干酪乳杆菌LK-1 的发酵特性及其在菠萝果汁中的应用

杨 莲，彭芍丹 ，马俊杰3，章程辉，吴 广4，黄晓兵，李积华，廖良坤

（1.海南大学食品科学与工程学院，海南海口 570228；2.中国热带农业科学院农产品加工研究所，农业农村部热带作物产品加工重点实验室，海南省果蔬贮藏与加工重点实验室，广东湛江 524001；3.云南农业大学热带作物学院，云南普洱 665000；4.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉 430070）

益生菌是指摄入一定数量后可对宿主产生有益作用的活性微生物，其已被普遍公认为有助于调节肠道菌群和维持肠道健康[1-2]。目前益生菌在乳制品、果蔬发酵及肉类发酵等方面均有较多的应用和研究。采用果蔬汁制备益生菌发酵产品，不仅为益生菌的生长繁殖提供所需的基本物质，还可通过发酵提高果蔬汁的品质，满足不同人群对营养健康的需求[3-4]。干酪乳杆菌是研究和应用较多的益生菌之一，其因益生特性而闻名，常用于食品发酵或辅助发酵以改善食品特性[5-6]。研究证实，采用干酪乳杆菌发酵果蔬汁可产生多种有益作用，如提高果蔬抗氧化能力和活性成分[7]、延长果蔬贮藏期[8]、增强果蔬生理功效以及改善果蔬风味等[9-10]，可有效改善和提高产品品质。

菠萝（Ananas comosus（L.）Merrill），又名凤梨，是我国主要的热带水果之一，其富含维生素C、碳水化合物、有机酸、酚类物质以及蛋白酶等营养和活性成分，具有促进脂肪代谢、抗炎、增强免疫力等多种生理功效[11-12]。目前，我国菠萝以鲜售为主，其加工产品多为罐头、果干、果酱等，产品形式单一，附加值低，高值功能性产品较缺乏，有必要进一步丰富菠萝产品品类，拓宽菠萝产业链条。菠萝果汁营养丰富，可为微生物生长繁殖及代谢提供所需营养物质，适合开发发酵果汁饮品。目前已有研究人员采用植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌以及酵母菌等作为发酵剂制备益生菌发酵菠萝果汁。李伊娜等[13]研究发现，干酪乳杆菌或植物乳杆菌单独发酵可获得品质较好的发酵菠萝浆。NGUYEN 等[14]采用嗜酸乳杆菌，植物乳杆菌以及乳酸双歧杆菌等乳酸菌发酵菠萝果汁，并获得品质较好的益生菌饮品。赵治巧等[15]采用酵母菌和植物乳杆菌发酵菠萝果实后获得营养丰富的菠萝酵素。就目前研究来看，已有较多的益生菌被应用于菠萝果汁发酵，但利用干酪乳杆菌发酵菠萝果汁的研究较少，尤其是系统性地探究干酪乳杆菌在菠萝果汁中的发酵条件。发酵条件对获得高活菌数和高品质的益生菌发酵饮品至关重要。

干酪乳杆菌LK-1（Lactobacillus caseiLK-1，L.caseiLK-1）是实验室前期从传统发酵泡菜中筛选出的优质菌株，其在火龙果果汁发酵中展现了优质的发酵性能[16]。为进一步探究L.caseiLK-1 在其他果蔬汁中的发酵能力，对L.caseiLK-1 的生长曲线、产酸、耐酸和耐糖等特性进行研究分析，并将其应用于菠萝果汁的发酵。通过单因素实验和响应面法确定L.caseiLK-1 在菠萝果汁中发酵的最佳工艺，并对在最佳工艺下获得的发酵菠萝果汁饮品进行感官评价，为L.caseiLK-1 在发酵食品中的进一步应用提供理论基础和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干酪乳杆菌LK-1（Lactobacilus caseiLK-1）从传统发酵泡菜中筛选分离得到，保藏于中国热带农业科学院农产品加工研究所实验室[16]；佳果源100%NFC 菠萝果汁 市购，其基本营养信息可见表1；MRS 肉汤培养基 广东环凯微生物科技有限公司；0.1 mol/L 氢氧化钠标准滴定溶液 山东惠普分化学科技有限公司；NaCl、葡萄糖 西陇科学股份有限公司；食用纯碱 湖南海联三一小苏打有限公司。

表1 NFC 菠萝果汁基本营养成分Table 1 NFC pineapple juice essential nutrients

M8 型紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；HJ-CJ-2D 型双人净化工作台 上海苏净实业有限公司；PHS-3C pH 计 上海仪电科学仪器股份有限公司；HG-50 全自动高压蒸汽灭菌锅 日本hirayama 公司；LRH-250A 生化培养箱 广东泰宏君科学仪器股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1L.caseiLK-1 的生长特性

1.2.1.1L.caseiLK-1 生长曲线测定 将甘油保藏的L.caseiLK-1 按1%（v/v）接种量接入MRS 肉汤培养基中，在37 ℃培养箱中静置培养24 h，在培养0～4 h 期间每隔1 h 取样，4～24 h 期间每隔2 h 取样，采用紫外分光光度计在600 nm 波长处测定其吸光值OD600nm。

1.2.1.2L.caseiLK-1 在酸性和高糖环境下的生长及耐性测定 将甘油保存的L.caseiLK-1 按1%（v/v）接种量接入MRS 肉汤培养基，在37 ℃培养箱中静置培养8 h 后获得活化的发酵液，按5%（v/v）接种量分别接种于不同pH（3、4、5、6、7）和添加了不同质量分数葡萄糖（0%、10%、20%、30%、40%）的MRS 肉汤培养基，置于37 ℃下培养24 h，每隔2 h取样测定OD600nm，并于第0、3、14、24 h 分别取样测定活菌数，按式（1）计算样品中菌株的存活率：

式中：N0表示第0 h 的活菌数，CFU/mL；Nt表示培养第t h 的活菌数，CFU/mL。

1.2.2L.caseiLK-1 产酸测定 将按1.2.1.2 活化的发酵液以5%（v/v）接种量接入MRS 肉汤培养基中，37 ℃静置培养48 h，每隔6 h 取样，测定其pH 和总酸含量。

1.2.3 菠萝果汁发酵工艺优化

1.2.3.1 单因素实验设计 以菠萝果汁初始 pH、发酵温度、接种量和发酵时间作为实验因素，考察其对发酵菠萝果汁中活菌数及总酸含量的影响。具体操作为：在接种量 1%、发酵温度和时间为 37 ℃ 和 24 h的条件下，考察菠萝果汁初始 pH（4.7、5.7、6.7、7.7）对发酵菠萝果汁中活菌数和总酸含量的影响；在菠萝果汁初始 pH 为 6.7、接种量 1%、发酵时间 24 h 条件下，考察发酵温度（26、32、37、42 ℃）对发酵菠萝果汁中活菌数和总酸的影响；在菠萝果汁初始 pH为6.7、发酵温度和时间为 37 ℃ 和 24 h 条件下，考察接种量（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）对发酵菠萝果汁中活菌数和总酸含量的影响；在初始 pH 为 6.7、发酵温度 37 ℃和接种量 1% 的条件下，考察发酵时间（0、6、12、24、36、48 h）对发酵菠萝果汁中活菌数和总酸含量的影响。实验中使用食用纯碱调节菠萝果汁 pH，并将其置于 90 ℃ 下水浴 10 min 进行灭菌，待冷却至室温后再接菌。

1.2.3.2 响应面试验设计 在单因素实验确定的因素水平下，对各实验因素进行响应面试验，以总酸含量为响应值，利用Design-expert 8.0.6 软件进行试验设计（表2）。

表2 菠萝果汁发酵工艺优化的试验因素与水平Table 2 Factors and levels for the optimization of the pineapple juice fermentation process

1.2.4 感官评价 由10 个经过感官培训的学生和老师（男:女=1:1）组成感官评价小组，对常温下的NFC菠萝果汁，发酵前菠萝果汁（pH 调至6.8，并在90 ℃下水浴10 min），发酵后菠萝果汁进行评分，去掉最高和最低分后取平均值作为最终评分结果[17]，感官评定标准见表3。

表3 感官评定标准Table 3 Sensory evaluation standards

1.2.5 指标测定 活菌数的测定参照GB 4789.35-2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》[18]；总酸的测定参照GB/T 12456-2021《食品中总酸的测定》[19]，以乳酸计；pH 采用pH 计测定。

1.3 数据处理

每个实验均重复3 次，实验数据经Excel 2010初步分析整理后，采用Origin Pro 8.0 对数据进行分析和作图；采用Design-Expert 8.0.6 软件对响应面试验设计结果进行分析和作图。实验数据采用单因素方差分析，P＜0.05 表示统计学差异显著，P＞0.05 表示统计学差异不显著。

2 结果与分析

2.1 L.casei LK-1 的生长特性

2.1.1 生长曲线 由图1 可知，0～3 h 为L.caseiLK-1的延滞期，3～8 h 为对数生长期，8 h 后进入稳定期。L.caseiLK-1 仅需5 h 左右即可从对数生长期进入稳定期，表明菌株生长繁殖速度较快。快速的生长速度是工业化菌株的要求之一[20]，本研究菌株L.caseiLK-1 具备应用于工业生产的潜力。由于发酵8 h 处于L.caseiLK-1 的对数生长末期和稳定期初期，不仅具有高活菌数，而且菌株生长繁殖能力较强，因此选择发酵8 h 作为该菌株的最佳接种时间。

图1 L.casei LK-1 的生长曲线Fig.1 Growth curve of L.casei LK-1

2.1.2 在酸性环境下的生长及耐性 大多果疏汁偏酸性，且乳酸菌在生长繁殖过程中会产生大量的有机酸导致pH 的持续降低[21]，用于果蔬发酵的菌株需要在酸性环境下具备较好的生长繁殖能力和耐受性。同时，优良益生菌也需具备良好的酸耐受性，才能在胃肠道运输期间保有足够的活菌数[22]，确保有效地发挥其益生功效。L.caseiLK-1 在酸性条件下生长和耐受情况如图2 和图3 所示，随pH 的上升，L.caseiLK-1 的生长繁殖能力逐渐增强。在pH5～7 环境下，L.caseiLK-1 能够保持良好的生长繁殖，当pH≤4 时，菌株的生长繁殖被抑制甚至造成菌株的死亡，表明该菌株更适于弱酸性至中性环境下生长。与王帅静等[20]从西藏牦牛粪和乳源分离筛选出的乳酸菌在酸性环境的生长状况一致，均表现出低pH 环境下的弱生长能力，可能是由于低pH 环境引起菌株细胞膜的电荷变化，进而影响细胞膜对营养物质的吸收代谢以及酶活性[23]，导致菌株的生长繁殖受到抑制。在pH3 环境下能否存活是衡量菌株酸耐受性的标准之一[24]，相对于0 h（7.65±0.05 lg CFU/mL ），L.caseiLK-1 暴露在pH3 环境下3 h 时具有较高的活菌数，为7.53±0.02 lg CFU/mL，对应的存活率为76%，与徐小轻[25]研究的干酪乳杆菌NA-2 在pH2～4 条件下存活率相近，表明L.caseiLK-1 在短时间内具有较好的酸耐受性。干酪乳杆菌对酸性环境的耐受性，可能与其相关应激蛋白的大量表达有关[26]。

图2 L.casei LK-1 在不同pH 条件下的生长曲线Fig.2 Growth curve of L.casei LK-1 in different pH conditions

图3 L.casei LK-1 在不同pH 条件下的活菌数Fig.3 Viable cell counts of L.casei LK-1 in different pH conditions

2.1.3 在高糖环境下的生长及耐性 由图4 和图5 可知，随葡萄糖质量分数的增大，OD600nm和活菌数逐渐降低，说明L.caseiLK-1 受到的抑制作用逐渐增强，对比焦媛媛等[27]研究也有一致的结果。在葡萄糖质量分数为10%环境下培养24 h 后活菌数可达8.72±0.02 lg CFU/mL，而对照组（0%）为8.79±0.05 lg CFU/mL，表明糖添加量在10%以下时，对L.caseiLK-1 的生长繁殖影响较小。当葡萄糖质量分数≥20%时，对菌株的生长繁殖抑制作用较强。当葡萄糖质量分数为40%时，相对于0 h（7.67±0.03 lg CFU/mL），培养3、14 和24 h 后可维持较高的活菌数，分别为7.52±0.03、7.44±0.01 和7.28±0.13 lg CFU/mL，对应的存活率分别为71%、59%、41%，表明L.caseiLK-1 可在高糖环境中长时间存活，展现了较强的耐糖能力。综上结果，L.caseiLK-1 在一定的糖浓度下可保持较好的生长繁殖能力，并在高糖环境下具有良好的耐受性，具备用于较高糖果汁发酵的潜力。

图4 L.casei LK-1 在不同质量分数葡萄糖条件下的生长曲线Fig.4 Growth curve of L.casei LK-1 under different mass fractions of glucose

图5 L.casei LK-1 在不同质量分数葡萄糖条件下的活菌数Fig.5 Viable cell counts of L.casei LK-1 under different mass fractions of glucose

2.2 L.casei LK-1 的产酸特性

菌株的产酸能力是其作为发酵剂的重要指标[28-29]。由图6 看出，在培养0～12 h 期间，pH 快速下降，总酸含量迅速增加，该时期对应于L.caseiLK-1 的对数生长期，菌株快速的繁殖加快了对基质中碳水化合物的利用和代谢，产生大量的有机酸，从而导致pH 的快速下降和总酸的迅速升高。在培养12 h后，pH 先缓慢降低后趋于稳定，总酸先缓慢增加后趋于稳定，pH 最低为4.28，总酸含量最高可达9.46±0.12 g/kg，相对于发酵前（总酸含量4.11±0.11 g/kg），总酸产量为5.35 g/kg。结果表明，L.caseiLK-1 的产酸速度较快，具备较好的产酸能力。

图6 L.casei LK-1 在MRS 培养基中的产酸曲线Fig.6 Acid-producing curve of L.casei LK-1 in MRS medium

2.3 菠萝果汁发酵工艺优化

2.3.1 菠萝果汁初始pH 对活菌数和总酸的影响pH 会影响菌株在食品中的生长繁殖和代谢[30]。总酸含量是衡量发酵程度的重要指标，其高低可反映发酵菌株的产酸情况，且会直接影响产品的感官品质和保质期[31]。如图7 所示，菠萝果汁初始pH 在4.7～7.7范围内，发酵后果汁的总酸含量变化不显著（P＞0.05）。菠萝果汁的初始pH 越大，其发酵前的总酸含量则越少，当发酵24 h 后，总酸含量无显著性差异，表明随着pH 的增大，L.caseiLK-1 的产酸量逐渐增加。同时，活菌数随初始pH 的增大也逐渐增加。推测可能是pH 过低时，导致细胞膜生物功能发生改变和胞内酶活性降低，影响了菌株的代谢以及胞内外物质的进出，使得菌株的生长繁殖和产酸减缓。由图7 可知，菠萝果汁初始pH 为5.7～7.7 时，较适宜于发酵菌株的产酸和生长繁殖，故选取初始pH5.7、6.7、7.7 进行响应面试验。

图7 初始pH 对发酵菠萝果汁中活菌数和总酸的影响Fig.7 Effect of the initial pH on viable cell count and total acid in fermented pineapple juice

2.3.2 发酵温度对活菌数和总酸的影响 温度会通过影响生物大分子的结构和功能以及酶的活性等来影响菌株的生长繁殖、代谢物产量以及产品的酸度和风味[32]。如图8 所示，在发酵温度为26～42 ℃范围内，发酵菠萝果汁中活菌数差异不显著（P＞0.05），表明该温度范围均可适宜于L.caseiLK-1 的生长繁殖。在产酸方面，发酵温度为37 ℃时，L.caseiLK-1具有最高的产酸量，菠萝果汁中总酸含量由发酵前0.72 g/kg 增加至7.08 g/kg。当发酵温度低于或高于37 ℃时，可能影响了菌株胞内酶的活性，导致代谢缓慢、产酸减少，因此发酵菠萝果汁的总酸含量处在较低水平。由图8 可知，发酵温度为32～42 ℃时，发酵菠萝果汁中活菌数和总酸含量较适宜，故选择32、37 和42 ℃进行响应面试验。

图8 发酵温度对发酵菠萝果汁中活菌数和总酸的影响Fig.8 Effect of fermentation temperature on viable cell count and total acid in fermented pineapple juice

2.3.3 接种量对活菌数和总酸的影响 如图9 所示，在接种量0.5%～2.5%的范围内，发酵菠萝果汁中活菌数变化不显著（P＞0.05），但接种量从0.5%增加至1%时，其总酸含量由5.78±0.13 g/kg 显著增加至6.95±0.21 g/kg（P＜0.05）；当接种量继续升至2.5%时，发酵菠萝果汁中总酸含量呈现下降趋势，但不显著（P＞0.05）。接种量过低时，菌株初始基数小，菌株的生长空间相对较大，发酵速率慢，导致同发酵时间内产酸量少，发酵不充分[33]，随接种量的增加，菌株发酵速率增加，可在短时间内产生大量的乳酸，导致总酸含量增加。由图9 可知，接种量为0.5%～1.5%时，发酵菠萝果汁中活菌数和总酸含量较高，故选取0.5%、1%、1.5%接种量进行响应面试验。

图9 接种量对发酵菠萝果汁中活菌数和总酸的影响Fig.9 Effect of inoculation amount on viable cell count and total acid in fermented pineapple juice

2.3.4 发酵时间对活菌数和总酸的影响 由图10 可知，随着发酵时间的增加，发酵菠萝果汁中活菌数先增加，后趋于稳定，最后逐渐降低。相对于0 h，发酵6 h 后活菌数显著增加（P＜0.05）；发酵12～24 h 期间活菌数无显著变化（P＞0.05），但显著高于发酵6 h 时活菌数（P＜0.05）；发酵24 h 后活菌数显著下降（P＜0.05），在发酵36 h 和48 h 时，活菌数分别为8.90±0.03 lg CFU/mL 和8.79±0.04 lg CFU/mL。总酸含量在发酵前24 h 内迅速上升，但在发酵24 h 后无显著变化（P＞0.05）。推测是由于发酵时间过短时，发酵菌株处于自身繁殖阶段，代谢物质较少，随着发酵时间延长，代谢物质乳酸等的积累，使产品总酸含量逐渐增加。由图10 可知，发酵时间为24 h 时，发酵菠萝果汁具有较高的活菌数和总酸含量，分别为9.03±0.02 lg CFU/mL 和6.83±0.17 g/kg，故选取发酵时间12、24 和36 h 进行响应面试验。

图10 发酵时间对发酵菠萝果汁中活菌数和总酸的影响Fig.10 Effect of fermentation time on viable cell count and total acid in fermented pineapple juice

2.4 响应面优化试验结果

运用Design-Expert 8.0.6 软件对表4 中总酸含量进行拟合，得到回归方程为：Y=6.99+0.056A+0.23B+0.22C+0.82D-0.06AB-0.12AC+0.15AD+0.075BC-0.30BD+0.11CD-0.17A2-0.860B2-0.52C2-0.82D2，对上述回归方程进行方差分析，结果见表5。

表4 菠萝果汁发酵工艺优化响应面试验设计方案和结果Table 4 Design scheme and results of response surface experiment for optimization of pineapple juice fermentation process

表5 响应面试验结果方差分析Table 5 Variance analysis of response surface methodology results

由表5 方差分析可知，所建模型P值＜0.0001、F值为27.98、R2＝0.97 以及失拟误差（P=0.3121＞0.05）不显著，表明该方程模型拟合度较好，可用来反映初始pH、发酵温度、接种量和发酵时间对总酸含量的影响。结果表明，4 个因素中对发酵菠萝果汁总酸含量影响大小为发酵时间＞发酵温度＞接种量＞初始pH。其中，发酵时间、发酵温度、接种量的一次项和二次项均对总酸含量有极显著性影响（P＜0.01），而初始pH 的一次项和二次项均对总酸含量无显著性影响（P＞0.05）；发酵时间和发酵温度的交互项对发酵菠萝果汁的总酸含量有影响显著（P＜0.05），其余交互项不显著（P＞0.05）。

各试验因素以及两两交互作用对总酸含量影响的响应面曲线如图11 所示。由响应曲面的陡峭程度来看，除发酵温度与发酵时间的交互作用对发酵菠萝果汁的总酸含量有着显著性影响外，其余的各试验因素交互作用均不明显，与方差分析结果一致。

图11 各因素交互作用对总酸含量影响的响应面图Fig.11 Response surface of the interaction of various factors to the effect of total acid content

通过对模型方程及响应面的分析，确定最佳发酵工艺为初始pH6.82、发酵温度37.32 ℃，接种量1.14%，发酵时间30.03 h，预测在此条件下总酸含量为7.24 g/kg。为了更好控制和实现生产条件，将优化的工艺条件调整为初始pH6.8、发酵温度37 ℃、接种量1%、发酵时间30 h。在此发酵条件下，发酵后菠萝果汁中总酸含量为7.16±0.26 g/kg，活菌数为8.99±0.04 lg CFU/mL，总酸含量与模型预测值较一致，验证了模型的可靠性。

2.5 感官评价

对在优化工艺条件下获得的发酵菠萝果汁进行感官评价，结果见图12。由图可知，所选4 个评价指标中除组织指标外，发酵后菠萝果汁的气味、色泽和口感评分均高于发酵前菠萝果汁，但在气味上略低于NFC 菠萝果汁，这主要与菠萝果汁发酵前的处理有关。用于发酵的NFC 菠萝果汁经过水浴灭菌（90 ℃，10 min）和pH 调节（pH6.8）后，色泽变暗，糖酸比失衡，菠萝特征风味变淡，经过L.caseiLK-1 发酵后，发酵风味增加，风味层次更为丰富。此外，由于乳酸等有机酸成分的产生，使得发酵菠萝果汁的酸度增加，相对于发酵前菠萝果汁，发酵后菠萝果汁酸甜更为适口，色泽透亮，口感评分与NFC 菠萝果汁相近。发酵前后菠萝果汁以及NFC 菠萝果汁的感官评分分别为48.62、76.75、81.87 分，表明L.caseiLK-1发酵菠萝果汁具有良好的感官品质。

图12 不同处理菠萝果汁感官评价Fig.12 Sensory evaluation of pineapple juice with different treatments

3 结论

干酪乳杆菌是生产和应用中重要的益生菌。本研究以L.caseiLK-1 为研究对象，通过耐酸、耐糖性实验和产酸性能测定探究该菌株的耐酸、耐糖、产酸等特性。L.caseiLK-1 在pH5～7 和0%～10%质量分数葡萄糖环境下，具备良好的生长繁殖能力；在酸性（pH3）和高糖（40%质量分数葡萄糖）环境中培养3 h，其存活率分别为76%和71%；在MRS 培养基中培养48 h，产酸量为5.35 g/kg，产酸能力良好。结果表明，L.caseiLK-1 在一定的酸性和糖浓度环境下，具有较好的生长繁殖能力，且具备较好的耐酸、耐糖能力和产酸性能，适用于弱酸或较高糖果汁发酵。

将L.caseiLK-1 应用于菠萝果汁的发酵，建立干酪乳杆菌发酵菠萝果汁的发酵工艺。以活菌数和总酸含量为指标，对菠萝果汁初始pH、发酵温度、接种量和发酵时间进行单因素实验，以确定实验因素水平；并以总酸含量为指标，进行响应面试验。根据响应面试验结果，获得最优发酵条件为：菠萝果汁初始pH6.8、发酵温度37 ℃、菌种接种量1%、发酵时间30 h，此时发酵菠萝果汁中总酸含量为7.16±0.26 g/kg，活菌数为8.99±0.04 lg CFU/mL。此条件下发酵的菠萝果汁饮品色泽鲜亮，酸甜适口，风味较好，具有良好的感官品质，可为干酪乳杆菌在果蔬汁的进一步生产应用提供依据。