H, t,J= 3.6 Hz, H-12), 6.31 (1H, s, H-1)；13CNMR (150 MHz, CD3OD)δ: 126.2 (C-1), 145.0 (C-2),181.8 (C-3), 126.4 (C-4), 166.8 (C-5), 25.2 (C-6), 34.7(C-7), 40.0 (C-8), 45.0 (C-9), 43.5 (C-10), 25.8 (C-11),127.7 (C-12), 139.1 (C-13), 42.2 (C-14), 28.6 (C-15),25.4 (C-16), 47.8 (C-17), 53.9 (C-18), 72.0 (C-19), 41.7(C-20), 25.6 (C-21), 37.4 (C-22), 9.4 (C-23), 20.3 (C-25), 15.9 (C-26), 22.9 (C-27), 181.8 (C-28), 15.2 (C-29),27.2 (C-30)。以上数据与文献报道的基本一致[13]，故鉴定化合物2 为negundonorin A。

化合物3：白色粉末（甲醇），分子式C30H44O5，ESI-MSm/z: 485 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 0.91 (3H, s, H-24), 0.96 (3H, d,J= 6.7 Hz,H-30), 1.14 (3H, s, H-26), 1.21 (3H, s, H-25), 1.24 (3H,s, H-23), 1.26 (3H, s, H-29), 1.38 (3H, s, H-27), 5.38(1H, t,J= 3.5 Hz, H-12), 6.32 (1H, s, H-1)；13C-NMR(150 MHz, CD3OD)δ: 129.0 (C-1), 146.0 (C-2), 202.4(C-3), 45.5 (C-4), 55.3 (C-5), 20.3 (C-6), 34.0 (C-7),39.5 (C-8), 44.1 (C-9), 43.1 (C-10), 24.7 (C-11), 130.2(C-12), 140.4 (C-13), 43.0 (C-14), 29.6 (C-15), 27.1 (C-16), 49.1 (C-17), 55.1 (C-18), 73.5 (C-19), 41.7 (C-20),26.6 (C-21), 39.0 (C-22), 28.1 (C-23), 22.3 (C-24), 20.1(C-25), 17.9 (C-26), 24.9 (C-27), 182.28 (C-28), 27.3(C-29), 16.6 (C-30)。以上数据与文献报道的基本一致[14]，故鉴定化合物3 为覆盆子酸。

化合物4：白色粉末（甲醇），分子式C36H58O10，ESI-MSm/z: 649 [M-H]-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 0.74 (3H, s, H-26), 0.84 (3H, s, H-19), 0.90(3H, d,J= 6.7 Hz, H-30), 0.96 (3H, s, H-25), 0.97 (3H,s, H-23), 1.18 (3H, s, H-27), 1.32 (3H, s, H-29), 2.49(1H, s, H-18), 3.66 (1H, dd,J= 12.1, 4.8 Hz, H-6a′),3.78 (1H, dd,J= 12.1, 2.3 Hz, H-6b′), 3.91 (1H, dt,J=11.0, 3.1 Hz, H-2), 5.29 (1H, t,J= 3.5 Hz, H-12), 5.30(1H, s, H-1′)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 41.6(C-1), 65.8 (C-2), 78.7 (C-3), 38.1 (C-4), 48.1 (C-5),17.9 (C-6), 32.6 (C-7), 40.0 (C-8), 46.8 (C-9), 38.0 (C-10), 23.4 (C-11), 128.2 (C-12), 138.3 (C-13), 41.2 (C-14), 28.3 (C-15), 25.7 (C-16), 48.0 (C-17), 53.6 (C-18),72.3 (C-19), 41.4 (C-20), 25.8 (C-21), 36.9 (C-22), 27.9(C-23), 21.1 (C-24), 15.6 (C-25), 16.3 (C-26), 23.4 (C-27), 177.2 (C-28), 25.1 (C-29), 15.2 (C-30), 94.4 (C-1′), 72.5 (C-2′), 77.2 (C-3′), 69.7 (C-4′), 76.9 (C-5′),61.0 (C-6′)。以上数据与文献报道的基本一致[15]，故鉴定化合物4 为刺梨苷。

化合物5：白色粉末（甲醇），分子式C36H58O10，ESI-MSm/z: 651 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 0.75 (3H, s, H-26), 0.78 (3H, s, H-19), 0.83(1H, d,J= 12.1 Hz, H-5), 0.87, 1.97 (2H, m, H-1), 0.91(3H, d,J= 6.7 Hz, H-30), 0.97 (3H, s, H-23), 0.99 (3H,s, H-25), 1.18 (3H, s, H-27), 1.21, 1.27 (2H, m, H-21),1.30 (3H, s, H-29), 1.32, 1.50 (2H, m, H-15), 1.35 (1H,H-20), 1.41, 1.52 (2H, m, H-6), 1.59, 2.60 (2H, m, H-16), 1.61, 1.78 (2H, m, H-7), 1.68, 1.82 (2H, m, H-22),1.71 (1H, m, H-9), 1.92 (1H, dd,J= 12.5, 4.6 Hz, H-11a), 1.99 (1H, m, H-11b), 2.50 (1H, s, H-18), 2.89 (1H,d,J= 9.5 Hz, H-3), 3.28～3.39 (4H, m, H-5′～2′), 3.61(1H, m, H-2), 3.65 (1H, dd,J= 11.9, 4.7 Hz, H-6a′),3.78 (1H, dd,J= 12.1, 2.2 Hz, H-6b′), 5.29 (1H, d,J=5.9 Hz, H-12), 5.35 (1H, s, H-1′)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 47.2 (C-1), 68.1 (C-2), 83.1 (C-3), 39.1 (C-4), 55.3 (C-5), 18.3 (C-6), 36.9 (C-7), 41.3 (C-8), 46.8(C-9), 37.8 (C-10), 23.4 (C-11), 128.1 (C-12), 138.3 (C-13), 40.0 (C-14), 32.7 (C-15), 25.1 (C-16), 48.1 (C-17),53.5 (C-18), 72.4 (C-19), 41.5 (C-20), 25.7 (C-21), 28.2(C-22), 27.9 (C-23), 15.7 (C-24), 15.3 (C-25), 16.2 (C-26), 23.3 (C-27), 177.1 (C-28), 25.8 (C-29), 16.1 (C-30), 94.4 (C-1′), 69.7 (C-2′), 72.2 (C-3′), 76.8 (C-4′),77.2 (C-5′), 61.0 (C-6′)。以上数据与文献报道的基本一致[16]，故鉴定化合物5 为野蔷薇苷。

化合物6：白色粉末（甲醇），分子式C30H46O5，ESI-MSm/z: 487 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 0.76 (3H, s, H-26), 0.89 (3H, s, H-24), 0.99(3H, s, H-23), 1.00 (3H, s, H-27), 1.01 (3H, s, H-25),1.09 (3H, d,J= 7.2 Hz, H-30), 2.17 (3H, s, H-29), 2.19(1H, s, H-9), 2.56 (1H, m, H-20), 3.38 (1H, s, H-3), 4.01(1H, dt,J= 3.0, 10.8 Hz, H-2), 5.44 (1H, s, H-18), 5.71(1H, dd,J= 1.2, 10.2 Hz, H-11), 6.01 (1H, dd,J= 3.0,10.2 Hz, H-12)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 42.2(C-1), 66.9 (C-2), 80.1 (C-3), 39.6 (C-4), 49.8 (C-5),18.9 (C-6), 33.2 (C-7), 41.8 (C-8), 55.3 (C-9), 39.1 (C-10), 127.9 (C-11), 131.2 (C-12), 143.6 (C-13), 42.4 (C-14), 27.2 (C-15), 28.1 (C-16), 48.3 (C17), 129.0 (C-18),215.3 (C-19), 48.4 (C-20), 28.8 (C-21), 39.5 (C-22),29.1 (C-23), 21.9 (C-24), 20.3 (C-25), 17.1 (C-26), 19.4(C-27), 178.2 (C-28), 28.3 (C-29), 16.5 (C-30)。以上数据与文献报道的基本一致[17]，故鉴定化合物6 为2α,3α-dihydroxy-19-oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-28-oic acid。

化合物7：白色粉末（三氯甲烷），分子式C35H60O6，ESI-MSm/z: 599 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, C5D5N)δ: 0.58 (3H, s, H-18), 0.86～0.90 (9H,m, H-26, 27, 29), 0.93 (3H, s, H-19), 1.10 (3H, d,J=6.2 Hz, H-21), 2.37 (1H, m, H-4a), 2.63 (1H, d,J= 11.8 Hz, H-4b), 3.87～3.90 (2H, m, H-3, 5′), 3.95 (1H, dd,J= 8.7, 5.2 Hz, H-2′), 4.15～4.24 (2H, m, H-3′, 4′),4.32 (1H, dd,J= 10.6, 4.7 Hz, H-6a′), 4.46 (1H, d,J=11.7 Hz, H-6b′), 4.95 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-1′), 5.25(1H, s, H-5)；13C-NMR (150 MHz, C5D5N)δ: 37.2 (C-1), 30.0 (C-2), 78.3 (C-3), 39.0 (C-4), 140.6 (C-5),121.6 (C-6), 31.9 (C-7), 31.8 (C-8), 50.0 (C-9), 36.6 (C-10), 21.0 (C-11), 40.0 (C-12), 42.2 (C-13), 56.5 (C-14),24.2 (C-15), 28.3 (C-16), 56.0 (C-17), 11.9 (C-18), 19.7(C-19), 36.1 (C-20), 19.1 (C-21), 33.9 (C-22), 26.1 (C-23), 45.7 (C-24), 29.2 (C-25), 18.7 (C-26), 18.9 (C-27),23.1 (C-28), 11.7 (C-29), 102.3 (C-1′), 75.0 (C-2′), 78.1(C-3′), 71.3 (C-4′), 77.9 (C-5′), 62.5 (C-6′)。以上数据与文献报道的基本一致[18]，故鉴定化合物7为胡萝卜苷。

化合物8：黄色针状结晶（甲醇），分子式C17H14O7，ESI-MSm/z: 329 [M-H]-。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 3.88 (6H, s, -CH3), 6.20 (1H, s, H-6), 6.56 (1H, s, H-8), 6.95 (1H, s, H-3), 7.31 (2H, s, H-6′, 2′), 13.00 (1H, s, 5-OH)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 164.1 (C-2), 104.0 (C-3), 182.3 (C-4),161.8 (C-5), 99.3 (C-6), 164.1 (C-7), 94.7 (C-8), 157.8(C-9), 104.1 (C-10), 120.8 (C-1′), 104.7 (C-6′, 2′),148.6 (C-3′, 5′), 140.4 (C-4′), 56.8 (-OCH3)。以上数据与文献报道的基本一致[19]，故鉴定化合物8 为小麦黄素。

化合物 9：无色油状物（丙酮），分子式C17H16O8，ESI-MSm/z: 347 [M-H]-。1H-NMR (600 MHz, acetone-d6)δ: 2.53 (1H, dd,J= 16.1, 7.3 Hz, H-4b), 2.80 (1H, dd,J= 16.3, 5.2 Hz, H-4a), 4.05 (1H, s,H-3), 4.06 (3H, s, H-2′′), 4.76 (1H, d,J= 7.1 Hz, H-2),5.92 (1H, s, H-6), 6.71 (1H, dd,J= 8.0, 2.4 Hz, H-6′),6.80 (1H, dd,J= 2.2, 7.9 Hz, H-5′), 6.85 (1H, t,J= 2.4 Hz, H-2′)；13C-NMR (150 MHz, acetone-d6)δ: 82.3 (C-2), 66.5 (C-3), 26.6 (C-4), 160.0 (C-5), 95.3 (C-6),160.0 (C-7), 94.6 (C-8), 161.2 (C-9), 100.6 (C-10),130.3 (C-1′), 114.0 (C-2′), 145.0 (C-3′), 145.1 (C-4′),115.0 (C-5′), 118.7 (C-6′), 170.4 (C-1′′), 52.2 (C-2′′)。以上数据与文献报道的基本一致[20]，故鉴定化合物9 为8-甲氧羰基儿茶素。

化合物10：无色结晶（甲醇），分子式C15H12O5，ESI-MSm/z: 271 [M-H]-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 2.71 (1H, dd,J= 3.0, 17.1 Hz, H-3cis), 3.16(1H, dd,J= 12.8, 17.1 Hz, H-3trans), 5.36 (1H, dd,J=2.9, 12.9 Hz, H-2), 5.92 (2H, dd,J= 2.2, 7.4 Hz, H-6,8), 6.84 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-3′, 5′), 7.33 (2H, d,J=8.5 Hz, H-2′, 6′)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 79.1(C-2), 42.6 (C-3), 196.3 (C-4), 164.1 (C-5), 94.8 (C-6),167.0 (C-7), 95.7 (C-8), 163.5 (C-9), 102.0 (C-10),129.7 (C-1′), 127.7 (C-6′, 2′), 115.0 (C-3′, 5′), 157.6 (C-4′)。以上数据与文献报道的基本一致[21]，故鉴定化合物10 为柚皮素。

化合物11：黄色针晶（甲醇），分子式C15H10O7，ESI-MSm/z: 301 [M-H]-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 6.23 (1H, d,J= 1.3 Hz, H-6), 6.44 (1H, s,H-6), 6.93 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-5′), 7.65 (1H, dd,J=8.4, 1.3 Hz, H-6′), 7.75 (1H, d,J= 1.2 Hz, H-2′)；13CNMR (150 MHz, CD3OD)δ: 146.8 (C-2), 135.8 (C-3),176.0 (C-4), 103.2 (C-4a), 156.8 (C-5), 98.0 (C-6),164.1 (C-7), 93.2 (C-8), 163.9 (C-8a), 122.7 (C-1′),115.0 (C-2′), 144.8 (C-3′), 147.4 (C-4′), 114.7 (C-5′),120.4 (C-6′)。以上数据与文献报道的基本一致[22]，故鉴定化合物11 为槲皮素。

化合物12：白色粉末（三氯甲烷），分子式C16H10O8，ESI-MSm/z: 331 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 4.04 (6H, s, 2×OCH3), 7.51 (2H,s, H-5, 5′′)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 112.1(C-1, 1′), 141.6 (C-2, 2′), 140.7 (C-3, 3′), 152.7 (C-4,4′), 111.9 (C-5, 5′), 112.6 (C-6, 6′), 159.0 (C-7, 7′), 61.4(2×OCH3)。以上数据与文献报道的基本一致[23]，故鉴定化合物12 为3,3′-O-二甲基鞣花酸。

化合物13：白色粉末（甲醇），分子式C20H22O7，ESI-MSm/z: 375 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 2.71 (1H, t,J= 6.9 Hz, H-5α), 3.46 (1H, d,J= 10.3 Hz, H-8α), 3.64 (1H, d,J= 10.3 Hz, H-8β),3.87 (6H, s, 3′, 3′′-OCH3), 4.02 (1H, d,J= 9.5 Hz, H-4β), 4.10 (1H, dd,J= 6.5, 9.5 Hz, H-4α), 4.45 (1H, d,J= 7.8 Hz, H-6α), 4.68 (1H, s, H-2α), 6.80 (1H, d,J=8.0 Hz, H-6′′), 6.82 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-5′′), 6.87 (1H,d,J= 8.0 Hz, H-5′), 6.94 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-2′′), 7.06(1H, d,J= 1.7 Hz, H-6′), 7.09 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-2′)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 92.8 (C-1), 85.8(C-2), 69.2 (C-4), 62.5 (C-5), 89.1 (C-6), 75.8 (C-8),128.8 (C-1′), 108.7 (C-2′), 147.3 (C-3′), 145.6 (C-4′),114.6 (C-5′), 117.7 (C-6′), 132.0 (C-1′′), 109.7 (C-2′′),147.8 (C-3′′), 146.1 (C-4′′), 114.6 (C-5′′), 119.2 (C-6′′),55.0 (3′, 3′′-OCH3)。以上数据与文献报道的基本一致[24]，故鉴定化合物13 为1-hydroxy-2,6-bis-epipinoresinol。

化合物14：白色粉末（甲醇），分子式C10H8O4，ESI-MSm/z: 193 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 3.93 (3H, s, 6-OCH3), 6.22 (1H, d,J= 9.4 Hz, H-3), 6.79 (1H, s, H-8), 7.13 (1H, s, H-5), 7.87 (1H,d,J= 9.4 Hz, H-4)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ:162.8 (C-2), 111.2 (C-3), 144.8 (C-4), 108.5 (C-5),145.7 (C-6), 150.0 (C-7), 102.6 (C-8), 151.5 (C-9),111.2 (C-10), 55.4 (6-OCH3)。以上数据与文献报道的基本一致[25]，故鉴定化合物14 为东莨菪素。

化合物15：白色无定型粉末（甲醇），分子式C9H7NO，ESI-MSm/z: 144 [M-H]-。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 7.27 (1H, m, H-5), 7.29 (1H, m, H-6), 7.50 (1H, d,J= 7.9 Hz, H-2), 8.12 (1H, s, H-4), 8.19(1H, d,J= 7.7 Hz, H-7), 9.91 (1H, s, H-8)；13C-NMR(150 MHz, CD3OD)δ: 138.4 (C-2), 118.7 (C-3), 124.3(C-3a), 121.0 (C-4), 122.3 (C-5), 123.6 (C-6), 111.8 (C-7), 138.4 (C-7a), 186.1 (C-8)。以上数据与文献报道的基本一致[26]，故鉴定化合物15 为3-吲哚甲醛。

化合物16：淡黄色针状结晶（三氯甲烷-甲醇），分子式C14H10O8，ESI-MSm/z: 305 [M-H]-。1HNMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 2.45 (1H, dd,J= 18.8,2.1 Hz, H-10b), 2.95 (1H, dd,J= 18.6, 7.8 Hz, H-10a),3.61 (3H, s, -OCH3), 4.36 (1H, dd,J= 7.7, 2.0 Hz, H-9),7.24 (1H, s, H-7)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ:146.2 (C-2), 138.7 (C-3), 113.4 (C-3a), 143.9 (C-4), 140.6(C-5), 150.0 (C-6), 108.4 (C-7), 115.3 (C-7a), 160.1 (C-8), 41.0 (C-9), 37.3 (C-10), 193.4 (C-11), 173.0 (C=O),52.5 (-OCH3)。以上数据与文献报道的基本一致[27]，故鉴定化合物16 为短叶苏木酚酸甲酯。

化合物17：白色粉末（甲醇），分子式C22H26O13，ESI-MSm/z: 497 [M-H]-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 3.43 (3H, m, H-3′～5′), 3.65 (6H, s, OCH3-3,5), 3.66 (3H, s, 4-OCH3), 3.78 (1H, m, H-2′), 4.40(1H, dd,J= 11.9, 6.6 Hz, H-6′b), 4.63 (1H, dd,J= 12.0,1.9 Hz, H-6′a), 4.84 (1H, d,J= 7.5 Hz, H-1′), 6.38 (2H,s, H-2, 6), 7.01 (2H, s, H-2′′, 6′′)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 154.5 (C-1), 94.5 (C-2, 6), 153.3 (C-3, 5),133.2 (C-4), 59.9 (3, 5-OCH3), 55.1 (4-OCH3), 101.8(C-1′), 73.5 (C-2′), 76.2 (C-3′), 70.4 (C-4′), 74.4 (C-5′),63.7 (C-6′), 119.9 (C-1′′), 108.8 (C-2′′, 6′′), 145.2 (C-3′′, 5′′), 138.6 (C-4′′), 166.9 (C-7′′)。以上数据与文献报道的基本一致[28]，故鉴定化合物17 为3,4,5-trimethoxyphenyl-(6′-O-galloyl)-O-β-D-glucopyranoside。

化合物18：白色粉末（甲醇），分子式C8H8O5，ESI-MSm/z: 185 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 3.83 (3H, s, -OCH3), 7.10 (2H, s, H-2, 6)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 51.0 (-OCH3), 120.1(C-1), 108.7 (C-2, 6), 145.1 (C-3, 5), 138.4 (C-4), 167.7(C=O)。以上数据与文献报道的基本一致[29]，故鉴定化合物18 为没食子酸甲酯。

化合物19：白色粉末（甲醇），分子式C7H6O4，ESI-MSm/z: 155 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 6.82 (1H, d,J= 8.1 Hz, H-5), 7.45 (1H, dd,J= 8.2, 1.9 Hz, H-6), 7.46 (1H, d,J= 1.9 Hz, H-2)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 121.7 (C-1), 116.3(C-2), 144.7 (C-3), 150.1 (C-4), 114.4 (C-5), 122.5 (C-6), 169.0 (C=O)。以上数据与文献报道的基本一致[30]，故鉴定化合物19 为原儿茶酸。

化合物20：白色粉末（甲醇），分子式C10H12O4，ESI-MSm/z: 219 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 3.12 (2H, d,J= 5.6 Hz, H-2′), 3.87 (3H, s,-OCH3), 3.92 (2H, d,J= 5.9 Hz, H-3′), 6.83 (1H, d,J=8.2 Hz, H-5), 7.52 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-2), 7.55 (1H,d,J= 7.3 Hz, H-6)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ:130.5 (C-1), 111.8 (C-2), 149.1 (C-3), 115.8 (C-5),124.7 (C-6), 199.7 (C-1′), 41.6 (C-2′), 58.9 (C-3′), 56.3(-OCH3)。以上数据与文献报道的基本一致[31]，故鉴定化合物20 为β-羟基-3-甲氧基-4-羟基苯乙酮。

化合物21：无色结晶（三氯甲烷-甲醇），分子式C8H8O4，ESI-MSm/z: 167 [M-H]-。1H-NMR (600 MHz, acetone-d6)δ: 3.91 (3H, s, -OCH3), 6.92 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-5), 7.57 (1H, s, H-2), 7.61 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-6)；13C-NMR (150 MHz, acetone-d6)δ: 122.0(C-1), 112.6 (C-2), 147.2 (C-3), 151.2 (C-4), 114.6 (C-5),124.0 (C-6), 55.4 (-OCH3), 167.5 (-COOH)。以上数据与文献报道的基本一致[32]，故鉴定化合物21 为异香草酸。

3.2 化合物酪氨酸酶抑制活性筛选

3.2.1 扁刺峨眉蔷薇化合物对B16F10 的细胞毒性选择其中15 个化合物在浓度为40 μmol/L 的条件下进行B16F10 细胞毒性评价，结果如图1 所示，与对照组比较，在40 μmol/L 浓度下，化合物4、6、7、11、12 对B16F10 细胞有较显著的细胞毒（P＜0.05）；而化合物1～3、5、8、10、13～14、16、21对B16F10 细胞未表现出细胞毒性，因此，后续对在40 μmol/L 浓度下无细胞毒性的化合物继续进行抑制酪氨酸酶活性评价。

图1 扁刺峨眉蔷薇化合物 (40 μmol·L-1) 对B16F10 细胞增殖的影响 (±s, n = 3)Fig.1 Effect of compounds from R. omeiensis f.pteracantha (40 μmol·L-1) on cell proliferation of B16F10 cells (±s, n = 3)

3.2.2 扁刺峨眉蔷薇化合物对B16F10 细胞内酪氨酸酶活性的影响 实验组设置为3 个不同浓度（10、20、40 μmol/L），评价上述40 μmol/L 浓度下无细胞毒化合物对B16F10 细胞内酪氨酸酶的抑制活性。结果见图2，在40 μmol/L 时，化合物1～3、5、13、14、16、21 对酪氨酸酶有显著抑制活性，其中，化合物5 活性最强；在20 μmol/L 时，化合物1、3、5、14、21 具有显著的酪氨酸酶抑制活性；浓度降至10 μmol/L 时，化合物1 依然表现出显著的酪氨酸酶抑制活性。值得注意的是，以上化合物的酪氨酸酶抑制活性均高于阳性药曲酸。

图2 扁刺峨眉蔷薇化合物对B16F10 细胞内酪氨酸酶活性的影响 (±s, n = 3)Fig.2 Effect of compounds from R. omeiensis f. pteracantha on tyrosinase activity of B16F10 cells (±s, n = 3)

4 讨论

本研究从扁刺峨眉蔷薇75%甲醇提取物的醋酸乙酯萃取部位中共分离得到21 个化合物，其中黄酮类4 个，萜类7 个，酚酸类6 个，木质素类2 个，香豆素类1 个，其他类型1 个。所有化合物均首次从该植物中分离得到，其中化合物2、6、12、15、17、20 为首次从蔷薇属中分离得到。本研究主要目的是为了评价扁刺峨眉蔷薇中萜类及黄酮类化合物抑制酪氨酸酶活性的作用，因此选择化合物1～8、10～14、16、21 对B16F10 中酪氨酸酶的抑制活性进行评价，结果显示化合物1～3、5、13、14、16、21 在浓度40 μmol/L 时对酪氨酸酶活性有显著抑制作用，其中化合物5 活性最高；化合物4、6、7 在浓度40 μmol/L 时对B16F10 细胞存在一定的细胞毒性，可能会对人体皮肤有一定损伤，因此未做酪氨酸酶抑制活性评价。化合物1～3、5 为三萜类化合物。由此推测，三萜类型化合物可能是扁刺峨眉蔷薇中主要的美白功效成分。说明扁刺峨眉蔷薇中还未被发现的三萜类化合物可能同样具有潜在美白作用，有较高深入研究价值。

相较于化学药，中药具有安全性更高、作用更平缓、不良反应相对更小的优点，在化妆品制剂中更具有应用优势，早在两千多年前，我国对美白祛斑类中药就有钻研，如当归、白芍、辛夷、丹参、甘草、白茯苓等早就作为传统美白物质被广泛应用。已有研究表明，茯苓总三萜和茯苓新酸A 具有抗氧化活性、抑制蘑菇酪氨酸酶活性及对B16F10 细胞酪氨酸酶活性均有抑制作用[33]，松茸总三萜对B16F10 细胞虽无抑制作用，但可以通过减少黑色素合成和抑制酪氨酸酶活性途径达到美白效果[34]，同时，有研究表明，刺梨RosaroxburghiiTratt.中多糖、黄酮和多酚3 种提取物均能抑制B16F10 酪氨酸酶活性，且黄酮类化合物抑制活性最佳[6]，扁刺峨眉蔷薇作为具有药食同源特性的植物，果实味甘，可食用，无不良反应，因此，在作为美白化妆品原料开发发面可能具有很高的潜力。本研究首次研究了扁刺峨眉蔷薇提取物的化学成分，并证实了其化合物的酪氨酸酶抑制活性，实验结果表明，扁刺峨眉蔷薇中含有大量的黄酮类、三萜类及酚酸类化合物，且其中三萜类化合物具有显著的酪氨酸酶抑制活性，证明了扁刺峨眉蔷薇具有潜在的美白功效，为其应用于化妆品开发提供了科学依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突