清毒栓提取物对人子宫颈鳞癌细胞免疫逃逸的影响

李美 楼姣英

宫颈人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染的主要病机为湿毒浸淫、结聚于子门,金哲教授抓住毒邪结聚这一病机关键,以攻毒散结为治法,研制出宫颈外用中药清毒栓。前期课题研究发现清毒栓含药血清通过调控P53基因表达[1]、调控P53泛素化降解途径[2]、下调MDM2基因[3]、减少B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白表达、增多Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X,Bax)表达而使人子宫颈鳞癌细胞(SiHa细胞)凋亡[4]等分子生物学机制,达到抑制肿瘤的目的。本课题体内实验结果表明,清毒栓可以抑制荷瘤小鼠外周血中Treg细胞,从而逆转微环境中的免疫抑制[5]。为了验证Treg细胞的改变是否与Zeste同源物增强子2(enhancer of Zeste homolog 2,EZH2)调控的叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Forkhead boxP3,Foxp3)表达变化有关,在前期基础上,本实验以jurkat细胞为研究对象,观察清毒栓含药血清对jurkat细胞相关基因及蛋白的表达影响,进一步探索清毒栓提取物治疗宫颈HPV感染的免疫学机制,为该药临床应用提供更充足的实验学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞株

SPF级SD大鼠20只,体质量280～300 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司[京动许字(2000)第004号总049号]。人宫颈癌SiHa细胞、jurkat细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所。

1.2 实验药物

清毒栓(专利号:ZL201010109562.1),主要组成为紫草、莪术、黄柏等。本科研使用的试药由中国中医科学院中药研究所制作,通过特定工艺制作清毒栓药液,包括分别醇提紫草、油提莪术、水煎黄柏等。实验药物为中药饮片提取制成清毒栓药液,不是清毒栓提纯。消毒栓药液浓度相当于中药饮片4.2 g/mL,高温消毒后于4℃冰箱密封保存。饮片均购自北京同仁堂药店。

1.3 主要实验仪器

超净工作台(苏州集团安泰空气技术有限公司,SW-CJ-1FD);离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司,HI650);低速离心机(Eppendorf,5702R);PCR仪(东胜创新生物科技有限公司,EDC-810);实时荧光定量PCR仪(ABI,7500);Multiskan MK3酶标仪(MD,Spectramac M3);流式细胞仪(Beckmancoulter,CytoFLEX)等。

1.4 主要实验试剂

RNeasy MiniKit(Qiagen,74106)试剂盒;RNase-Free DNase Set(Qiagen,79254);cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems,4368813);实时荧光定量PCR系统(Applied Biosystems,Step One Plus Real-Time PCR);Foxp3(1∶2 000,novus,NB100-39002SS);甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体(GAPDH antibody)(1∶2 500,Abcam ab9485);含PMSF(南京沃宏,329-98-6)的裂解液(碧云天公司,P0013B);样品缓冲液(15 g SDS,15.6 mL 2 M Tris pH 6.8,57.5 g glycerol,16.6 mL b-mercaptoethanol);PVDF膜(Bio-Rad no.162-0177);Foxp3 antibody (1∶1 000,Affinity,BF0630);HRP二抗(1∶4 000;Dianova,Hamburg);ECL显影液(Bio-Rad,170-5060)。

1.5 含药血清制备

取SPF级雄性SD大鼠20只,随机分为空白组和药物组。分别用PBS磷酸盐缓冲液和中药(消毒栓药液)对两组大鼠进行灌胃,早晚各一次,每次灌胃剂量为10 mL/kg,连续灌胃3天。采血前12小时禁食,最后一次给药后1～2小时采集全部血液(摘眼球取血,无菌操作)。分离含药血清,于56℃水浴灭活30分钟,以0.22 μm滤器灭菌消毒,置于-20℃冰箱冻存备用。

1.6 细胞培养

SiHa细胞和jurkat细胞使用含有10% FBS的DMEM培养基在37℃,5% CO2条件下培养。视细胞生长情况用0.25%胰蛋白酶每周传代2次。当细胞稳定并进入对数生长期时开始用于实验。

1.7 SiHa细胞和jurkat细胞上清液的收集

分别取宫颈SiHa细胞和jurkat细胞以107个/mL种植于175 cm3的培养瓶,细胞培养至融合度达80%～90%,然后用适量大小的无菌试管收集细胞上清液,放置于高速离心机中,13 000 r/min离心20分钟,以去除细胞碎片和杂质;最后用10 mL无菌注射器吸取细胞上清液,并使用一次性针孔过滤器(0.22 μm)以去除上清液中可能含有的细菌。置于-80℃保存。于使用前1天将其转移至4℃冰箱解冻,解冻的细胞上清液尽量在1周内使用完。

1.8 免疫蛋白印迹法(Western Blot,WB)检测SiHa细胞上清液处理对jurkat细胞中Foxp3蛋白表达水平的影响

收获“1.6”步骤中培养的jurkat细胞以2.0×103个/孔,每孔200 μL细胞悬液种植于96孔板中,分为jurkat细胞上清液组与SiHa细胞上清液组,每组3个复孔。另设3个孔作为空白对照组,孔中均不含jurkat细胞。放置于细胞培养箱分别培养12小时、24小时、48小时后,弃去培养基,用PBS洗2遍,加入PMSF的裂解液提取蛋白,蛋白裂解液浓度利用Bradford法进行测量。10 μg组织裂解液与5×样品缓冲液混合后,将样品上样至10%的聚丙烯酰胺凝胶中,SDS-PAGE分离并转移至PVDF膜上。用含0.1%Tween的4%牛奶进行封闭后,加入Foxp3、GAPDH抗体,4℃孵育过夜。用含0.1% Tween的PBS溶液将膜洗3遍后,加入含0.1% Tween的4%牛奶以及HRP二抗在室温条件下孵育2小时,在膜上滴加ECL显影液并放入GelDoc成像系统进行拍照。实验重复3次,蛋白表达水平用内参蛋白GAPDH进行归一化处理。

1.9 WB法检测不同浓度含药血清对jurkat细胞中Foxp3蛋白表达水平的影响

使用SiHa上清液处理jurkat细胞48小时来构建Foxp3高表达的T细胞模型。经处理的细胞以2.0×103个/孔,每孔200 μL细胞悬液种植于96孔板中,分为空白血清组与含药血清组,每组设4个复孔,实验重复3次。空白血清组分别加入5%、10%、15%、20%空白血清,含药血清组加入5%、10%、15%、20%含药血清。采用WB法检测各组细胞中的Foxp3蛋白表达水平,用内参蛋白GAPDH进行归一化处理。

1.10 使用15%的含药血清进行jurkat细胞处理和机制探索

1.10.1 qRT-PCR法检测jurkat细胞Foxp3转录水平 使用SiHa上清液处理jurkat细胞48小时来构建Foxp3高表达的T细胞模型。实验分为4组:空白对照组(jurkat细胞上清液+15%空白血清)、jurkat细胞上清液含药血清组(jurkat细胞上清液+15%含药血清)、SiHa细胞上清液空白血清组(SiHa细胞上清液+15%空白血清)、SiHa细胞上清液含药血清组(SiHa细胞上清液+15%含药血清)。弃去培养基,用PBS洗2遍,根据RNeasy MiniKit试剂盒说明书提取RNA并对DNase进行消化。cDNA合成使用大容量cDNA反转录试剂盒。按照使用手册将预混SYBR Green I染料的样本用实时荧光定量PCR系统进行荧光定量PCR反应。反应条件:Real-time PCR循环参数设定:95℃ 3分钟,95℃ 30秒,62℃ 40秒,共40个循环。检测Foxp3和的mRNA水平以GAPDH为对照,采用2-ΔΔct方法计算测定不同样品中基因的相对表达量。Foxp3引物序列:正向引物:5’-CACTGCCCCTAGTCATGGTG-3’,反向引物:5’-GGTGCATGAAATGTGGCCTG-3’;GAPDH引物序列:正向引物:5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’,反向引物:5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。

1.10.2 WB法检测jurkat细胞Foxp3蛋白表达水平 实验分为4组,分组处理同“1.10.1”。采用WB法检测jurkat细胞Foxp3蛋白表达水平,用内参蛋白GAPDH进行归一化处理。实验重复3次,具体检测方法同上。

1.10.3 细胞流式检测Foxp3细胞百分比 实验分为4组,分组处理同“1.10.1”。取处于对数生长期,生长状态良好的细胞,消化后计数;每流式小管加入1×106个细胞;离心(2 000 r/min,2分钟,4℃)后以含0.5% BSA的PBS清洗2遍;每流式小管添加荧光一抗Foxp3-FITC,4℃孵育30分钟;离心(2 000 r/min×2分钟,4℃)后以含0.5% BSA的PBS清洗2遍;以含0.5% BSA的PBS 0.5 mL重悬后流式细胞仪检测分析。细胞凋亡率(%)=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%,每组设置4个复孔,实验重复3次。

1.11 统计学方法

2 结果

2.1 SiHa细胞上清液对jurkat细胞Foxp3蛋白表达水平的影响

与jurkat细胞上清液组和空白对照组相比,SiHa细胞上清液组细胞中Foxp3蛋白相对表达量增加(P<0.05),且处理48小时效果最为显著,故后续实验采取48小时处理时间。见图1,表1。

表1 处理48小时WB检测各组jurkat细胞Foxp3蛋白相对表达量比较

注:A为空白对照组;B为jurkat细胞上清液组;C为SiHa细胞上清液组。

2.2 不同浓度含药血清对jurkat细胞中Foxp3蛋白表达水平的影响

使用SiHa上清液处理jurkat细胞48小时来构建Foxp3高表达的T细胞模型后,分别以5%、10%、15%、20%含药血清处理及相应浓度的空白血清作为对照,发现细胞Foxp3蛋白表达下调,且在含药血清浓度为15%和20%时,Foxp3的蛋白表达量最低,且两者无明显差别,故后续实验采用15%血清浓度。见图2。

注:A为5%血清浓度;B为10%血清浓度;C为15%血清浓度;D为20%血清浓度。

2.3 15%含药血清对jurkat细胞Foxp3转录水平的影响

SiHa细胞上清液空白血清组与空白对照组相比,jurkat细胞Foxp3的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05);与空白对照组相比,jurkat细胞上清液含药血清组细胞Foxp3的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05);与SiHa细胞上清液空白血清组相比,SiHa细胞上清液含药血清组细胞Foxp3的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 15%含药血清条件下各组jurkat细胞Foxp3的mRNA表达情况

2.4 15%含药血清对jurkat细胞Foxp3蛋白表达水平的影响

SiHa细胞上清液空白血清组与空白对照组相比,jurkat细胞Foxp3蛋白相对表达量显著升高(P<0.05);与空白对照组相比,jurkat细胞上清液含药血清组细胞Foxp3蛋白相对表达量显著降低(P<0.05);与SiHa细胞上清液空白血清组相比,SiHa细胞上清液含药血清组细胞Foxp3蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)。见表3,图3。

表3 15%含药血清条件下各组jurkat细胞Foxp3蛋白表达情况

注:A为空白对照组;B为jurkat细胞上清液含药血清组;C为SiHa细胞上清液空白血清组;D为SiHa细胞上清液含药血清组。

2.5 15%含药血清对SiHa细胞比例的影响

细胞流式检测Foxp3阳性细胞占比30%,jurkat细胞上清液含药血清组Foxp3阳性细胞数较空白对照组显著下降(P<0.05),SiHa细胞上清液空白血清组Foxp3阳性细胞较空白对照组显著下降(P<0.05),SiHa细胞上清液含药血清组Foxp3阳性细胞较SiHa细胞上清液空白血清组显著下降(P<0.05),较jurkat细胞上清液含药血清组显著增加(P<0.05)。见图4,表4。

表4 15%含药血清对SiHa细胞比较的影响

图4 15%含药血清对Foxp3细胞比例的影响

3 讨论

HPV感染是最常见的生殖道病毒性感染。宫颈癌是最常见的HPV感染相关疾病[6],也是唯一被认为是人类肿瘤中可知病因的恶性肿瘤,在全球女性高发恶性肿瘤中位居第4,仅次于乳腺癌、乳腺癌和肺癌[7-8]。目前HPV疫苗接种为预防HPV病毒感染的有效途径,同时也表明宫颈癌将成为第一个通过注射、筛查、早期诊断和早期治疗来消除的恶性肿瘤[9]。一项统计研究表明,宫颈癌患者中,高危型HPV(high risk human papillomavirus,HR-HPV)亚型(HPV16、HPV18)感染率高达73.75%,显著高于癌前病变和宫颈炎患者,可见宫颈癌的发生与HR-HPV感染密切相关[10]。HPV主要通过感染皮肤和宫颈鳞状细胞的基底细胞产生损伤,其中大多数女性体内的HPV会被自身免疫系统清除,并不产生病变,而一部分女性体内的HPV会产生持续性感染。若不予以及时干预,HPV将以环状DNA方式自我复制,随着病情进展整合到宿主细胞DNA中,免疫系统对HPV病毒的入侵产生免疫逃逸,造成宿主细胞异常分化引发癌变。这提示机体免疫力,尤其是宫颈局部免疫微环境对HPV的清除至关重要[11]。

调节性T细胞(Treg细胞)是具有免疫应答负调节作用的T细胞,在免疫系统中发挥着“双刃剑”的作用:一方面维持免疫稳态,避免机体过度免疫发生自身免疫性疾病,另一方面Treg可促进肿瘤细胞发生免疫逃逸。本课题组前期动物实验结果表明,清毒栓可以抑制荷瘤小鼠外周血中Treg细胞[5]。Treg可通过分泌抑制性细胞因子如白介素-10、转化生长因子-β、白介素-35等抑制机体免疫应答[12]。宫颈癌模型小鼠外周血中白介素-10、转化生长因子-β显著升高,经清毒栓含药血清干预后,两种细胞因子显著降低。Foxp3是控制Treg发育和功能的关键转录因子之一,是Treg细胞系的主要调节因子,它的发现是Treg免疫生物学重要的进步,为人们进一步了解Treg功能和作用机制打开了一扇“门”[13]。实验表明,在体外或体内诱导初始T细胞表达Foxp3后可以出现Treg样的免疫抑制作用,表明Foxp3是介导免疫逃逸的关键因素[14]。因此,阐明Foxp3的分子靶点是透彻理解Treg细胞免疫抑制作用的必要条件之一。

为了验证Treg细胞的改变是否与Foxp3表达变化有关,实验选取jurkat T细胞株进行研究。jurkat T细胞属于急性T淋巴细胞白血病细胞系,由于jurkat细胞株悬浮生长的特点,培养方法简单,性质稳定,容易获得足够数量的细胞用于实验,保留了人周围血T淋巴细胞特性[15],常用于研究T细胞各种信号传导通路、细胞因子的变化以及相关受体变化。本实验采用Western Blot法检测Foxp3蛋白表达水平、qRT-PCR法检测Foxp3转录水平,发现SiHa上清液可以显著增加jurkat细胞中Foxp3含量,且处理48小时时最为显著。浓度15%和20%的含药血清能显著抑制jurkat细胞中Foxp3蛋白的表达。经15%浓度含药血清处理后,jurkat细胞中Foxp3蛋白相对表达量、mRNA相对表达量及Foxp3阳性细胞数显著下降显著下降(P<0.05),说明15%含药血清能显著抑制T细胞中Foxp3转录和蛋白表达,从而降低Foxp3阳性细胞数。

综上所述,Foxp3诱导的Treg细胞免疫抑制作用在宫颈癌的发生发展中发挥重要的作用,中药清毒栓通过降低Foxp3的表达以及减少Treg细胞数目,从而抑制宫颈SiHa细胞免疫逃逸的发生,有利于宫颈癌的防治。