不同染色体异常类型患者的囊胚整倍性及妊娠结局

宋雪梅，袁振亚，严为巧，李玉雯，朱彤，黄晓洁，袁牧

(徐州市妇幼保健院生殖医学中心,徐州 221009)

世界范围内,不孕症的发生率为8%～12%[1],不孕不育门诊除了因常见的女方输卵管、盆腔因素,男方特发性少弱畸形精子症、梗阻性无精子症等原因来就诊的患者外,因染色体异常就诊的患者也占一定比例。染色体异常包括染色体结构异常和数目异常。染色体结构异常以平衡易位和罗氏易位最为多见,染色体数目异常包括13-三体、18-三体、21-三体及性染色体数目异常等。不孕不育门诊染色体数目异常患者的临床表现以特纳综合征、克氏综合征、超雄综合征和超雌综合征等最为常见[2]。染色体异常在自然流产中占比20%～50%[3],此外,也是新生儿出生缺陷最常见的类型之一[4]。胚胎植入前遗传学检测(PGT)技术通过帮助患染色体畸变的患者在胚胎植入前进行检测,挑选遗传学正常的胚胎种植,从而避免遗传缺陷患儿的出生。由于染色体数目异常和染色体结构异常的致病性差异较大,本研究的目的是探讨不同染色体异常类型行PGT检测后的助孕结局及妊娠结局。

一、对象与方法

1.研究对象：回顾分析2020年1月至2022年11月在我中心行PGT检测的患者临床资料。

纳入标准：(1)女方年龄≤40 岁;(2)夫妻一方为染色体结构或数目异常携带者。排除标准：(1)单基因病;(2)内分泌疾病,如多囊卵巢综合征、高泌乳素血症等。

本研究共纳入80个染色体异常周期。根据染色体异常类型不同分为2组：染色体结构异常组(n=72)和染色体数目异常组(n=8)。纳入本研究的患者均已签署知情同意书。

2.体外受精及囊胚培养：根据患者自身情况选择拮抗剂方案或改良长方案促排卵。当≥2个主导卵泡直径达18～20 mm时,HCG扳机后34～36 h行B超引导下穿刺取卵,将卵丘-卵母细胞复合物放入培养箱中培养4 h后行卵胞浆内单精子注射(ICSI),受精后放入G-TLTM一步式培养液(Vitrolife,瑞典),紧接着放入时差成像培养箱(Embryo Scope+;Vitrolife,瑞典)中培养至D5/D6囊胚阶段。

3.囊胚活检、PGT和胚胎移植：囊胚评分采用Gardner评分系统[5],D5/D6囊胚内细胞团和滋养外胚层细胞评分≥B级的囊胚为优质囊胚,本中心将≥3BC或3CB的囊胚评为可用囊胚。取D5/D6囊胚滋养外胚层3～5个细胞,囊胚随即行玻璃化冷冻。

PGT主要分为两步[6]：(1)活检细胞全基因组扩增后二代测序筛选整倍体胚胎;(2)通过易位断裂点上下游单核苷酸多态性位点识别第一步获得的整倍体胚胎的易位携带状态。

基于PGT检测报告和胚胎评级,将≥3BC或3CB的整倍体囊胚(易位携带/易位不携带)进行移植,优先移植不携带染色体易位的整倍体高评分囊胚。

4.妊娠结局判定及产前诊断：单囊胚移植后4～6周后行B超检查,若宫内见孕囊及原始心管搏动者判定为临床妊娠。孕中期(18～22周)行羊水穿刺,对胎儿的染色体核型进行进一步复核确认。

5.观察指标：比较各组患者的助孕结局和妊娠结局。助孕结局包括2PN率、D3优质胚胎率(D3优胚率)、囊胚形成率、活检整倍体囊胚易位染色体携带率、可用囊胚形成率和囊胚整倍体率;妊娠结局包括临床妊娠率、流产率和活产率。

2PN率=2PN数/总获卵数×100%;D3优胚率=D3优质胚胎数/2PN数×100%;囊胚形成率=囊胚形成总数/2PN数×100%;可用囊胚形成率=可用囊胚数/2PN数×100%;囊胚整倍体率=整倍体囊胚数(正常核型或易位核型)/活检囊胚数×100%;整倍体囊胚易位染色体携带率=易位携带的整倍体囊胚数/活检整倍体囊胚数×100%;临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%;流产率=流产周期数/移植周期数×100%;活产率=活产分娩周期数/移植周期数×100%。

二、结果

1.染色体结构异常患者的基本情况、助孕结局和妊娠结局：72个染色体结构异常周期根据染色体易位类型不同分为两个亚组：即平衡易位组(n=52)和罗氏易位组(n=20)。

两亚组一般情况比较：两亚组间年龄[(29.40±4.68)岁 vs.(30.60±3.66)岁]、不孕年限[(3.64±2.29)年 vs.(3.20±2.78)年]和子宫内膜厚度[(10.38±1.64) mm vs.(11.21±2.40)mm]比较均无显著差异(P>0.05)。

两亚组实验室指标比较：两亚组间2PN率、D3优胚率、囊胚形成率和整倍体囊胚易位染色体携带率比较均无显著差异(P>0.05);平衡易位组的可用囊胚形成率显著低于罗氏易位组(P<0.05),平衡易位组的囊胚整倍体率亦显著低于罗氏易位组(P<0.01)(表1)。

表1 不同染色体结构异常患者实验室指标比较(%)

两亚组妊娠结局比较：截至发稿时,共35个因染色体结构异常行PGT的周期进行了胚胎移植,包括平衡易位(n=25)和罗氏易位(n=10)。两亚组间临床妊娠率、流产率和活产率比较均无显著差异(P>0.05)(表2)。

2.染色体数目异常患者的基本情况和妊娠结局：本研究纳入染色体数目异常患者共6例患者(8个周期),其中5、6号患者各有2个不同取卵周期。

5例患者(1、2、3、4、5号患者)染色体核型为47,XXY,均有整倍体囊胚移植,截至发稿时3例患者(1、3、4号患者)各分娩1名健康新生儿,5号患者仍在妊娠随访中;6号患者染色体核型为47,XYY,t(12;18)(p11.2;p11.3),共活检10枚囊胚,其中4枚为整倍体囊胚(3枚正常核型、1枚携带易位染色体核型),移植1枚正常核型整倍体囊胚后活产1女婴(表3)。

表2 不同染色体结构异常患者妊娠结局比较(%)

表3 染色体数目异常患者的基本情况和妊娠结局

三、讨论

染色体异常患者在育龄期往往会遇到不育或自然流产的问题,与正常核型夫妇相比会产生更多不平衡配子,PGT是改善染色体异常患者生育结局的有效手段[7]。自1990年Handyside等[8]首次通过PCR技术为携带X连锁隐性遗传病患者筛选女性胚胎并获得健康新生儿以来,PGT技术被广泛应用于临床。近年来随着分子遗传学检测技术的进步和人类基因组计划的完成,以二代测序为代表的PGT技术通过对胚胎染色体数目异常、结构异常和有病理意义染色体微小片段插入、缺失与重复进行检测,挑选遗传学正常的胚胎植入子宫,从源头上切断遗传性缺陷的胚胎种植[9]。

平衡易位约占新生儿出生比例的0.2%,是不孕不育夫妇中最常见的染色体结构异常类型,在配偶染色体结构正常的情况下理论上平衡易位患者受精可形成18种类型的配子,其中1/18为完全正常配子、1/18为易位携带的配子、16/18为异常配子[2]。罗氏易位可分为同源易位和非同源易位,其中同源易位携带者受精后可形成2种异常类型的配子,非同源易位携带者理论上可形成6种类型的配子,其中1/6为完全正常的配子、1/6为易位携带的配子、4/6为异常配子[2]。本研究结果显示,平衡易位和罗氏易位患者形成的囊胚整倍体率远高于理论值,推测可能的原因是由于有一部分异常配子在囊胚形成过程中被自然淘汰所导致的。

Beyer等[10]研究发现,无论是相互易位还是罗氏易位携带者,其形成的D3卵裂期胚胎的正常/平衡胚胎的比例显著低于D5/D6囊胚期胚胎,说明选择囊胚期胚胎进行活检除了可以减少对囊胚内细胞团细胞发育的影响外,还可以将发育潜能差的异常配子剔除。庞敏等[11]研究发现,相互易位和罗氏易位患者的囊胚整倍体率分别为29.2%和46.9%,但组间比较无显著差异(P>0.05);Boynukalin等[12]研究发现,染色体易位的长短、断点位置与囊胚整倍体率无关(P>0.05)。孙庆云等[13]和Nakano等[14]研究结果显示,平衡易位患者囊胚整倍体率与罗氏易位患者相比显著降低(P<0.05),分析原因可能与不同染色体结构异常类型所产生的正常配子比例不同有关。本研究也得出了相同的结果。

染色体易位携带者虽然表型正常,但往往在生育期会面临不孕不育、胚胎发育阻滞和反复自然流产等问题,研究人员利用等位基因映射识别技术可以准确识别胚胎染色体易位携带状态,通过PGT技术使其下一代成功摆脱因染色体易位引起的不良生育风险[6,15-17],阻断染色体易位在家族传递。本研究结果显示,平衡易位和罗氏易位患者行PGT后再行单囊胚移植,两组间临床妊娠率、流产率和活产率比较均无显著差异(P>0.05),这与Nakano等[14]和黄秋香等[15]的研究结果一致。Yuan等[16]研究发现,对罗氏易位和平衡易位夫妇而言利用PGT技术排除胚胎染色体异常的因素后,其流产率得以极大改善。此外,有研究以自然怀孕后流产≥3次的染色体平衡易位/罗氏易位的患者为研究对象(192例),PGT后解冻周期胚胎移植组相较于自然妊娠组,流产率显著降低和累积妊娠率显著升高(P<0.05)[18]。

克氏综合征是男性不育中常见的染色体数目异常类型,以47,XXY核型最为常见,占出生男孩0.1%,通常在孩童期无特殊表现,青春期表现为小睾丸,睾丸发育不良导致男性表现为无精子症或严重少精子症[2]。大部分47,XYY综合征患者可正常生育,部分患者睾丸发育不良导致无精子症[19-20]。2018年,胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识[21]认为,47,XXY因其生育子代染色体异常风险增加可酌情考虑行植入前遗传学诊断(PGD),而47,XYY产生性染色体异常几率较低则不建议行PGD。本研究中5名47,XXY患者的6个PGT周期未涉及性染色体异常的胚胎,这与先前的研究结果[22-23]一致。此外,童婧等[24]研究发现,非嵌合型克氏综合征患者的囊胚整倍体率为60.0%,所有活检的胚胎均未涉及到性染色体异常。本研究还报道了染色体核型为47,XYY,t(12;18)(p11.2;p11.3)的患者的2个拮抗剂促排卵周期,共获4枚整倍体囊胚,其中3枚正常核型、1枚携带易位染色体(父亲)核型,说明虽然文献报道超雄患者性染色体异常风险不高[22],但临床上仍存在一定比例的性染色体异常风险。

综上所述,罗氏易位和平衡易位夫妇利用PGT技术有效阻断遗传性缺陷的胚胎种植后,妊娠结局得以极大改善,同时切断了染色体易位在家族下一代传递。47,XXY患者理论上在减数分裂产生配子的过程中会导致性染色体异常风险增加,但本研究中尚未检出涉及性染色体异常的胚胎。由于样本量少,47,XXY对子代染色体异常风险的影响仍需要临床多中心大样本随访数据的支持。