蜜环菌Am-07-22 发酵对玉米赤霉烯酮降解效果影响及机理初探

王泽贤，赵宇楠，贾丹丹，纪晚唐，许 丁，向杨玲，蔡 丹，刘景圣

（吉林农业大学食品科学与工程学院，小麦和玉米深加工国家工程研究中心，吉林长春 130118）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是一种非甾体雌激素真菌毒素，又称为F-2 毒素，是一种主要由镰刀菌属真菌产生的次级代谢产物，主要存在于被污染的玉米、小麦、大米、大豆等谷物中[1]。ZEN 会通过多种途径污染谷物，食品和饲料等，严重威胁人类健康和生命安全，其化学结构与许多类雌激素具有相似的特性，会激活雌激素受体，引起农产动物的流产、死胎、畸形胎等生殖障碍[2]。另外ZEN 还会通过食物链进入人体，造成免疫损伤[3]、肝脏损伤[4]、具有遗传毒性[5]、诱发癌症[6]等危害。ZEN 的污染及毒性危害较大，因此寻找到高效降解ZEN 的方法变得尤为重要。

常见的降解玉米赤霉烯酮的方法包括物理方法、化学方法和生物方法[7]。物理方法主要通过热处理、紫外线辐射或γ射线照射、吸附剂吸附等[8-9]。化学方法包括氨化法、碱法、臭氧处理、氧水处理等[10]。但物理化学方法具有降解效率较低，破坏营养成分，引入其他化学物质等不利因素等限制。而生物方法因其具有高效性、高特异性、污染少逐渐成为真菌毒素降解的聚焦热点，研究表明玉米赤霉烯酮的生物降解主要来自以下两类：微生物降解和酶降解[11]。迄今为止，大量研究成果显示微生物具有显著的脱除玉米赤霉烯酮的作用，种类主要涉及乳酸菌、芽孢杆菌、曲霉菌和酵母菌等[12-13]。Zhao 等[14]和 Xu 等[15]研究发现芽孢杆菌可有效降解 ZEN。González 等[16]测试了11 种已经能证明降解 AFB1 的芽孢杆菌降解 ZEN 的能力，结果发现所有菌株在 30 ℃ 下培养72 h 内均能降解 ZEN。另外 Sun 等[17]从发酵大豆中分离出的食品级黑曲霉 FS10 在 PDB 培养基中能有效去除 ZEN，菌丝体和培养滤液也可降低 43.10%和 68.16% 的 ZEN。

尽管现阶段对细菌及相关酶降解ZEN 的相关研究较为普遍，但大型食用真菌降解ZEN 及相关机理的研究依然较少，国内外学者研究发现大型食用真菌能够代谢产生漆酶，并且漆酶在降解真菌毒素方面有着良好的应用[18]。Loi 等[19]研究杏鲍菇漆酶Ery4和漆酶介体体系（LMSs）对多种真菌毒素及毒素联合使用的降解能力，结果对AFB1、FB1、OTA、ZEN 和T-2 毒素均有不同程度的降解效果。Song 等[20]在毕赤酵母X33 中表达了来自秀珍菇的漆酶基因Lac2，结果表明Lac2-ABTS 和 Lac2-AS 两种体系在pH4～8 及温度40～60 ℃范围内均为降解玉米赤霉烯酮的有效体系。

实验室前期研究发现蜜环菌Am-07-22 具有能够降解真菌毒素的潜力，因此本试验在此基础上以玉米赤霉烯酮（ZEN）为研究对象，蜜环菌Am-07-22 为试验菌株，通过生物发酵降解的技术，研究蜜环菌Am-07-22 对ZEN 的降解特性和相关机理，为玉米赤霉烯酮生物脱毒提供新的菌株资源，为食用菌应用于真菌毒素防控奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种 蜜环菌Am-07-22（Armillaria mellea）由小麦和玉米深加工国家工程研究中心保藏；玉米赤霉烯酮ZEN 固体标准品（纯度＞99%）购于青岛普瑞邦（Pribolab）生物工程有限公司，固体标准品用色谱级甲醇溶液溶解稀释，配制成浓度为100 μg/mL 的ZEN 标准储备液，于-20 ℃避光保存；蛋白酶K（≥30 units/mg protein）、SDS 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蜜环菌Am-07-22 固体斜面培养基为12°Bé麦芽汁琼脂培养基；蜜环菌Am-07-22 液体培养基 马铃薯20%、蚕蛹粉0.5%、葡萄糖1%、蔗糖1%、酵母浸粉2%、磷酸二氢钾 0.15%、七水合硫酸镁0.075%、维生素B10.001%，pH 自然，121 ℃灭菌20 min。

1200 型高效液相色谱仪 美国Agilent 公司；JY 92-IIN 超声波细胞破碎仪（配备φ6 变幅杆）宁波新芝生物科技股份有限公司；Allegra X-30R 高速离心机 美国Beckman 公司；DSX-18L-I 手提式高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；Stab S2 振荡培养箱 上海润度生物科技有限公司；HH-S4 数显恒温水浴锅 常州市金坛友联仪器研究所；BSA2245电子分析天平 Sartorious（北京）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化 参考何音华[21]的方法对菌种进行活化，将保藏的蜜环菌Am-07-22 菌种转接至12°Bé新鲜麦芽汁琼脂斜面培养基中，并放置于培养箱，在27 ℃条件下培养至第12 d 备用。

将活化好的蜜环菌Am-07-22 菌株从固体斜面培养基中取8 块1 cm3的菌体接种至30 mL 液体培养基中，于27 ℃恒温摇床中振荡培养6 d，摇床转速为160 r/min，培养结束即为制得的一级种子液，于4 ℃的条件下保存。再将一级种子液打碎，以8%的接种量接种至200 mL 的液体种子培养基中，于27 ℃、160 r/min 的培养条件下再次振荡培养6 d，得到二级种子液。二级种子液也于4 ℃条件下保存。

1.2.2 ZEN 的检测 参考骆翼[22]的高效液相色谱的ZEN 检测条件并加以改进，具体的检测条件如下：

色谱柱：Extend-C18柱，柱长150 mm，内径4.6 mm，粒度5 μm。流动相：甲醇:水=70:30、柱温：25 ℃、流速：0.6 mL/min、进样量：20 μL、紫外吸收波长：236 nm。

吸取适量的ZEN 标准储备液，用甲醇溶液稀释，配制成15、10、5、2、1、0.5、0.2 μg/mL 的不同浓度ZEN 工作液，于4 ℃避光保存。标准工作液经过0.22 μm 滤膜过滤后，使用高效液相色谱仪进行检测。以ZEN 浓度为横坐标，以高效液相色谱检测ZEN 的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.3 蜜 环 菌Am-07-22 降 解ZEN 效 果 及ZEN 回收率的测定 将制备好的蜜环菌Am-07-22 二级种子培养液（菌种浓度为75 g/L）破碎处理后，接种至ZEN 含量为5 μg/mL 的10 mL 液体培养基中，接种量为10%，然后将反应体系在27 ℃，160 r/min 的恒温摇床中振荡避光反应7 d。取1 mL 上清液加入1 mL 甲醇溶液进行ZEN 的提取，然后在10000 r/min的条件下低温离心10 min，取上清再经过0.22 μm滤膜过滤后，使用高效液相色谱仪检测ZEN 的含量，并计算ZEN 的降解率。ZEN 降解率计算公式如下：

式中，ZEN 对照组：ZEN 含量为5 μg/mL 未接种蜜环菌Am-07-22 的液体培养基。

同时对该提取方法进行加标回收率的计算，分别添加0.5、2、10 μg/mL 浓度的ZEN 标准工作液，采用上述方法提取与检测，每个浓度3 个平行。

1.2.4 ZEN 浓度对蜜环菌Am-07-22 降解的影响将打碎的蜜环菌Am-07-22 二级种子液接种至含有ZEN 浓度分别为2、5、7.5、10、15 μg/mL 的10 mL液体培养基中，接种量为10%，每个菌种3 个平行，然后将反应体系在27 ℃，160 r/min 的恒温摇床中振荡避光反应7 d。提取ZEN 后使用高效液相色谱仪检测玉米赤霉烯酮的含量，每组3 个平行，并计算ZEN 的降解率和降解量。

1.2.5 培养时间、温度、初始pH 和接种量对蜜环菌Am-07-22 降解ZEN 的影响 将打碎的蜜环菌Am-07-22 二级种子液接种至含有ZEN 浓度分别为5 μg/mL 的10 mL 初始pH 分别为4、5、6、7、8、9 的液体培养基中，接种量分别为2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%，然后将反应体系在18、21、24、27、30、33 ℃，160 r/min 的恒温摇床中振荡避光分别反应4、5、6、7、8、9 d。其中单因素固定条件为培养时间7 d、培养温度27 ℃、初始pH 自然、接种量10%。使用高效液相色谱仪检测玉米赤霉烯酮的含量，每组3 个平行，并计算ZEN 的降解率。

1.2.6 蜜环菌Am-07-22 降解ZEN 活性部位的检测

将蜜环菌Am-07-22 重新接种于液体种子培养基中，在27 ℃恒温摇床中以160 r/min 转速的条件下振荡培养6 d。培养结束后用4 层滤布过滤，收集所得到的菌丝体及发酵上清液，对降解ZEN 的菌体种子发酵液活性部位进行检测，共分3 组进行，以含有浓度为5 μg/mL 的ZEN 作为对照组，每组取3 个重复样品进行试验。

参考金博文[23]的方法对不同组进行处理，A 组（发酵上清液）：取过滤后的上层发酵液，在4 ℃，10000 r/min 的条件下低温离心10 min，收集上清液1 mL。B 组（菌丝体组）：称取过滤后的下层菌丝体1 g，用PBS 缓冲液轻轻漂洗3～5 次。C 组（细胞破碎组）：称取过滤后的下层菌丝体1 g，用PBS 缓冲液轻轻漂洗3～5 次，进行细胞超声破壁处理2 h（200 W，工作5 s，间歇5 s），然后在10000 r/min 的条件下低温离心10 min，收集胞内液1 mL。将制备后的实验组加入稀释后的ZEN 标准储备液（见1.1），体系中ZEN 的浓度为5 μg/mL，反应体系在27 ℃、160 r/min条件下避光振荡培养7 d。

1.2.7 蜜环菌Am-07-22 降解ZEN 活性物质性质的初步分析 参考景思源[24]的处理方法对活性物质进行分析，分3 组处理：1 组（蛋白酶K 组）：取5 mL 发酵上清液，加入250 μL 蛋白酶K（终浓度为0.1 mg/mL），55 ℃处理2 h。2 组（SDS 组）：取5 mL 发酵上清液，加入250 μL SDS（终浓度为0.5 mg/mL），55 ℃处理2 h。3 组（蛋白酶K+SDS 组）：取5 mL 发酵上清液，加入250 μL 蛋白酶K（终浓度为0.1mg/mL）和250 μL SDS（终浓度为0.5 mg/mL），55 ℃处理2 h。4 组（100 ℃沸水浴组）：取5 mL 发酵上清液，在100 ℃条件下沸水浴处理20 min。

将不同处理后的4 组发酵上清液用0.22 μm 滤膜过滤后，向其中加入ZEN 储备液，体系中ZEN 的浓度为5 μg/mL，反应体系在27 ℃、160 r/min 条件下避光振荡培养7 d。结束后使用高效液相色谱仪检测ZEN 含量并计算降解率。同时用初始浓度为5 μg/mL ZEN 的发酵上清液作为对照组。

1.2.8 蜜环菌Am-07-22 产漆酶酶活测定 参考刘天睿等[25]的方法并加以改进，从发酵上清液中取样测定蜜环菌Am-07-22 第1 d 至第10 d 产漆酶的酶活力，采用ABTS 法测定漆酶酶活，以ABTS 为底物，通过酶标仪测定漆酶活力。在200 μL 酶活反应体系中先加入50 μL 0.5 mmol/L 的ABTS 及100 μL 0.2 mol/L 柠檬酸钠缓冲溶液（pH4.0），混合均匀，再加入稀释10 倍后的酶液50 μL 启动反应，每隔1 min记录420 nm 吸光度值的变化，在符合线性关系处求出斜率并换算出酶活力。漆酶酶活性的定义为以每分钟氧化1 μmol ABTS 所需要的漆酶量作为1 个酶的活力单位，酶活的单位为U/L。漆酶活力计算公式：

式中，ε为ABTS 的摩尔吸光系数为36000 L/（mol·cm），N 代表稀释倍数，V 总代表酶活测定体系中的反应液的总体积，V 酶代表反应添加的酶液体积。

1.2.9 发酵时间、pH、金属离子对蜜环菌Am-07-22发酵上清液降解ZEN 的影响 参考韦锦范[26]的方法并加以改进，按照上述方法收集蜜环菌Am-07-22的发酵上清液，向其中加入浓度为5 μg/mL ZEN 标准溶液，于27 ℃，160 r/min 的条件下振荡反应。单因素固定条件为反应时间7 d、pH 自然、未添加金属离子。分别在反应时间为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d 取样测定反应体系中ZEN 含量的变化，并计算降解率。分析不同时间对蜜环菌Am-07-22 发酵上清液降解ZEN 的影响。另外再取发酵上清液分别调节pH 为3、4、5、6、7、8、9、10，以及向其中加入浓度为10 mmol 的Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+金属离子，向其中加入浓度为5 μg/mL ZEN 标准溶液，于27 ℃，160 r/min 的条件下振荡反应，以不添加金属离子的发酵上清粗酶液反应7 d 作为对照，每组三个重复。反应结束后取1 mL 反应液加入等体积甲醇溶液进行玉米赤霉烯酮的提取，充分摇匀后在10000 r/min 的条件下低温离心10 min，再经过0.22 μm 滤膜过滤后，使用高效液相色谱仪检测玉米赤霉烯酮的含量，并计算ZEN 的降解率。分析不同pH 与不同金属离子对蜜环菌Am-07-22 发酵上清液降解ZEN 的影响。

1.3 数据处理

所有试验数据均为一式三份，并用“平均值±标准差”的形式表示。采用SPSS 23 进行数据的显著性分析，P＜0.05 表示具有显著性差异。使用Pearson相关性分析法来分析ZEN 降解率与漆酶酶活之间的相互关系。最后使用Origin 2019 软件进行数据处理与图像绘制。

2 结果与分析

2.1 蜜环菌Am-07-22 对ZEN 的降解效果

通过高效液相色谱法对不同浓度的ZEN 进行测定，最终得到的标准标准曲线线性回归方程：y=150.13x+5.0423，其中R²=0.9999，表明线性关系良好。通过向培养基中添加5 μg/mL 的ZEN，并利用蜜环菌Am-07-22 菌株进行发酵降解，由图1 的高效液相色谱图可知蜜环菌Am-07-22 对5 μg/mL ZEN的降解效果良好，降解率可达73.83%。另外通过添加0.5、2、10 μg/mL 浓度的ZEN，回收率测定分别为96.38%±1.28%、98.64%±0.37%、97.63%±0.95%。表明此方法对ZEN 的回收率较高，准确性良好，符合检测标准。

图1 菌株Am-07-22 降解ZEN 的液相色谱图Fig.1 Liquid chromatogram of strain Am-07-22 degrading ZEN

2.1.1 ZEN 浓度对蜜环菌Am-07-22 降解效果的影响 如图2 所示，蜜环菌Am-07-22 对不同浓度ZEN的降解率有所不同，当初始浓度为2 μg/mL 时降解率可达97.32%，ZEN 浓度为5 μg/mL 时具有73.83%±1.34%（图1 中的液相色谱图出自此次实验）的降解率，而当ZEN 的浓度升至10 μg/mL 和 15 μg/mL 时，降解率则更低分别为49.47%和32.55%。由此可见降解率随着ZEN 浓度的升高而下降。但从图3 中可以看出当初始浓度为2 μg/mL 时对ZEN 的降解量为19.46 μg，初始浓度为5 μg/mL 时对ZEN 的降解量为36.5 μg，而在初始浓度为10 μg/mL 和15 μg/mL时可降解ZEN 的量则均超过了48.82 μg，并且差异不显著（P＞0.05），因此蜜环菌Am-07-22 对ZEN 的降解量逐渐升高且趋于稳定。在低浓度时，初始ZEN的含量本身较低，尽管降解率很高但最终的降解量依然较低，而在高浓度时初始ZEN 的含量则较高，即使降解率有所下降，但降解量却不断增高，最后逐渐稳定达至降解上限。菌株对ZEN 浓度为2 μg/mL 的降解率已经超过97%，降解效果较好，为了节省成本，后续选择初始浓度为5 μg/mL 的 ZEN 进行实验。

图2 ZEN 初始浓度对Am-07-22 降解ZEN 降解率的影响Fig.2 Effect of initial ZEN concentration on the degradation rate of ZEN by Am-07-22

图3 ZEN 初始浓度对Am-07-22 降解ZEN 降解量的影响Fig.3 Effect of initial ZEN concentration on the degradation content of ZEN by Am-07-22

2.1.2 培养时间对蜜环菌Am-07-22 降解ZEN 的影响 由图4 可知，蜜环菌Am-07-22 对ZEN 的降解率会随着培养时间的延长而逐渐增大（P＜0.05），从最开始的第4 d 降解率为52.64%上升至第7 d 的72.08%。而第8、9 d 的降解率升至77.41%和77.23%，此时降解率的差异不显著（P＞0.05），表明第8～9 d 的降解率最高并已趋于稳定。这可能是因为8 d 为蜜环菌Am-07-22 的最佳生长时间，此时菌种活力最强，对ZEN 的降解率也达到最大，即使延长培养时间，ZEN的降解率也不会有显著变化，这与Wang 等[27]的研究结论相符。因此最佳的培养时间为第8 d。

图4 时间对Am-07-22 降解ZEN 降解率的影响Fig.4 Effect of time on the degradation rate of ZEN by Am-07-22

2.1.3 培养温度对蜜环菌Am-07-22 降解ZEN 的影响 由图5 可知，在18～27 ℃的范围内蜜环菌Am-07-22 对ZEN 的降解率随温度的升高而显著增大（P＜0.05），从18 ℃时39.92%的降解率升高至27 ℃时的73.94%。而在27～33 ℃的条件下，降解率反而随温度升高而显著下降（P＜0.05），其中在33 ℃时对ZEN 降解率为45.52%。这表明过高或过低的温度对蜜环菌Am-07-22 降解ZEN 的影响均较大，在不适宜的温度条件下蜜环菌的生长环境变差，因此对ZEN 的降解率也会降低，这一结果与Xu 等[15]的研究相符，因此最佳的培养温度为27 ℃。

图5 温度对Am-07-22 降解ZEN 降解率的影响Fig.5 Effect of temperature on the degradation rate of ZEN by Am-07-22

2.1.4 初始pH 对蜜环菌Am-07-22 降解ZEN 的影响 由图6 可知，在pH4.0～9.0 范围内随着pH 的增大，蜜环菌Am-07-22 对ZEN 的降解率呈现先升高后降低的趋势（P＜0.05），pH 为7.0 时的降解率最高可达75.22%。而pH 为4.0 及9.0 时的降解率仅为45.89%和61.97%。这说明在过酸或过碱的环境下，降解效果均会受到影响。在pH 为7.0～8.0 的环境中降解效果最佳，降解率达到最高（自然pH 为6.2，蜜环菌Am-07-22 在此条件下的生长状态最好，但不是最佳的降解ZEN 的初始pH），这与Tan 等[28]的研究结果相近。因此选择初始pH 为7.0 作为降解ZEN最佳的初始pH。

图6 初始pH 对Am-07-22 降解ZEN 降解率的影响Fig.6 Effect of initial pH on the degradation rate of ZEN by Am-07-22

2.1.5 菌液接种量对蜜环菌Am-07-22 降解ZEN 的影响 由图7 可知，随着蜜环菌Am-07-22 菌液接种量的增加，对ZEN 的降解率逐渐升高（P＜0.05）。最终在接种量为10%～15%时趋于恒定，此时的降解率均高于73%。这表明了蜜环菌Am-07-22 在此时的生长环境中已然达到最大的生长量，接种量的增加也不会表现出对ZEN 降解率的升高。为节省蜜环菌Am-07-22 菌种用量，选择接种量10%作为最佳降解ZEN 的接种量。最终选择的降解条件为培养时间8 d，培养温度27 ℃，初始pH7.0，接种量10%，此时对ZEN 的降解率最佳为78.72%。

图7 菌液接种量对Am-07-22 降解ZEN 降解率的影响Fig.7 Effect of the added amount of fungal liquid on the degradation rate of ZEN by Am-07-22

2.2 蜜环菌Am-07-22 对ZEN 的降解机理初探

2.2.1 蜜环菌Am-07-22 降解ZEN 的活性部位 从图8 中可以看出蜜环菌Am-07-22 不同组分对ZEN的降解效果差异较为明显（P＜0.05）。其中发酵上清液对ZEN 的降解率最高为47.42%，而Am-07-22 菌体细胞的降解率为37.05%，破碎后的菌体细胞对ZEN 的降解率最低仅为13.08%。由此可以推断，蜜环菌Am-07-22 对ZEN 的清除作用不是单一的一种方式，存在多种途径。最主要的清除作用为发酵上清液对ZEN 的降解作用，而菌体细胞对ZEN 也有一定程度的吸附作用。

图8 菌株Am-07-22 的不同组分对ZEN 的降解率Fig.8 Degradation rate of ZEN by different components of Am-07-22

2.2.2 蜜环菌Am-07-22 降解ZEN 活性物质的分析

由图9 可知，通过对蜜环菌发酵上清液进行蛋白酶K、SDS、沸水浴等处理，发现以上几种处理方式对ZEN 降解有显著的影响（P＜0.05）。蛋白酶K 和SDS 处理后的降解率分别为12.65%和22.89%，蛋白酶K+SDS 共同处理的降解效果与蛋白酶单独处理的降解效果差异则不显著（P＞0.05）。而沸水浴后对ZEN 的降解率仅为5.55%，降解能力明显下降。推测在蜜环菌分泌的多种活性成分中，发酵上清液中存在的某种酶类会降解ZEN，蛋白酶K 和沸水浴会破坏这种酶的结构导致酶活力下降，对ZEN 的降解率由此下降，这与Imade 等[29]的研究结果相符。而蜜环菌具有良好地产生漆酶的特点，Banu 等[30]也研究发现漆酶对ZEN 具有降解潜力。

图9 菌株Am-07-22 发酵上清液经不同处理后对ZEN 的降解率Fig.9 Degradation rate of ZEN by fermentation supernatant of strain Am-07-22 after different treatment

2.2.3 发酵时间对蜜环菌Am-07-22 发酵上清液降解ZEN 影响及产漆酶酶活测定 考察了发酵第1 d至第10 d 蜜环菌Am-07-22 发酵上清液中漆酶酶活力的变化及对ZEN 降解效果的影响并侧重对两者之间的相关性进行分析。由图10 可知，随着发酵时间的延长蜜环菌Am-07-22 发酵上清液对ZEN 的降解率逐渐增大（P＜0.05），从第1 d 21.69%的降解率上升至第10 d 62.50%的降解率，而蜜环菌产漆酶的酶活力也随着发酵时间的延长逐渐升高（P＜0.05），由第1 d 的酶活仅为169.26 U/L，到第10 d 的酶活则上升至521.11 U/L，这与ZEN 的降解率升高保持一致。通过Pearson 相关性来分析ZEN 降解率与漆酶酶活之间的相互关系，结果证实在0.05 的显著性水平上ZEN 降解率与漆酶酶活之间存在着显著关联，其相关性为正且r=0.973。由此可以推测蜜环菌Am-07-22 产生的漆酶可能在降解ZEN 中起主要作用，这与Banu 等[30]的研究结果相符。

图10 不同发酵时间下Am-07-22 上清液对ZEN 的降解率和漆酶酶活的变化规律Fig.10 Change rule of degradation rate of ZEN and laccase activity of Am-07-22 supernatant under different fermentation time

2.2.4 不同pH 对蜜环菌Am-07-22 发酵上清液降解ZEN 的影响 由图11 可以看出不同pH 对蜜环菌Am-07-22 发酵上清液对ZEN 的降解率影响较大。其中在pH 为6.0～7.0 时，ZEN 的降解率最高为46.98%和51.84%。两者与不调节pH 的发酵上清液对照组没有显著性差异（P＞0.05）。而在酸性及碱性条件下，对ZEN 的降解率显著降低（P＜0.05），在pH 为3.0 和10.0 时仅有8.29%和11.22%的降解率。表明了在过酸或过碱的条件下，发酵上清液中产生的漆酶会受环境影响结构被破坏，对ZEN 的降解作用因此下降，因此在不适宜的pH 条件下，漆酶无法有效地降解ZEN，致使对ZEN 的降解率降低。在pH 为6.0～7.0 的范围内，均为降解ZEN 的适宜条件，这与白长胜等[31]的研究结果相符。

图11 不同pH 对Am-07-22 发酵上清液对ZEN 降解率的影响Fig.11 Effect of different pH on the degradation rate of ZEN by the fermentation supernatant of Am-07-22

2.2.5 不同金属离子对蜜环菌Am-07-22 发酵上清液降解ZEN 的影响 由图12 可知，不同金属离子对蜜环菌Am-07-22 发酵上清液降解ZEN 的影响效果不尽相同，其中Na+、K+和Fe2+的添加对发酵上清液降解ZEN 的效果与未添加金属离子时的降解效果差异不明显。Zn2+、Fe3+的添加对ZEN 降解率有一定的抑制作用（P＜0.05），降解率分别为42.09%和37.76%，Fe3+的抑制效果最明显较对照降低了9.66%。而Cu2+、Mg2+、Mn2+的添加对发酵上清液降解ZEN的效果得到显著增强（P＜0.05），添加Mg2+和Mn2+对ZEN 的降解率分别为55.57%和57.80%，而添加Cu2+对发酵上清液降解ZEN 的降解效果提升最高为63.37%，较未添加金属离子的对照组提高了15.95%。由此可以推断Cu2+会显著增强漆酶的酶活力，这与祝嫦巍等[32]的研究结果一致，推测原因可能与漆酶本身的结构有关，漆酶为含四个铜离子的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶类，因此Cu2+存在的环境中会增强漆酶的活性。

图12 不同金属离子对Am-07-22 发酵上清液对ZEN 降解率的影响Fig.12 Effect of different metal ions on the degradation rate of ZEN by the fermentation supernatant of Am-07-22

3 结论

本研究以蜜环菌Am-07-22 为试验菌株，采用真菌生物发酵的方式降解玉米赤霉烯酮（ZEN）。其对5 μg/mL ZEN 的降解率可达78.72%，最适的降解条件为培养时间8 d，培养温度27 ℃，初始pH7.0，接种量10%。蜜环菌Am-07-22 发酵上清液中的活性成分是降解ZEN 的主要方式，菌体细胞对ZEN 也有一定的吸附作用。另外发酵上清液对ZEN 的降解率与漆酶酶活的相关性较高，而且Cu2+对发酵上清液降解ZEN 具有最佳的促进作用。因此可推断出蜜环菌Am-07-22 发酵上清液中产生的漆酶在降解ZEN 中起主要作用。本研究结果表明蜜环菌Am-07-22 具有降解玉米赤霉烯酮的能力，为玉米赤霉烯酮的防治提供了新的研究思路。