麻杏石甘汤对肺损伤大鼠肠道菌群及代谢产物影响的关联分析研究

赵珈瑶 白辰

大量的临床及文献均证实多种肺组织炎症损伤的发生、发展及预后与以胃肠为代表的消化系统具有密切关系,这其中包括肠道内的菌群。“风温外薄,肺胃内应”,肠道菌群在呼吸系统感染的过程中发挥了重要的作用。麻杏石甘汤首见于张仲景的《伤寒论》,治疗肺炎肺损伤确有疗效,而麻杏石甘汤通过肠道菌群治疗肺炎的机制尚不明确。本研究采用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)雾化吸入法制备大鼠急性肺损伤模型,通过高通量测序和代谢组学检测动物肠内容物,分析麻杏石甘汤干预后动物肠道菌群和代谢产物的变化,并对结果进行关联分析,以期探讨麻杏石甘汤治疗肺炎时对肠道菌群结构和代谢功能的分子基础和机制,中医以“麻杏石甘汤”为代表的相关方证理论提供实验科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物

健康SPF雄性SD大鼠50只,3周龄,体质量(110±10)g,由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供,许可证号SCXK(京)2016-0002,饲养于北京中医药大学标准动物房。伦理批准号:bucm-4-2021090306-3125。

1.2 主要试剂

造模药物:LPS(Sigma,057M4013V)。

中药复方麻杏石甘汤参考《方剂学》(人民卫生出版社),选用麻黄9 g、杏仁9 g、炙甘草6 g、生石膏18 g,制备麻杏石甘汤配方颗粒。配方颗粒够自北京中医药大学东方医院,由北京康仁堂药业有限公司生产。按人与大鼠0.018的等效剂量进行换算。

对照药物:莫西沙星(拜耳,J20150015)、醋酸泼尼松(天津天药药业股份有限公司,CP190611a)。

检测试剂盒:γ干扰素(interferon-γ,INF-γ),购自美国Immunoway公司,货号KE1431。丙二醛(malondialdehyde,MDA),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD),一氧化氮(nitric oxide,NO),均购自南京建成生物工程研究所,货号分别为A003-1、A001-3、A013-2-1。

1.3 分组与造模

动物随机分为5组,正常组、模型组、中药组、抗生素组、激素组,每组10只。适应性饲养3天后,模型组、中药组、抗生素组和激素组予0.5 mg/mL的LPS雾化,每天30分钟,连续3天。中药组、激素组和抗生素组于第一次雾化结束后当天分别予麻杏石甘汤和莫西沙星、醋酸泼尼松口服治疗,每天灌胃1次,连续3天。按人与大鼠0.018的等效剂量进行换算。

1.4 取材

末次治疗结束后,禁食不禁水12小时,然后予10%水合氯醛麻醉处死后,腹主动脉取血,取部分肺组织福尔马林浸泡后制备苏木精—伊红(hematoxylin-eosin,HE),染色,取肠内容物、部分肺组织于液氮速冻后,保存于-80℃冰箱备用。取肝、脾、肾(单侧)、胸腺称重。

1.5 检测及统计学处理

1.5.1 病理染色 取福尔马林浸泡的肺组织样本,修块后进行石蜡包埋,切白片后,进行HE染色。

1.5.2 肠道内容物16S 使用宏基因组脱氧核糖核酸(DeoxyriboNucleic Acid,DNA)提取试剂盒提取肠内容物中的总DNA;以细菌16S 核糖体核糖核酸(Ribosomal RNA,rRNA)基因的V3～V4可变区序列为靶标,以带有标签(barcode)序列的338F-806R为引物,进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR),获取PCR产物;PCR产物经过定量及文库构建后,利用Illumina MiSeq PE300平台进行高通量测序,获取细菌16S rRNA基因的V3～V4可变区碱基序列信息;利用QIIME 2.0软件包,对测序片段进行OU(分类学操作单元)聚类,OTU代表序列与Silva数据库进行比对分析,获取OTU对应的分类单元(包括门纲目科属种)及其相应的丰度信息;计算Chao1、ACE、Shannon和Simpson等度量指数,评估样品中细菌菌群的丰富度和均匀度;综合应用PCA分析、Metastats分析、LEfSe分析、ANOVA方差分析等方法寻找各组中的特征菌。

1.5.3 肠道内容物代谢产物 提取肠内容物中的代谢物后,进行质谱检测,通过Proteowizard软件(v3.0.8789)将获得的原始数据转换成mzXML格式、利用R(v3.1.3)的XCMS程序包进行峰识别、峰过滤、峰对齐,得到包括质核比和保留时间及峰面积等信息的数据矩阵;进而得到正负离子模式下的前体分子,导出数据至Excel进行后续分析。对样本数据进行QC质量控制以及批次校正,数据标准化处理后,统计代谢物含量,进行无监督的降维分析,并对特征代谢进行筛选及相关分析,最后完成特征代谢物的通路分析。

1.5.4 肠道内容物16S与代谢组关联 从Deseq2分析结果中提取P<0.05的细菌;提取组内细菌丰度;提取差异显著细菌组内丰度。从T检验分析结果中提取P<0.05的代谢物;提取组内代谢物丰度;提取差异显著代谢物组内丰度。将差异显著代谢物组内丰度和差异显著细菌组内丰度整理到关联分析文件夹中;用R corr.test函数组内差异显著代谢物与组内差异显著细菌的相关性,并进行假设检验得到P值;用R pheatmap将相关性分析结果进行可视化。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织病理比较

由图1可见,经LPS雾化干预后,动物肺组织出现大面积的肺支气管壁增厚和肺间质的炎症性物质渗出。经药物干预后,肺组织炎症呈现不同程度的吸收。其中抗生素组肺间质、支气管壁吸收情况较好,激素组和中药组呈现相近程度的炎症吸收效果。

注:A为正常组;B为模型组;C为中药阻;D为抗生素组;E为激素组。

2.2 各组大鼠肠道菌群比较

经对样本OTU的分析,如图2所示,三组共有物种581个,在门水平上,模型组和中药组种Firmicutes、WPS_2两种菌的水平,与正常组有显著上升;在科、属水平中,与模型组和中药组相比,正常组中呈优势菌的有Bacteroidaceae、Prevotellaceae、Odoribacteraceae和Verrucomicrobiaceae;与正常组和中药组相比,模型组中呈优势菌的有Porphyromonadaceae、Rikenellaceae和Turicibateraceae;与正常组和模型组相比,中药组中呈优势菌的有Staphylococcaceae、Gemellaceae、Lactobacillaceae、Streptococcaceae、Erysipelotrichaceae和Comamonadaceae。

注:A为门分类水平的热图;B为各个分组在门水平上的相对分布情况柱形图(相对丰度前20的物种);C为LEfSe分析LDA柱形图;D为LEfSe分析cladogram图;E为共有或特有物种韦恩图展示(当分组数目小于等于5时)。NC为正常组;MC为模型组;TC为中药组。

2.3 各组大鼠肠道代谢物

如图3所示,应用单变量与机器学习分析,发现模型动物经中药治疗干预后,含量显著下调的有磷酸酯、焦谷氨酸、β-酪氨酸、十二烷酸、1-甲基组氨酸、茶碱,含量显著上调的有芥酸、琥珀酸半醛、二十碳二烯酸、山梨醇、17a雌二醇、4,5-二氢乳清酸、龙胆酸、D-甘露糖和脱氢表雄酮等。

注:A为代谢物差异箱式图;B为随机森林中最重要的15种代谢物;C为SVM中最重要的15种代谢物;D为SVM ROC曲线。NC为正常组;MC为模型组;TC为中药组。

2.4 肠道菌群—代谢产物关联分析

如图4所示,在属水平下,经麻杏石甘汤干预后,肠道菌群中的Veilonella、Aerococcus等菌与磷酸氨基甲酸、琥珀酸半醛、维生素D2、棕榈酸、马来酸、磷酸、1-甲基组氨酸、3-脱氢莽草酸、二十碳二烯酸等呈正相关,Alistipes、Parabacteroides等菌与维生素D2、马来酸、磷酸等呈负相关。

注:由上至下依次为与正常组相比的模型组、与模型组相比的治疗组、与正常组相比的治疗组。

3 讨论

麻杏石甘汤辛凉宣肺,清热平喘。纵观全方,石膏辛寒清热,同归肺胃两经;苦杏仁止咳平喘,又兼润肠通便;甘草本为清热解毒之品,火炙之后,功擅补脾和胃,三药皆与阳明有关。伤寒与明清温病,虽一偏重扶阳气,一偏重存津液,但顾护中焦气血生化之源,仍为临床不可忽视的治疗大法。麻杏石甘汤全方在清肺热的同时,无处不顾护中焦脾胃,即固其本,又既病防变,有防止肺热顺传阳明的作用。既往研究,多有“肺病看肺”的特点,即肺炎的研究只聚焦于肺组织和外周血的炎症反应,少有对于消化系统的研究。菌群作为消化系统的一部分,近年来研究热度渐增。口服给药,多经过药物的吸收、分布、代谢及排泄过程,即ADME过程。中药复方在口服后,也要经由消化系统,借助血液循环,到达病灶的过程,因此肠道菌群是研究中药复方药理机制不可忽视的部分。中医理论认为的肺与大肠密切相关,与现代医学理论中的“肠—肺轴”具有相似的内涵,课题组前期对“肠—肺轴”相关研究进行了综述,发现肠道菌群是多种呼吸系统疾病治疗的重要着力点[1]。

目前,已有学者开始探索麻杏石甘汤对肠道菌群的影响。如通过临床研究,发现在现代医学常规治疗基础上应用麻杏石甘汤加减治疗小儿支气管哮喘急性发作期,可以改善患儿肠道菌群[2];而应用麻杏石甘汤灌肠,可以更好地调整肺炎喘嗽患儿的肠道菌群结构[3]。在机制探索方面,已有学者明确麻杏石甘汤可以改善流感病毒感染小鼠模型的肠道菌群结构[4-5]。课题组前期对于麻杏石甘汤在肺损伤治疗中的作用也进行深入的了探讨,我们首先从麻杏石甘汤中鉴定出97种成分[6],这些成分与麻杏石甘汤的共煎过程有关。然后我们利用网络药理学分析了这些成分的作用机制,并结合肺组织转录组进行了验证。其次,我们发现麻杏石甘汤可能通过调节Toll样受体信号通路预防细胞因子风暴和缓解肺损伤。麻杏石甘汤临床治疗病毒性肺炎疗效明确[7],如SARS、COVID-19、社区获得性肺炎的临床指南均指出,在临床治疗期时以麻杏石甘汤加减治疗。且治疗COVID-19的“三方三药”中,除血必净注射液外,均含有麻杏石甘汤。因此,我们也用甲型H1N1流感病毒株A/PR/8/34感染小鼠模型,探讨了麻杏石甘汤治疗病毒性肺炎的作用机制,发现其可能通过抑制肺组织糖酵解过程以及糖酵解驱动的促炎巨噬细胞活化,从而抑制肺组织过度炎症反应,减轻病毒性肺炎肺损伤[8]。但是目前的研究,均尚未涉及到麻杏石甘汤如何通过肠道菌群发挥治疗效果。由本研究的实验结果可知,麻杏石甘汤对肺组织的炎症损伤确有疗效,其机制与通过肠道菌群,调节肠道代谢产物具有一定的相关性。

在肠道菌群与16S关联分析的结果中,可以发现在“属”层面(Genus),韦氏菌属(Veillonella)与棕榈油酸(Palmitoleic acid)、马来酸(Maleic acid)、磷酸(Phosphoglycolic acid)、1-甲基组氨酸(1-Methylhistidine)和3-脱氢莽草酸(3-Dehydroshikimic acid)均存在显著的正相关性,而肠道菌群中韦氏菌属的丰度在治疗后呈现增加的趋势,即麻杏石甘汤可以通过增加韦氏菌属的丰度,增加这些代谢产物在肠道内的含量。韦氏菌属(Veillonella)是革兰氏阴性厌氧性微小球菌,直径0.3～0.5 μm,会积极发酵发酵丙酮酸、乳酸、苹果酸、富马酸和草酰乙酸。该均属在动物和人的自然腔道中大量存在,是分布于口腔、咽部、呼吸道、消化道的常见菌群。近年来,人们发现韦氏菌属对人类感染和免疫发育过程具有重要影响。有研究支出,Veillonella parvula可能在儿童早期免疫系统发育中起到保护作用和帮助作用。对婴儿的流行病学研究表明,Veillonella parvula的存在与哮喘、毛细支气管炎和自闭症呈负相关。在有哮喘风险的儿童中,肠道中相对丰富的细菌属Veillonella的相对丰度显著降低。而韦氏菌代谢的产物,均有一定的调节人体免疫状态、恢复炎症的作用。如棕榈油酸可以调节身体代谢,影响炎症标记物和PPAR代谢通路,起到治疗炎症的作用[9];马来酸可以通过下调ROS诱导的核因子-κB以及炎症相关细胞因子(白细胞介素-6、环氧合酶-2和肿瘤坏死因子-α)的表达,并抑制丝裂原活化蛋白激酶/活化蛋白1信号通路,降低基质金属蛋白酶的表达,从而达到治疗炎症的目的[10];磷酸及其多种复合成分均具有一定抗炎作用,如磷酸钠、磷酸奥司他韦等。

综述所述,本研究发现麻杏石甘汤可能是通过增加韦氏菌属丰度,进一步调整肠道菌群内棕榈油酸、马来酸、磷酸等代谢产物,进而发挥治疗肺损伤的作用。但是,本研究尚缺乏代谢产物针对肺组织代谢过程影响,未来将继续深入探索。总之,在中医整体观指导下,深入探索麻杏石甘汤等经典复方治疗呼吸系统疾病的科学内涵,即增加了中医药的解释能力与对话能力,也为相关疾病的治疗和药物研发提供了新的靶点。