柴贝止痫汤对癫痫—抑郁共病模型大鼠大脑皮层及海马中5-HTT、5-HT1AR、5-HT2AR和DA2R表达的影响

王越 刘金民 王凯悦 徐薇薇

癫痫是由大脑神经元异常放电引起的突然、短暂、反复出现的慢性发作性脑功能失调综合征,是神经科仅次于脑血管病的第二大顽症[1-2]。抑郁症以显著而持久的心境低落为主要临床特征,具有患病率高、自杀率高等特点[3-5]。抑郁障碍是癫痫最常见的共患精神障碍[6]。单胺机制是癫痫—抑郁共病的重要机制,该机制认为中枢神经系统5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)和多巴胺(dopamine,DA)等单胺递质含量减少及受体功能异常是癫痫—抑郁共病的重要机制[6]。此外,抑郁症存在的DA功能低下及DA2受体(DA2R)的减低[7]。癫痫—抑郁共病机制及药物研究已经成目前癫痫领域的难点及热点问题。

笔者团队在《伤寒论》柴胡加龙骨牡蛎汤、《医学心悟》定痫丸基础上,加减化裁为柴贝止痫汤,应用于颞叶癫痫及难治性癫痫的临床治疗。临床研究表明,该复方可在减少癫痫包括颞叶癫痫及难治性癫痫发作的同时,明显改善患者抑郁情绪[8-9]。柴贝止痫汤主要由柴胡、天麻、法半夏、浙贝母、石菖蒲、牡蛎、地龙七味中药组成。本研究旨在通过观察柴贝止痫汤对癫痫—抑郁共病模型抑郁行为及大脑皮层及海马5-HT转运体(5-HT transporte,5-HTT)、5-HT受体(5-HT1AR和5-HT2AR)和DA2R的表达影响,分析柴贝止痫汤治疗癫痫—抑郁共病的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取6～8周龄SPF级雄性SD大鼠60只,体质量180～240 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物使用许可证号:SYXK(津)2019-002。动物实验伦理批件号:IRM-DWLL-2002229。

1.2 实验药物

柴贝止痫汤(柴胡12 g、天麻15 g、浙贝母9 g、法半夏9 g、石菖蒲9 g、牡蛎30 g、地龙6 g)采用水煮醇提法制作浓缩,含生药量2.14 g/mL。氢溴酸西肽普兰片(西安杨森制药有限公司,20 mg/片,批号:2676415)。东茛菪碱(遂成药业股份有限公司,0.3 mg/支,批号:1601211)。地西泮(金耀药业有限公司,10 mg/支,批号:2206211)。

1.3 实验试剂与仪器

摇床(Kylin-Bell,TS-200),涡旋混合器(Kylin-Bell,QL-866),移液枪(Dragon,YE193AL0293070),实时PCR仪器(Bio-Rad,CFX96),电泳槽(北京君意,JY-ZY5),PVDF膜(Millipore Cat,ISEQ00010),台式高速冷冻型微量离心(SCILOGEX,CF1524R),酶标仪(BioTek Instruments,800TS),荧光化学发光凝胶成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司,3300 Mini)。抗体5-HTT(Abways,CY8138),5-HT1AR(Alomone,ALO-ASR-021-0.2),5-HT2AR(Bioss,bs-1056R),DA2R(PTG,55084-1-AP),Goat Anti Rabbit IgG/HRP(Abcam,ab205718),Goat Anti Mouse IgG/HRP(Abcam,ab205719),5-HT、DA Elisa试剂盒(上海信裕生物科技有限公司),TRIzon RNA提取试剂盒(Engreen公司),反转录试剂盒(全式金,AU341-02),Taq试剂盒(Takara,Japan)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 将60只大鼠随机分为正常组、模型组、西药组和柴贝止痫汤低、中、高剂量组,每组10只。

1.4.2 癫痫—抑郁共病模型造模 匹罗卡品—氯化锂建立大鼠癫痫持续状态后慢性颞叶癫痫动物模型:造模前20小时,腹腔注射氯化锂(127 mg/kg),匹罗卡品注射前半小时腹腔注射东莨菪碱(1 mg/kg)。腹腔注射匹罗卡品(30 mg/kg)诱发癫痫持续状态。大鼠癫痫发作按照Racine分级进行评价,出现Ⅳ级和/或Ⅴ级发作并持续30分钟(癫痫持续状态),则认为建模成功。不成功者追加一次匹罗卡品(30 mg/kg),连续追加两次不成功,则认为建模失败。癫痫持续状态持续60分钟后,腹腔注射地西泮(10 mg/kg)终止发作。大鼠持续视频监测30天,出现自发性发作,认为癫痫大鼠进入慢性期。

慢性不可预知温和应激刺激制作抑郁模型:造模时间28天。每天从日间、夜间中各挑选一种刺激对大鼠进行处理,顺序随机。日间刺激:在强迫游泳桶中加入4℃冰水,每桶1只大鼠,游泳5分钟;大鼠单独接受足底电击,2 mA,间隔10秒,电击4秒,重复2次;摇晃鼠笼10分钟(强度以大鼠不能站稳为准),方向不定;大鼠放于束缚罐中束缚2小时;单笼隔离所有大鼠,孤独3小时;胡椒粉撒入鼠笼,气味刺激;将所有大鼠放入狭窄的桶中,拥挤3小时。夜间刺激:持续电灯光照;在鼠笼垫料上喷洒水,潮湿处理;将鼠笼倾斜45°;彩灯置于鼠笼上方,持续闪烁;禁水禁食12小时。每周测量一次体重,以观察抑郁动物体重变化。

1.4.3 给药方法 西药组:造模成功后予西酞普兰10 mg/(kg·d),每日分两次灌胃给药。柴贝止痫汤低、中、高剂量组:造模成功后分别予柴贝止痫汤低[2.5 g/(kg·d)]、中[4.5 g/(kg·d)]、高[8.5 g/(kg·d)]三个剂量每日分两次灌胃给药。正常组:不造模,正常饲养,每日分两次灌胃等量生理盐水。模型组:造模成功后正常饲养,每日分两次灌胃等量生理盐水。各组均连续给药14天。

1.5 抑郁行为学监测

1.5.1 糖水偏好实验 依据Moller Marisa等[10]报道的方法,观察并记录12小时内各组大鼠摄取的蔗糖溶液体积。糖水饮用量=测定前蔗糖水量-测定后的蔗糖水量。

1.5.2 强迫游泳实验 将大鼠置于盛有水的敞口圆柱形水桶内。水桶高50 cm,直径20 cm,水深30 cm,水温(24±2)℃,任其自由游泳,通过摄像系统观察6分钟内大鼠的不动状态持续时间,即大鼠四肢蜷缩不动漂浮水面,仅鼻孔露出水面呼吸,无其他行为的持续时间。

1.6 取材

给药结束,完成行为学监测后1天,对大鼠断头取脑,冰上分离海马组织,-80℃保存。

1.7 指标检测

1.7.1 酶联免疫吸附法(ELISA)检测5-HT、DA含量 按照试剂盒说明书步骤测定OD值,根据已知浓度的标准物的OD值绘制标准曲线,并根据标曲计算得到各组大鼠大脑皮层及海马组织中5-HT、DA。

1.7.2 实时定量PCR检测5-HTT、5-HT1AR、5-HT2AR和DA2R的mRNA转录水平 使用TRIzon RNA提取试剂盒提取大脑皮层和海马区mRNA。随后,使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。在42～65℃合成第一链cDNA。引物设计:5-HT1AR-F:CTAGCATCTCCGACGTACC,5-HT1AR-R:AAAGCGCCGAAAGTGGAGTA;5-HTT-F:GATGTGTCAGAGGTGGCCAA,5-HTT-R:GGTAGGGATGCAGATGACGG;5-HT2AR-F:AACCCCATTCACCATAGCCG,5-HT2AR-R:TCTTTGCAGATGACGGCCAT; DA2R-F:AACTTACATCCGGCCTGCTC,DA2R-R:GGAAGCGCG-ATGAGGGATAA;β-actin-F:TCAACACCCCAGCC-ATGTAC,β-actin-R:AATGCCTGGGTACATGGTGG。使用Taq试剂盒,运用实时PCR仪器检测基因表达水平。

1.7.3 免疫印迹试验检测5-HTT、5-HT1AR、5-HT2AR和DA2R蛋白表达情况 每组选择5只大鼠。依次配置12%的分离胶和5%的浓缩胶。点样孔中加入10 μL蛋白样品。设置电泳仪参数为80 V 40分钟,130 V 1小时。将分离凝胶中的蛋白在22 V 22分钟的条件下转移至PVDF膜。转膜结束后,5%脱脂牛奶室温封闭30分钟。一抗溶液在4℃条件下孵育12小时。1×TBST洗3次,每次10分钟。二抗溶液在室温条件下孵育1小时。孵育完用1×TBST洗3次,每次10分钟。在膜上滴加化学显色液,使用凝胶成像仪观察蛋白表达情况。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠体质量变化

给药前(第0天)、给药第8天、给药结束后(第15天),模型组体质量均低于正常组(P<0.05)。给药第8天、给药结束后(第15天),西药组和柴贝止痫汤中、高剂量组大鼠的体质量均高于模型组大鼠(P<0.05)。见表1。

表1 各组癫痫—抑郁共病模型大鼠体质量比较

2.2 各组大鼠抑郁行为观察

2.2.1 糖水偏好实验 药物干预后,模型组较正常组大鼠糖水偏好度较显著减少(P<0.01),西药组(P<0.05)和柴贝止痫汤低(P<0.05)、中(P<0.01)、高剂量组(P<0.01)较模型组显著增加。见表2。

表2 各组癫痫—抑郁共病模型大鼠糖水偏好测试及强迫游泳测试情况比较

2.2.2 强迫游泳实验 药物干预后,模型组较正常组大鼠不动时间显著增加(P<0.01),西药组和柴贝止痫汤低、中、高剂量组大鼠的不动时间较模型组显著减少(P<0.01)。见表2。

2.3 各组大鼠大脑皮层和海马5-HT及DA表达情况

药物干预后,与正常组比较,模型组大鼠大脑皮层及海马5-HT、DA含量均显著减少(P<0.01)。与模型组比较,西药组大脑皮层和海马区的5-HT显著升高(P<0.01),大脑皮层的DA显著升高(P<0.05),柴贝止痫汤中(P<0.05)、高剂量组(P<0.01)大鼠大脑皮层及海马中5-HT含量、皮层中DA含量升高;柴贝止痫汤高剂量组大鼠大脑海马中DA含量升高(P<0.05)。见表3。

表3 各组癫痫—抑郁共病模型大鼠皮层及海马5-HT及DA含量比较

2.4 各组大鼠大脑皮层和海马5-HTT、5-HT1AR、5-HT2AR和DA2R的mRNA表达情况

药物干预后,与正常组相比,模型组大鼠大脑皮层中5-HTT mRNA表达增加(P<0.05),海马中5-HTT mRNA表达减少(P<0.05),大脑皮层及海马中5HT1AR mRNA表达均减少(P<0.05),5HT2AR、DA2R mRNA表达无明显变化(P>0.05)。见表4。

表4 各组癫痫—抑郁共病模型大鼠大脑皮层和海马5-HTT、5-HT1AR、5-HT2AR和DA2R的mRNA表达情况比较值)

与模型组相比,柴贝止痫汤高剂量组大鼠大脑皮层中5-HTT mRNA表达显著降低(P<0.01),5-HT1AR mRNA表达显著升高(P<0.05);在大鼠海马中,柴贝止痫汤高剂量组的5-HTT mRNA(P<0.01)及5-HT1AR mRNA(P<0.05)表达显著升高;大脑皮层和海马中5-HT2AR和DA2R mRNA表达均无明显变化。见表4。

2.5 大鼠大脑皮层和海马5-HTT、5-HT1AR、5-HT2AR和DA2R蛋白表达的影响

各组大鼠5-HTT、5-HT1AR、5-HT2AR和DA2R蛋白表达的趋势与mRNA表达趋势基本一致。与正常组相比,在大鼠大脑皮层中,模型组5-HTT的蛋白表达增加(P<0.05),5-HT1AR的蛋白表达减少(P<0.05),5-HT2AR和DA2R的蛋白表达水平无明显变化;在海马中,模型组5-HTT和5-HT1AR的蛋白表达减少(P<0.05),5-HT2AR和DA2R的表达不变。见图1,表5。

图1 各组癫痫—抑郁共病模型大鼠大脑皮层和海马5-HTT、5-HT1AR、5-HT2AR和DA2R蛋白表达情况比较

表5 各组癫痫—抑郁共病模型大鼠大脑皮层和海马5-HTT、5-HT1AR、5-HT2AR和DA2R蛋白表达情况比较

与模型组相比,在大鼠大脑皮层中,柴贝止痫汤高剂量组5-HTT的蛋白表达减少(P<0.05),5-HT1AR的蛋白表达增加(P<0.05),5-HT2AR和DA2R的蛋白表达水平无明显变化;在海马中,柴贝止痫汤高剂量组5-HTT和5-HT1AR的蛋白表达增加(P<0.05),5-HT2AR和DA2R的表达不变。见图1,表5。

3 讨论

大量临床研究和基础研究表明,癫痫和抑郁具有共同的发病机制[11],其中以单胺机制研究最深入。有研究表明,柴胡皂苷A能改善抑郁小鼠悬尾实验不动时间,增加脑内单胺递质去甲肾上腺素、DA含量[12-13]。天麻乙醇提取物增加抑郁小鼠脑组织中海马区和纹状体区单胺递质5-HT、去甲肾上腺素、DA含量[14-17]。本研究表明,柴贝止痫汤可有效增加共病大鼠体重,改善抑郁行为学表现,增加大脑皮层及海马的5-HT、DA含量,同时调控5-HTT和5-HT2AR在大脑皮层和海马中的表达,从而实现对癫痫—抑郁共病的治疗。

5-HTT是一种跨膜转运蛋白,其功能是转运5-HT。5-HT被释放入突触间隙后,5-HTT结合突触间隙的5-HT并将其转运到突触前神经元细胞质内激活受体,随后5-HT与受体迅速分离,被5-HTT重新摄取进入突触前膜囊泡内。因此,5-HTT的表达量直接影响脑内对5-HT的利用效率[18]。本研究表明,与模型组相比,柴贝止痫汤抑制了大脑皮层中5-HTT的表达,但促进了海马中5-HTT的表达。据此可以猜测,在癫痫—抑郁共病大鼠脑中,柴贝止痫汤干预优先促进了5-HTT蛋白在海马区的表达,从而增加5-HT在海马区的转运效率,进而促进海马这类与情感调节有关的边缘系统中5-HT的快速循环利用,以第一时间缓解抑郁情绪。

5-HT受体有多种亚型,其中5-HT1AR、5-HT2AR与抑郁症的关系密切。5-HT1AR和5-HT2AR功能不平衡时,就会出现抑郁情绪[19]。5-HT1AR属于自身受体,对5-HT的释放起负反馈调节作用,多分布在与情感调节有关的边缘系统中,尤其是海马、额叶和中缝核[19]。本研究结果显示,大脑皮层和海马中5-HT1AR的表达同时升高,这表明当癫痫共病抑郁时,柴贝止痫汤干预会同时促进大脑皮层区域和海马区对5-HT的识别,以提高5-HT的利用效率,缓解抑郁情绪。同时,实验结果提示发现5-HT2AR的表达并未受到影响。这可能有两点原因:一是5-HT1AR和5-HT2AR两个5-HT受体蛋白具有功能互偿作用,当其中一种受体升高时,另一种受体蛋白不需要就可以增加对5-HT的识别灵敏度;二是柴贝止痫汤中的有效成分只能作用于5-HT1AR基因,而非5-HT2AR基因转录激活因子的启动子结合结构域,进而诱导5-HT1AR mRNA的表达水平升高和后续的蛋白表达增多。

综上所述,柴贝止痫汤可改善癫痫—抑郁共病模型大鼠的抑郁行为,这可能是通过调控大脑皮层和海马中5-HT、DA含量及5-HTT和5-HT1AR的表达而实现。临床中,柴贝止痫汤的添加治疗可为癫痫抑郁共病提供新思路、新方法。