山桃组培苗无糖生根培养研究

刘福云，孙怡婷，徐一超，卢 显，张 东，赵彩平

(西北农林科技大学 园艺学院, 陕西 杨凌 712100)

桃树繁殖方法主要有实生砧木嫁接育苗、扦插育苗和组培快繁育苗[1]。实生砧木嫁接育苗是我国目前主要的桃苗繁育方法，实生苗根系发达，育苗简单，已广泛应用于桃苗木的生产。但实生砧木生产周期长，效益低，出苗整齐度差，且适应性不一，不适用于规范化建园[2]。种质纯净、生长整齐、能保持优良性状的无性系砧木能够有填补实生砧木的缺陷。无性系苗木的生产主要包括扦插育苗和组织培养育苗。扦插生根率较低，扦插后的环境因素如光强、温度、湿度、通气等不易控制，而且高湿度下枝条容易产生病害，需要配备专门的育苗场地以及人员，管理难度大，成本高[3,4]。组织培养育苗既能保持母株的优良特性，又能在短时间内提供大量优质、无毒苗木，且可以实现周年生产，是一种优质的苗木繁殖方法[1]。但桃组培苗的生根比一般果树困难，且受生长素种类及浓度、体外培养时间[5]、培养基类型[6]、碳源[7]影响很大，而在生根培养基上添加活性炭[8]、间苯三酚[5,9]、硫铵[10]等对桃组培苗的生根效果在不同品种间差异较大，没有稳定的方法适用于所有桃组培苗的生根。受制于离体组织培养快繁中的污染、生根难和育苗成本高等问题，桃组织培养育苗还没有广泛应用于生产。

无糖组织培养技术，又叫光自养组织培养技术，是由日本千叶大学的古在丰树教授发明的。技术核心是用持续不断泵入的气体CO2作为碳源，促使组培苗由兼养型转为自养型，从而生产根系发达、生长健壮的苗木[11]。无糖培养通过提高植物的自养能力，减少植物形态结构发育差，生理功能弱等问题[12]。无糖生根技术在花卉[13,14]和药用植物[12]中应用较多，近年来在苹果[15]、油茶[16]和欧李[17]苗木生产中也开始推广应用。有糖组培环境湿度大，不利于空气流通，组培苗根系发育不良，侧根少，质地脆，移栽时容易断裂。而且组培苗长期处于低CO2浓度的环境，气孔长期开放，调节能力低[18]，移栽时苗子极易失水而导致枯萎死亡[19]。与有糖生根培养相比，无糖培养用蛭石代替了价格高的琼脂粉[17]，每盒可以生产几十株，成本低廉。无糖培养过程中由于没有添加糖类，接种过程中不易发生污染，夏秋污染高发的时期，有时无糖组培盒会产生一些真菌，但菌斑不易扩散，附近的苗子都不受影响，污染损失率低。无糖生根处理以蛭石为基质，基质疏松多孔，有利于幼苗地下部的气体交换[15]，生产出的幼苗根系发达, 有大量侧根形成，根系活力强[20]，木质化程度高，移栽时不易断裂。而且蛭石与移栽用基质的环境相似，移栽前不用炼苗[15]，苗子在温室培养至半米高即可移至大田，可极大缩短无性系砧木的生产时间。

桃砧木主要采用毛桃和山桃，山桃适应性强，耐旱、耐寒、耐盐碱，嫁接亲和力强，为我国北方桃产区的主要砧木[2]，应用范围广。目前山桃主要采用种子繁殖，播种时间分为春播和秋播，春播前需要进行沙藏和催芽处理，秋播不需要处理但发芽慢[21,22]。实生繁殖的山桃造林耗时久，出苗整齐度差，后代性状分离，适应性不一，不利于规模化建园。无糖生根技术能解决组培生根培养中的污染和生根难的问题，并且育苗成本低于有糖生根培养技术，育苗周期短，后代性状稳定，有助于优质山桃种质的推广和应用。

研究以山桃组培苗为实验材料，采用无糖生根技术，通过对山桃生根中生长素和含水量的筛选，以及不同生根时期山桃根系和地上部的生长情况统计，为山桃无糖组培快繁提高参考，进一步为其他砧木和优质杂交桃品种的无性繁殖提供参考，以期实现桃苗木繁殖的规模化、工厂化生产。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验于2019年5月至2020年11月在西北农林科技大学园艺学院组培室进行，位于陕西省咸阳市杨凌区内。实验所用的山桃母树位于西北农林科技大学园艺场桃种质资源圃，为17年生的实生成年树，实验地土壤类型为沙壤土。以山桃离体茎尖培养而成的组培苗为试验材料，选择继代30d后的组培苗新稍进行生根诱导试验。

1.2 实验方法

1.2.1 生长素种类及浓度的筛选 每升纯水中加入2.215g MS(Murashige and Skoogmedi)培养基，再加入生长素配置成终浓度分别为1.0 和1.5 mg/L IBA(Indole-3-butyric acid)、0.5 和1.0 mg/L NAA(1-Naphthaleneacetic acid)的营养液，最后用1 mol/L的NaOH溶液调pH至5.8。将蛭石放入灭菌袋中，和营养液一起放入高压灭菌锅中，121℃ 灭菌 21min，再于洁净的地方放凉。开紫外前提前将组培盒和蛭石转移至在超净工作台中消毒。先向无糖组培盒中倒入蛭石，再加入营养液至蛭石上方出现一条水线。切去山桃组培苗茎基部的愈伤组织，保留所有叶片，插入蛭石中。每个处理设置三个重复，每个重复接种10棵苗。生根处理30 d后，打开盒盖统计山桃的生根率和平均生根数.用根系分析仪分别扫描每个重复的根系，再用分析软件分析出各项根系指标，用Excel计算每株山桃的根长、平均根直径、根体积和根表面积。

1.2.2 蛭石初始含水量的筛选 在筛选出生长素种类及浓度的基础上，配制生长素为1.0 mg/L IBA，其他物质同上的营养液，向蛭石中加入营养液至蛭石含水量分别为 65%、70%、75%，灭菌放凉后接种山桃组培苗。每个处理设置三个重复，每个重复接种10棵苗。统计方法如上。

1.2.3 山桃无糖生根不同时期根系和地上部的生长发育情况 配制生长素为1.0 mg/L IBA，其他物质同上的营养液。由于生根培养时间较长，后期山桃苗易缺水干枯，向蛭石中加入营养液至蛭石初始含水量为 75%，灭菌放凉后接种山桃组培苗。挑选茎秆粗壮、叶片多而浓绿的山桃组培苗接种到蛭石上，分别培养至 0 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d、35 d、40 d，统计山桃苗的根系生长情况和地上部生长情况，根系生长指标统计如上，山桃苗地上部统计指标包括山桃组培苗株高(茎基部到生长点距离)、叶片数和茎粗。每个处理三个重复，每个重复6棵苗。

1.3 环境控制参数

无糖培养系统购自上海离草科技有限公司，主要包括组培架、无糖组培盒、二氧化碳气瓶、气泵、LED 灯、控制器等。为防止二氧化碳逃溢，设置一块密闭避光的空间作为无糖组培室，配置空调调节培养间温度。无糖组培盒的CO2浓度为1 000±100 mL/L，组培室温度为 23±2℃，空气湿度为 50±5%。接种后先密封通气孔遮光，3 d后见光并通入气体CO2。CO2气阀在第4天打开1/2，两周后全开。光周期为光照 16 h/黑暗8 h。无糖组培盒上方30 cm 处单根LED灯管的光照度为37～40 umol/(s·m2)，共设置四根灯管。第4天打开中间的一根 LED灯管，之后每隔一周开一根灯管。

1.4 指标测定与数据统计

生根率=生根苗数/总苗数；平均生根数=总生根数之和(主根数+1 cm以上的侧根数)/总苗数；含水量=营养液重量/营养液与干蛭石的总重量；根长、根系直径、根体积、根表面积由根系扫描仪扫描根系，并通过扫描分析软件分析，最后汇总计算得到。根系扫描仪型号为EPSON 12 000XL，扫描灰度为8位，DPI为400，扫描软件为espon scan2，分析软件为WinRHIZO pro。利用直尺测得株高；叶片数为每株山桃上的展开叶的叶片数；每株苗子的粗度为山桃苗茎杆上中下三个点的平均粗度，由美耐特牌游标卡尺测得。使用 Microsoft Office Excel 2019 和 IBM SPSS Statistics 22软件进行数据处理和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同生长素种类及浓度对山桃根系生长发育的影响

生长素的种类及浓度对植物根系的诱导和发育非常重要，生根的好坏主要表现为生根率和根系质量。生根数、根长、根系直径和根系体积越大，植物根系越发达；根系表面积越大，根系越舒展。从图1 可以看出，当培养基中添加 IBA 浓度为1.0 mg/L 时，山桃试管苗的生根效果最好，生根率、生根数显著高于其他处理，根体积最大。当NAA 浓度为0.5mg/L时，山桃的根长显著高于其他处理，根表面积最大，但生根数和根系直径最小，根系发育不良。1.5 mg/L IBA处理的山桃虽然根系直径最大，但生根率低，根长较短，不适宜诱导山桃生根。1.0 mg/L NAA处理的山桃生根效果最差，根长、根体积和根表面积显著低于其他处理，生根数低。综合来看，1.0 mg/LIBA处理的山桃组培苗生根率高，根系质量好，最适宜诱导山桃的无糖生根。

注：图中柱状图上的小写字母表示在p < 0.05水平差异显著。

2.2 不同初始含水量对山桃无糖生根的影响

从表1 可以看出，蛭石初始含水量为65%时，山桃试管苗的生根率和根长显著高于其他处理，根体积和根表面积最大。蛭石初始含水量为70%时，根系的生根数和根系直径显著高于其他处理，但该处理生根率较低，根长和根系表面积最低。初始含水量为75%时，山桃的生根率最低，生根数和根系表面积与70%的含水量相似，生根效果不理想。三个处理的根系体积无显著差异。适度的干旱有利于山桃根系的诱导和发育，蛭石初始含水量为65%时最适宜诱导山桃根的形成，但含水量为70%时山桃生根数多，根系直径粗，侧根比前者多，根系更发达。综合来看，初始蛭石含水量为65%～70%时无糖生根效果最好。

表1 不同含水量下山桃的根系发育情况

2.3 山桃无糖生根培养期间根系的生长发育情况

无糖组培生根第10天 能观察到锥形、白色偏透明的根，之后根慢慢增粗变长，主根上渐渐长出侧根。前20 d根系白嫩粗短，增长缓慢；20 d后根系迅速伸长，主根表皮发褐，根尖和侧根白亮，生长迅速。山桃在无糖环境中的生根率在前15d 迅速升高，在第25天达到100%，之后生根率一直是100%。山桃的平均生根数15～25 d 增长速率最快，在第35天达到最大。山桃根的平均直径初期升高，在第25天后逐渐下降。每株苗的总根体积在40 d 内持续上升，在第20～25天增长最快。根表面积的曲线与根长相似，第40天达到最长，其中根长在30 d 后以相同的速率加快伸长，根表面积20～25 d 和 30～40 d 增长最快。综合来看，山桃无糖培养时间以35～40 d为宜。

2.4 山桃无糖生根培养期间地上部的长势

山桃地上部在接种后的前20 d叶色深绿，茎秆柔嫩；20 d后叶子颜色略微泛黄。从图3可以看到，山桃茎基部到生长点高度在无糖生根处理的40 d内，随时间变化呈波动曲线，但无明显增长。平均茎粗的变化情况与茎基部到生长点高度相似，也无明显增长。叶片数前期略有增加，后期叶片逐渐脱落，第40天 叶子掉落严重，不适合移栽。结合根系的生长情况，无糖生根培养时间以35 d为宜。

图3 无糖生根不同时期山桃苗地上部的长势

3 讨论

3.1 生长素种类及浓度对山桃生根的影响

不同桃品种之间的生根培养条件差异较大[23]。闫文义[24]研究发现将桃杂交优系 2-7接种于1/2 MS+0.5 mg/L IBA 的培养基中10 d 后转入无生长素的 1/2 MS培养基中生根效果较好，生根率达 90.60%。张恒涛等[25]发现豫农矮砧 1 号的最佳浓度组合是 1.5 mg/L IAA + 1.0 mg/L IBA。IBA 浓度为 1.0 mg/L 时，山桃试管苗的生根效果最好，生根率为95.83%，根系粗壮[26]，与笔者实验结果一致。笔者实验还发现当NAA 浓度为0.5 mg/L时，虽然山桃生根率和生根数较低，但根长和根表面积显著高于1.0 mg/L IBA的处理。有糖生根中，有的桃组培苗直接生根，有的先产生愈伤组织，后从愈伤组织中长根[27]。无糖生根处理中所有的山桃都不产生愈伤，大部分根分布在茎基部周围，少部分根长在底部切口处。可能是无糖环境中营养物质都吸附在蛭石中，不容易吸收，初期较低的CO2浓度和光强使山桃的光合作用降低，营养缺乏使山桃不产生愈伤。

3.2 蛭石含水量对无糖生根的影响

不同物种的根系生长情况随含水量的变化表现不一致。土壤含水量在土壤萎蔫含水量至田间持水量之间时，杨树插穗的生根率和根系长度随着含水量的增加而增长；超过田间持水量时，插穗的生根率和根系长度随着含水量的上升降低少[28]。而笔者实验中含水量由65%上升到75%的过程中，山桃无糖组培苗的生根率持续降低。说明在适宜的含水量范围内，一定程度的干旱能刺激根系的产生。杨树插穗生根实验中，含水量低时，生根率低，淹水和中等供水处理下生根率高且相差不大。根生物量上，淹水处理低于低供水处理，低供水处理低于中等供水处理[29]。在土壤含水量较高的条件下，头花蓼扦插生根率高，生根数量多，根系粗壮；土壤较为干旱的条件下，头花蓼扦插生根率低，生根数少，根长最长，但根系比较细弱[30]。而笔者实验中蛭石初始含水量为65%时，山桃的生根率最高，根系体积和表面积最大，根长最长，生根数较少，总根量最大；含水量为70%，生根率较低，生根数最多，根系直径大，根系质量最好；含水量为75%时，生根率最低，生根数低，根长较短，根系质量差。

3.3 不同生根处理时期山桃根系以及地上部的差异

从图2可以看出，根长与根表面积的变化曲线相似，都是前期增长缓慢，30～40 d 加快增长。20～25 d 根系明显增多，根表面积在此期间增长速率加快。接种后 30～40 d，虽然根体积变化不大，但根长和根表面积却迅速增加，这可能是因为30 d 后主根增长量小，但侧根和毛细根迅速出现和伸长。山桃根系的平均直径前期升高是由于根系变粗，后期由于根尖迅速伸长，侧根大量增加，平均直径降低。根在变粗的同时逐渐伸长，前期变粗的速度高于伸长的速度，平均直径逐渐升高。后期主根逐渐伸长，根尖处较细，并长出了更为细弱的侧根，平均根直径逐渐降低。

图2 山桃无糖生根不同时期根系的生长发育情况

无糖培养促使植物由兼养型转向自养型[11]，减少植物形态结构发育差，生理功能弱等问题[12]。组培苗一般呈长条状，由主茎和几组叶片组成，茎叶娇嫩且呈亮绿色，根部有少量黑色须根[31]。山桃地上部在接种后的前20 d叶色亮绿，茎秆柔嫩，与组培生根状态的山桃苗相似；20 d后叶子增大，叶缘处泛黄，山桃苗的生理状态可能发生了改变，对环境的适应能力增强。与琼脂培养基相比，蛭石含水量较低，且下降迅速。山桃在生根过程中需要大量的营养和水分，无糖生根后期蛭石含水量过低，营养缺乏。前期叶片数量的增加，很可能是茎尖处的幼叶成长为功能叶导致。山桃在无糖组培诱导生根期间除了叶片增大外，其他地上部无明显生长，且第40天时落叶严重。生根处理35 d 时，根系发育良好，而且地上部叶片较多，适合移栽。

与一般组培技术相比，无糖生根对外植体的要求较高，如茎叶要粗壮，需要具有进行光自养生长的叶面积等[12]，苗子茎秆过细过短、叶子过少，都不利于无糖生根。观察不同时期山桃的根系和地上部生长状况时，由于生根培养时间较久，后期苗子可能因水分和营养缺乏而枯死，因此含水量设置为75%。尽管筛选含水量时发现过高的含水量不利于山桃生根，但含水量为75%的情况下第25天时山桃的生根率就达到100%。生长素筛选和含水量筛选中山桃的生根率和根系质量效果较差，原因可能所用的山桃组培苗质量较差。随着生根条件和环境控制的逐步完善，山桃的生根率和生根质量将进一步提升，为实现桃苗木繁殖的规模化、工厂化生产提供了更大的可能。

4 结论

①山桃在1.0 mg/L IBA中生根情况最好，生根率为90%，平均生根数为3.6条；0.5 mg/L NAA的生根效果次之。②山桃在含水量为65%的蛭石中生根率最高，平均根长、根体积和根表面积均为最大；在含水量为70%的蛭石中平均生根数、根直径最高，适宜山桃无糖生根的蛭石含水量为65%～70%。③山桃组培苗第35天最适合移栽。无糖生根能明显改善山桃组培苗的生根情况，生根率和平均生根数显著提高，苗子生长健壮，根系发达，周期短，适宜在生产中推广使用。