红杆天麻共生蜜环菌筛选初探

李晓东, 雷 萍, 付玉平, 蒙 琳,张羽翅,王咏梅,杨 杨,敬 丹

(1.陕西省略阳县中药材技术推广服务中心，陕西 略阳 724300；2.陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043)

蜜环菌(Armillariamellea)属担子菌纲，白蘑科、蜜环菌属兼寄生性真菌，除本身能作为药用外，它常常与名贵中药材天麻、猪苓共生，为其提供营养。蜜环菌具有生态、物种、遗传、形态多样性[1]，不同的地理区域分布着不同种类的蜜环菌[2]。陕西略阳秦岭南麓，由三个中山区和三个浅山区构成，最高海拔2 425 m，最低海拔587 m，年平均降雨量达826.2 mm[3]，良好的地理气候环境孕育丰富野生蜜环菌资源。目前种植最广、最多的是红杆天麻，而与之共生蜜环菌因繁育多代，已出现严重退化现象。蜜环菌多代应用会出现明显的菌种退化与变异[4]；生产中常用老化的天麻栽培菌材反复转接，菌种严重退化，菌索长势衰退[5]。实践表明，蜜环菌多代繁殖后，其侵染菌棒皮内菌丝发黄、变暗；菌索分支变少、颜色呈黑褐色，不发红，顶部无白色的生长点，菌索呈空壳状，髓心疏松菌丝极少，用手轻拉，便断裂，表现出严重的退化现象。为此，笔者进行野生蜜环菌菌株采集、分离筛选研究，以期为红杆天麻共生蜜环菌筛选提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

51个与野生天麻共生的野生蜜环菌菌索样、蜜环菌A9(对照)。栎树木材(青冈)、珍珠岩、树叶，PDA固态培养基，培养皿，250 mL锥形瓶。

1.2 试验方法

1.2.1 选择优株 将样材料带回后，分别与500 g栎树木材(青冈)和500 g干净湿润的青冈树叶混合，在同一环境室内种入珍珠岩中进行培养，20 d。将菌索生长快、无腐烂、无霉菌，性状优良的菌索生长点为首选材料(菌株)。

1.2.2 优选分离菌株培养 在超净工作台，用尖头镊子取优选分离的蜜环菌菌株菌索白嫩生长点0.5～1 cm左右，用无菌水冲洗后，尖端朝下竖直插入PDA培养基内，25℃培养箱中黑暗培养，获取菌丝体后，再扩大培育。

1.2.3 优选菌株分子生物学鉴定 委托陕西理工大学生物学院实验室将优选分离扩大培育的菌株及对照菌株(A9)再进行培养皿活化培养后，用蜜环菌菌株按照基因组琼脂糖凝胶电泳验证、PCR扩增18S rRNA序列 PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证；将条带切割，分别合并，进行PCR胶回收，具体操作步骤参照天根生化科技有限公司《DNA纯化回收试剂盒》，送交测序公司测序，分析软件MEGA4.0，构建进化树，对测序结果进行分析。

1.2.4 蜜环菌伴栽天麻试验 按照《略阳县天麻栽培技术》统一规范技术，在海拔600～1 420 m区域八个村进行蜜环菌L1、L2、L3、L4、A9与天麻蒴果伴栽试验。每个菌株随机抽查3窝，每窝翻3根菌棒。种植2个月后观察菌索、天麻种子生长情况。

2 结果与分析

2.1 野生蜜环菌优选结果

在不同海拔有丰富栎类壳斗科植物生长的地区采集51个蜜环菌菌株，共获得4株优良蜜环菌菌株，分别为L1(西淮坝杨树峁，海拔1 264.1 m)；L2(甘肃阳坝，海拔1 104 m)；L3(郭镇湾里，海拔1 172.8 m)；L4(五龙洞，海拔951.6 m)。

表1 优良野生蜜环菌采集位置

由此可见，优良野生蜜环菌生长地在海拔900～1 300 m。陕西略阳具有典型的秦巴山地特征，又是我国天麻传统产区，具有丰富的野生蜜环菌资源，可以认为该地区是优良野生蜜环菌自然生长分布区域之一。

2.2 优选蜜环菌菌株三级种培养结果

由陕西略阳县鸿福菌种厂，将试管转入已制作好的母种培养基上培养，然后转接培养三级种。结果见表2。

表2 优选蜜环菌菌株三级种培养结果

由表2 可知，L1、L3、L4蜜环菌菌株生长表现各不相同，颜色均比较好、相比较菌丝长、生长优良。

2.3 分子生物学鉴定结果

所选菌株分别送陕西微生物研究所、陕西理工大学分别鉴定，结果显示相似度由低到高是L3菌属于Armillaria(蜜环菌属)，与Armillariagallica较为接近，相似度97%;L4菌属于Armillaria(蜜环菌属)，与Armillariagallica接近，相似度97%；L1菌属于Armillaria(蜜环菌属)，与Armillariagallica接近，相似度99%；可以认为A9、L1、L2和L4均为蜜环菌。

经过对5种蜜环菌的培养，其中L1、L3与L4进行了培养皿活化培养，以及液体培养。由于母种污染，L2和A9没扩大培养。L1、L3与L4的培养皿活化培养，显示蜜环菌活力大小由高到底为：L1>L3>L4(图1)。

L1蜜环菌 L3蜜环菌 L4蜜环菌

2.4 伴栽天麻试验结果

筛选获得蜜环菌菌株与A9(对照)菌索外壳都呈现较厚而菌索皮层较薄，中腔充满浓密的疏松菌丝，生命力旺盛。在土壤缺水偏干的环境中，L1长势较好，抗旱能力强，菌丝粗状；其次是L4，L2、L3；在海拔600～1 420 m,L1、L2、L3号表现长势旺盛；A9号(对照)在各试验点缺水偏干的环境中长势弱，但在水分充足条件下，其生命力旺盛，分枝多，菌丝略细；L4、A9蜜环菌颜色红褐色稍偏红为主，L1、L2、L3菌索颜色稍深些红棕色或褐色为主。从天麻萌发情况看(表3、续表3)，L1、L3、L4、A9(对照)在1 000 m海拔以下的长坝、仙台坝、两流水、跑马村、明水坝、苇子沟等几处萌发好，接菌快，后期整体天麻产量都好。有可能这些地区温度适宜，对天麻生长有很大促进作用。

表3 优选蜜环菌大田伴栽天麻试验结果

2.5 子实体培养提取纯菌丝结果

将蜜环菌母种活化、扩大培养后，进行蜜环菌子实体诱导(图2)。在黑暗培养获得的蜜环菌至于恒温光照培养箱中，设置条件：18℃，昼夜交替培养，光照强度为60%，水分设置为95%。注意保持水分潮湿环境。观察出菇情况。L1、L3子实体诱导取得成功，但没有获得有效蜜环菌纯菌丝。后期还需继续培养子实体产生的孢子作为种源，然后进行分离培养出纯的菌丝体，今后，应加强保种和子实体培养提取纯菌丝工作，以减缓多代繁育退化的速度。

蜜环菌的活化

3 小结与讨论

蜜环菌是天麻供给营养的载体，野生资源有一定的分布范围，其活力直接影响天麻的产量，目前从野生天麻变型与伴生蜜环菌分布看，不同天麻种、变型对蜜环菌是有区别的，陕西略阳红杆天麻多分布在海拔900～1 300 m，乌杆天麻多分布在海拔1 500～2 000 m，是否存在不同变型天麻生长对蜜环菌需求不同，国内尚未有此报道，后期还需要进一步研究。同时，在科学采集野生蜜环菌资源时，建议根据其蜜环菌生境，采取自然保存，减少人工保存成本，恢复抗性，以保护蜜环菌资源，实现可持续利用。