硼替佐米对裸鼠人宫颈癌SiHa细胞移植瘤作用的研究

[摘 " 要] " 目的：探讨硼替佐米对裸鼠人宫颈癌SiHa细胞移植瘤生长的作用及其与Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）、信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）表达的关系。方法：建立裸鼠人宫颈癌SiHa细胞移植瘤模型，成瘤后随机分为对照组和给药组，每组8只。观察裸鼠体质量变化及移植瘤体积。干预结束后处死裸鼠，剥取瘤体称重，计算抑瘤率。将肿瘤组织行HE染色作病理观察，RT-PCR检测肿瘤组织JAK2、STAT3基因表达，Western blot印迹法检测肿瘤组织中JAK2、STAT3总蛋白及磷酸化的JAK2、STAT3蛋白表达。结果：（1）干预前及干预2周后两组裸鼠体质量无明显差异，但在干预后3周及4周给药组裸鼠体质量小于对照组（均P＜0.05）。（2）干预后各时间段给药组肿瘤体积小于对照组（均P＜0.05），给药组抑瘤率为21.4%。（3）对照组中肿瘤细胞侵袭结缔组织、脂肪组织区域，给药组中肿瘤组织与结缔组织、脂肪组织之间边界完整、规则；（4）两组JAK2和STAT3基因表达的差异无统计学意义（Pgt;0.05）。（5）两组JAK2和STAT3总蛋白表达量的差异均无统计学意义（P＞0.05），但给药组磷酸化JAK2和STAT3蛋白表达量低于对照组（均Pgt;0.01）。结论：硼替佐米能抑制宫颈癌SiHa细胞移植瘤的生长及侵袭，其机制可能通过抑制磷酸化JAK2和STAT3蛋白表达，降低JAK2/STAT3信号通路活性。

[关键词] " 硼替佐米；SiHa细胞；裸鼠；移植瘤；Janus激酶/信号转导与转录激活因子信号通路

[中图分类号] " R737.33 [文献标志码] " A [DOI] " 10.19767/j.cnki.32-1412.2024.06.002

Effect of Bortezomib on human cervical cancer SiHa cell transplanted tumor in nude mice

ZHANG Dandan1， YAO Jia1， WANG Yan1， LIU Chun2

（1Department of Obstetrics and Gynecology， the Second People’s Hospital of Nantong， Jiangsu 226002;

2Experimental Animal Center of Nantong University）

[Abstract] " Objective： To investigate the effect of Bortezomib on human cervical cancer SiHa cell transplanted tumor in nude mice and its relationship with Janus kinase 2（JAK2） and signal transducer and activator of transcription 3（STAT3） expression. Methods： The model of human cervical cancer SiHa cell transplanted tumor in nude mice was established， and the mice were randomly assigned into the control group（n=8）， and the administration group （n=8）. The changes of body mass and transplanted tumor volume in nude mice were monitored. The nude mice were sacrificed at the end of trial， and the tumors were removed for calculation of tumor inhibition rate. The tumor tissues were stained with HE. The gene expressions of JAK2 and STAT3 were detected by RT-PCR. The protein expressions of JAK2， STAT3， phosphorylated JAK2， and phosphorylated STAT3 were determined by western blot. Results：（1） There was no significant difference in weight of nude mice between the two groups before and after intervention 2 weeks， but the weight of nude mice in the administration group was significantly lower than that in the control group at 3 and 4 weeks after intervention （Plt;0.05）; （2） The tumor volume of the administration group was significantly smaller than that in the control group （P＜0.05）， and the tumor suppression rate in the administration group was 21.4%; （3） In the control group， tumor cells invaded the region of connective tissue and adipose tissue. But in the administration group， the boundary between tumor tissue and connective tissue， adipose tissue was complete and regular; （4） There was no significant difference in the gene expression of JAK2 and STAT3 between the two groups （Pgt;0.05）; （5） There was no significant difference in the protein expression of total JAK2 and STAT3， but the protein expression of phosphorylated JAK2 and STAT3 in the administration group was significantly lower than that in the control group （Pgt;0.01）. Conclusion： Bortezomib can "inhibit the growth and invasion of human cervical cancer SiHa cells transplanted tumor in nude mice， which may reduce the activity of JAK2 /STAT3 signaling pathway by inhibiting the expression of phosphorylated JAK2 and STAT3 proteins.

[Key words] " Bortezomib; SiHa cell; nude mice;transplanted tumor; JAK-STAT signaling pathway

女性恶性肿瘤中宫颈癌发病率仅次于乳腺癌，我国每年新发宫颈癌约13万例，死亡约3万例，特别是晚期患者疗效较差，预后不良。硼替佐米（Brotezomib，BTZ）通过泛素-蛋白酶体途径下调目的蛋白，抑制细胞增殖、促进调亡、阻止新生血管生成，从而发挥抗癌作用[1]。此前实验证明，硼替佐米对宫颈癌SiHa细胞具有抑制作用[2]。本研究建立裸鼠宫颈癌SiHa细胞模型，探讨硼替佐米对宫颈癌治疗的可行性，为临床治疗提供新思路。

1 " 材料与方法

1.1 " 材料 " 人宫颈癌SiHa细胞株由南通大学附属医院妇产科实验室赠送。SPF级BALB／c雌性裸鼠，3周龄，体质量13～15 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物生产许可证：SCXK（沪）2012-0002，合格证序号：0267545。裸鼠饲养在南通大学实验动物中心SPF级屏障环境内，温度（22±2）℃，相对湿度40%～70%，噪音＜60 dB，工作照度200 lx，动物照度18 lx，昼夜明暗交替时间12 h/12 h。喂饲无菌颗粒饲料，饮水为自来水瓶装后高压灭菌。

1.2 " 主要试剂 " Trizol总RNA提取液（美国Invitrogen公司）、异丙醇（上海生工生物技术工程有限公司）、DEPC（sigma公司）、RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche公司）、WB marker（上海碧云天生物技术有限公司）、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）、Tris（Bio-Rad）、Gly（Bio-Rad）、PMSF（BBI）、Tween-20（上海时代生物科技有限公司）、Rabbit anti-GAPDH antibody（Santa Cruz公司）、Rabbit anti-BTG1 antibody（Proteintech公司）、Goat Anti-Rabbit IgG，HRP-linked Antibody（Cell Signaling公司）、Western一抗稀释液（海门市碧云天生物科技公司）、Western二抗稀释液（海门市碧云天生物科技公司）、SDS（上海生工生物技术工程有限公司）。

1.3 " 实验方法

1.3.1 " 细胞培养：采用含10％胎牛血清的DMEM高糖完全培养基培养SiHa细胞，置于5％CO2、饱和湿度、37 ℃培养箱内。取对数生长期细胞，磷酸盐缓冲液制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×107/mL，接种裸鼠。

1.3.2 " 裸鼠移植瘤模型建立：在严格的无菌操作条件下，于裸鼠左侧腋窝中部外侧皮下接种0.2 mL SiHa细胞悬液，约含2×106个细胞。接种后严密观察裸鼠一般状态，肿瘤部位有无出血和破溃。以皮下结节直径达10 mm×10 mm为成瘤标准。

1.3.3 " 实验分组及干预方案：待移植瘤达到成瘤标准后，将裸鼠称重后以随机数字表法分成给药组和对照组，每组8只。给药组小鼠腹腔内注射硼替佐米，1.5 mg/kg；对照组小鼠腹腔内注射等量生理盐水。每周注射2次，共4周。

1.3.4 " 病理检查：干预结束后断颈处死裸鼠，剥离肿瘤，测量肿瘤质量和直径。取肿瘤组织置于4%中性甲醛固定，取材、脱水、透明、石蜡包埋、切片脱蜡，HE染色、封片，光镜下进行形态学观察。

1.3.5 " 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测移植瘤JAK2、STAT3基因表达：（1）提取RNA：使用Trizol法提取移植瘤组织中总RNA，测量总RNA浓度和OD260/OD280比值，选择比值在1.8～2.0之间的标本用于逆转录合成cDNA。（2）逆转录：于RNase-free离心管中配制RNase free ddH2O 16 μL、4×gDNA wiper Mix [4×gDNA wiper Mix是一种试剂，可以彻底去除残留的基因组DNA污染]4 μL、总RNA 1 μL，移液器轻轻吹打混匀，42 ℃水浴2 min。逆转录体系：5×HiScript II qRT SuperMix II 4 μL、第一步反应液16 μL。逆转录反应条件：55 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。（3）RT-PCR：反应体系包括cDNA后产物1 μL，AceQ■ qPCR SYBR■ Green Master Mix（High ROX Premixed）10 μL，上下游引物各0.4 μL，灭菌蒸馏水加至总体积为20 μL。反应条件：预变性95 ℃ 5 min，循环反应95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40个循环；溶解曲线95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。引物全长序列见表1。

1.3.6 " Western blot法检测Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）、信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）总蛋白及磷酸化JAK2、STAT3蛋白表达：将小鼠肿瘤组织剪碎，裂解，研磨至均浆，摇床上冰浴30 min，12 000 r/min离心15 min，取上清。BCA法测定蛋白浓度，5×SDS上样缓冲液稀释至相同浓度，煮沸5 min，离心取上清。采用12.5%SDS-PAGE胶，20 mA/胶恒流电泳120 min，100 V恒压转膜35 min。室温下5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1 h，α-synuclein（1∶1 000稀释）、TH（1∶800稀释）和β-actin（1∶5 000）抗体4 ℃孵育过夜，次日山羊抗兔/鼠HRP二抗室温孵育1 h，ECL显影，采用天能化学发光扫描仪对PVDF膜进行扫描。利用Image J软件分析条带吸光度，GraphPad 6.0软件作图分析。

1.4 " 观察指标 " （1）肿瘤移植前后裸鼠体质量变化。（2）移植瘤体积和抑瘤率：肿瘤移植后每3 d用毫米游标卡尺测量肿瘤长径（a）、短径（b），单位cm，保留一位小数。肿瘤体积（cm3）＝a×b2×π/6，绘制肿瘤生长曲线。根据干预结束后移植瘤质量计算抑瘤率，抑瘤率＝（对照组平均瘤质量－给药组平均瘤质量）/对照组平均瘤质量×100％。（3）裸鼠肿瘤组织病理检查。（4）JAK2和STAT3转录水平。（5）JAK2、STAT3总蛋白及磷酸化JAK2、STAT3总蛋白。

1.5 " 统计学处理 " 采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。计量数据以■±s表示，两组间比较应用SNK检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 " 结 " " "果

2.1 " 两组裸鼠体质量比较 " 干预前及干预2周后两组裸鼠体质量差异均无统计学意义（P＞0.05），干预3周及4周后给药组裸鼠体质量小于对照组（P＜0.05）。见表2。

2.2 " 两组干预后移植瘤体积比较及给药组抑瘤率 " 干预后1 W、2 W、3 W、4 W给药组移植瘤体积小于对照组（均P＜0.05），见表３。对照组肿瘤生长曲线较陡直，生长幅度较大，给药组肿瘤生长幅度缓慢（图1）。干预结束后移植瘤质量对照组为2.8±0.2 g，给药组为2.2±0.2 g，给药组抑瘤率为21.4%。

2.3 " 裸鼠肿瘤组织病理观察 " 对照组肿瘤细胞侵袭结缔组织和脂肪组织区域，给药组肿瘤组织与结缔组织、脂肪组织之间边界完整、规则。见图2。

2.4 " RT-PCR检测结果 "两组肿瘤组织JAK2和STAT3转录水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

2.5 " Western blot检测结果 " 两组肿瘤组织JAK2和STAT3总蛋白表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；给药组磷酸化JAK2和STAT3总蛋白表达量低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见图4。

3 " 讨 " " "论

不同病理类型和分期的子宮颈恶性肿瘤有多种治疗方法，对于复发性宫颈癌和晚期宫颈癌，放疗效果较好，临床运用广泛[3-4]。但有研究显示，盆腔放疗的成功率低于70%，且单纯性放疗不能明显提高患者远期生存率，如何提升宫颈癌患者远期生存率是临床研究的重点[5-6]。

高危型人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持续感染是导致宫颈癌发生的关键因素[7]。HPV早期编码区E6、E7基因是病毒癌基因，其表达产物E6、E7蛋白是致癌的关键[8-9]。HPV E6蛋白开启泛素-蛋白酶体途径，使抑癌蛋白p53过度降解，导致细胞突变，诱发宫颈癌。蛋白酶体抑制剂通过与蛋白酶体内的酶解活性位点结合，阻扰相关蛋白的降解。很多研究证明，蛋白酶体抑制剂可明显下调多种恶性肿瘤的活性[10]。硼替佐米可以选择性结合蛋白酶体活性位点的苏氨酸，抑制蛋白酶体26 S亚单位的蛋白酶活性。26 S蛋白酶体是细胞内一种大的蛋白质复合体，通过泛素-蛋白酶体途径参与多种蛋白质的降解[1]。硼替佐米通过影响泛素-蛋白酶体途径影响细胞内的信号串联和传导，引起与细胞增殖分化相关蛋白发生代谢紊乱，最终促使细胞凋亡。有研究发现，泛素化可以影响乳腺癌细胞在裸鼠中的肿瘤形成，控制乳腺癌的发生发展[11-12]。本研究结果显示，给药组肿瘤体积、质量小于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；相较于对照组，给药组肿瘤组织与结缔组织、脂肪组织之间边界完整、规则，说明硼替佐米可明显抑制SiHa细胞移植瘤的生长、侵袭，控制宫颈癌的发生发展。

Janus激酶/信号转导与转录激活因子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）信号通路由Janus激酶、信号转导和转录活化因子构成，属于进化保守型信号通路，参与细胞增殖、分化、凋亡以及免疫调节等众多生物学过程。JAK2是JAK家族中的主要调节因子，是STAT3的上游激酶。在非激活状态下STAT3位于细胞质中，当JAK2被激活后，使STAT3磷酸化，磷酸化STAT3由细胞质转运入细胞核内，调节相关基因表达，参与肿瘤生长和免疫逃逸[13-14]。JAK2/STAT3是细胞内调控转录的一条关键通路，超过70%人类肿瘤中STAT3异常活化，且与患者预后密切相关[15-16]。JAK/STAT信号通路与甲状腺癌[17]、卵巢癌[16]、前列腺癌、口腔鳞状细胞癌等多种恶性肿瘤有密切关系。本研究RQ-PCR检测结果显示，两组JAK2和STAT3基因表达的差异无统计学意义（P＞0.05），说明硼替佐米并非在转录水平抑制JAK2和STAT3。Western blot检测结果显示，两组JAK2和STAT3总蛋白表达量的差异均无统计学意义（P＞0.05），但给药组磷酸化JAK2和STAT3蛋白表达水平低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01），提示硼替佐米可能通过抑制磷酸化JAK2和STAT3蛋白的表达，降低JAK2/STAT3信号通路的活性。

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[收稿日期] 2024-11-29

（本文编辑 " 王晓蕴）