微生物感染在慢性子宫内膜炎致生殖障碍中的机制进展

王静怡，袁莹，邹志玲，陈雪梅*

(1.广东医科大学,湛江 524001;2.东莞市松山湖中心医院,东莞 523326)

慢性子宫内膜炎(CE)是一种局限在子宫内膜的慢性非特异性炎症,其病理改变与内膜中微生物群的定性、定量改变有关,以子宫内膜间质浆细胞(ESPCs)浸润为主要病理特征[1]。CE患者通常无明显症状或仅有轻微临床表现,如白带异常、盆腔隐痛或性交不适等。此外,CE患者的血清炎症指标和超声影像学结果往往缺乏特异性表象,在临床首诊时易被忽略。据文献报道,CE在育龄期女性中的患病率为8%～72%不等[2]。近年来,大量研究表明,CE与女性不孕症、反复种植失败(RIF)和反复妊娠丢失(RPL)关系密切,此外CE还是影响活产和足月分娩的客观因素之一[3]。普遍认为微生物感染是CE的主要病因,CE患者普遍存在微生物感染(包括细菌、酵母菌、支原体、衣原体及病毒等),以及抗生素治疗可显著降低浸润在内膜间质的浆细胞数目并改善其妊娠结局就是最有力的临床证据[2]。微生物感染导致CE患者生殖障碍的具体机制尚不明晰。本文综述CE可能的发生、发展机制及其对女性生殖健康的影响,以期优化治疗方案进而改善生殖预后。

一、宫腔微生物感染导致子宫内膜菌群失调及代谢活动异常

传统观点由宫颈口关闭及宫颈黏液栓等生理现象推测宫腔内应是一个无菌环境。随着基因组学和微生物组学技术的发展,不少研究发现,宫腔内存在微生物菌群定植,且以乳酸杆菌占主导地位[4]。而CE是一个感染性或反应性的炎性病理过程,故任何导致内膜持续刺激的因素都有可能促进CE的发生发展。据文献报道,经期延长史、双侧输卵管积水、多次分娩史及长期放置宫内节育器均为CE的独立高危因素[5]。宫腔内微生物的来源主要有肠道及口腔等的微生物经血源传播、下生殖道微生物逆行感染、宫腔操作等。目前认为,宫腔微生物群落是一个动态微环境,其状态和组分易受多种因素的影响,如月经周期、激素水平、年龄及性行为等[6]。当宫腔微生物组成发生改变时,引起内膜环境“生态失调”,进而影响子宫内膜的状态和功能,不利于胚胎植入和妊娠维持。

有研究证实,CE患者宫腔微生物群中非乳酸杆菌的相对高丰度与体外受精失败显著相关,这提示CE患者子宫微生物群的改变可能是导致不良生殖结局的关键因素之一[7]。Chen等[8]采用高通量测序技术对112例RIF患者的子宫内膜进行转录组分析,并联合16S rRNA测序分析对比了43例RIF患者(14例CE患者和29例非CE患者)宫腔内微生物群状态,结果表明,CE和非CE患者子宫内膜微生物组成有显著差异。Liu等[9]研究发现,乳酸杆菌在CE(12例)和非CE(118例)患者的微生物群中的相对丰度中位数分别为1.89%和80.70%,且在CE患者微生物群中有18种非乳酸杆菌属类群含量高于非CE患者。以上结果均证实了CE患者子宫内膜存在异常菌群且菌群比例失调。有研究发现,叶状杆菌和鞘氨醇单胞菌在CE患者子宫内膜中呈显著高浸润性,且活跃在与碳水化合物代谢和/或脂肪代谢相关途径中[8],而另有研究发现,代谢活动对免疫细胞具有重要调节作用[10-11]。在上述研究中,CE患者子宫内膜微生物群的代谢活动主要富集在蔗糖生物合成Ⅲ途径(PWY-7347)和蔗糖生物合成I途径(SUCSYN-PWY)[8]。上述两种代谢途径与糖脂代谢相互作用,并参与T细胞和巨噬细胞的调节[10-11]。Chen等[8]研究发现,CE患者和非CE患者中CD4+T细胞和巨噬细胞的浸润程度存在显著差异。由此推测,CE患者中活跃的微生物群可能通过消耗糖脂代谢的中间产物来竞争宿主子宫内膜细胞和免疫细胞的能量物质,从而调节内膜免疫细胞的代谢活动,改变内膜微生态环境,影响胚胎的着床和早期妊娠的维持,最终引起不良生殖预后。

此外,在研究肠道微生物时,有学者指出肠道菌群代谢活动可通过调控不饱和脂肪酸次级代谢产物,干扰宿主的多条代谢通路以此参与子宫内膜异位症(EM)的发生、发展[12]。亦有学者在CE与EM相关性研究中发现,EM患者同时合并CE的概率显著高于非EM患者[2],提示EM与CE关系密切。此外,微生物感染可能也是EM患者出现CE的病因之一[13]。然而,尽管在肠道微生态相关于多数疾病进展方面的机制研究已较为广泛深入,但还未在CE中展开进一步研究。

二、微生物感染异常激活子宫内膜炎症反应

在引发CE的多种致病微生物中,以革兰阴性菌较为常见。脂多糖(LPS)又称内毒素,是革兰氏阴性菌细胞壁的重要结构成分,同时也是CE最为重要的病原相关模式分子[14]。Zhou等[15]将受LPS刺激后的牛子宫内膜上皮细胞(BEEC)进行转录组测序分析发现,LPS通过激活相关炎症通路,如Toll样受体(TLR)信号通路、NOD样受体(NLR)信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用通路信号通路、趋化因子信号通路及核因子κB(NF-κB)信号通路等,参与调控BEEC的炎症反应。另有研究发现,在CE患者和经LPS体外处理后的牛子宫内膜上皮细胞及间质细胞中促炎介质和趋化因子表达显著上调[16-17]。以上结果说明,微生物感染可介导LPS等病原相关模式分子激活以TLR、NLR信号通路为核心的炎症通路网络,启动一系列信号转导和级联反应进而导致大量促炎介质的释放,促使子宫内膜炎症微环境的形成,并最终引起CE患者内膜持续炎症应答而致不良生殖结局。

Moustafa等[18]利用经LPS处理的C57BL/6小鼠和原代人子宫内膜基质细胞实验模型探索细菌诱导内膜炎症反应致胚胎着床受损的分子机制,研究结果表明,CE引发局部炎症因子分泌模式改变,具体表现在促炎因子如白介素-1β(IL-1β)、白介素-17(IL-17)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和γ干扰素(IFN-γ)等表达上调,而抑炎因子如白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-10(IL-10)及转化生长因子β(TGF-β)等表达下调。已有研究证实,这些升高的促炎因子可通过影响细胞的迁移、增殖和凋亡,改变内膜的生化、形态及功能,阻碍蜕膜化过程,不利于胚胎着床和妊娠维持[16,19]。其中,IFN-γ和TNF-α可通过参与子宫内膜中组织重塑、血管新生等过程调控胚胎的着床[19]。已知胚胎植入、滋养细胞迁移等生理过程离不开新生血管的形成,而且妊娠早期绒毛膜血管的形成、发育及血管网络的构建是母胎物质能量交换的基础。Peretiatko等[20]对35例CE合并复发性流产患者在妊娠5～12周的绒毛膜血管形成阶段进行形态学分析发现,合并CE的复发性流产患者多表现为绒毛分化障碍及绒毛间质血管生成障碍。由此推测,CE可能通过致病菌介导LPS等病原相关模式分子诱发促炎性介质的表达上调以强化对宿主细胞的破坏作用,进一步阻碍绒毛膜新生血管的形成并干扰胚胎-胎盘血管网络的构建,使其无法为胚胎的生长发育提供充足的营养物质,导致CE患者出现反复妊娠丢失。

此外,病原相关模式分子还可通过激活TLR、T细胞受体等相关受体,调控单核巨噬细胞的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路[21]。mTOR是哺乳动物重要的代谢传感器,参与调控细胞代谢活动[14]。激活状态下的mTOR信号通路可增强糖酵解,而糖酵解增强会使免疫微环境倾向于支持效应T细胞、M1型巨噬细胞等细胞的促炎功能以及各免疫细胞的增殖、迁移行为从而增强体内促炎效应[14,22]。

三、微生物感染诱导子宫内膜免疫状态紊乱

生理状态下的人子宫内膜中存在多种具有防御功能的免疫活性细胞,包括子宫自然杀伤细胞(uNK)、巨噬细胞及T细胞等[23]。这些固有免疫和适应性免疫细胞的组分在整个月经周期中呈周期性变化,这种生理性改变在胚胎植入和妊娠早期建立母胎免疫耐受中发挥重要作用[23]。已有研究证实,宫腔微生物群与子宫内膜中多种免疫细胞间存在相互作用,由此调节内膜的免疫微环境[8]。总的来说,CE患者子宫内膜各免疫细胞的组成和状态等发生改变,具体表现为B细胞中浆细胞数目增多且浸润间质、T细胞中Th1/Th2和Th17/Treg细胞比例失衡以及CD56+CD16-NK细胞减少等[24]。

CE患者子宫内膜B细胞的变化最具代表性。正常情况下,内膜中的B淋巴细胞在总白细胞中占比不及1%,以分散或淋巴聚集物的形式主要分布在基底层[25]。CE发生时,宫腔致病微生物感染触发机体免疫应答,其产物LPS可诱导黏附分子和趋化因子,如CXC趋化因子配体1(CXCL1)、CXC趋化因子配体13(CXCL13)及E-选择素(CD62E)在子宫内膜上皮细胞中表达上调,促使循环中大量B淋巴细胞外渗和迁移,进而浸润子宫内膜功能层和基底层,甚至侵犯腺上皮和腺腔[26]。有学者认为,CE炎症的严重程度可能与浆细胞在间质浸润的数目呈正相关[27]。在某些抗原(如LPS)的刺激下,不成熟的B淋巴细胞可分化成浆细胞并产生多种免疫球蛋白抗体,主要包括IgA1、IgA2、IgG1和IgG2,又以IgG2最多[28]。这些抗体的过表达参与改变内膜免疫微环境,损害子宫内膜容受性,阻碍胚胎植入过程,与不良生殖预后密切相关。此外,Li等[29]研究发现,CE患者ESPCs周围存在CD4+T细胞的异常聚集,且随着ESPCs细胞数目增多,Th1/Th2细胞比例升高,提示B细胞和CD4+T细胞存在相互作用,但其具体作用机制尚不明了。

CD4+T细胞包括辅助性T细胞(Th)和调节性T细胞(Treg),其中Th细胞亚群又可分为Th1、Th2和Th17[30]。目前研究认为,T细胞介导的免疫平衡在建立和维持妊娠方面发挥着重要作用,其中Th1/Th2平衡是维持母胎免疫耐受的重要机制之一[31]。不少研究发现,CE患者相较于非CE患者的子宫内膜中Th1/Th2细胞比例显著升高,这提示CE患者中存在Th1/Th2细胞比例失衡现象[8,32]。Chen等[8]进一步研究发现,宫腔内微生物群的异常活动可能通过影响碳水化合物代谢和/或脂肪代谢过程,以此调节Th1/Th2的转换。不同于CE患者的免疫失调,健康女性的子宫内膜在着床期Th1/Th2平衡偏向Th1促炎免疫,而当胚胎成功着床后又以Th2抗炎免疫占优势,其相关细胞因子(如IL-4、IL-5、IL-9和IL-13)可抑制炎症以减少组织损伤,促进和维持免疫耐受而利于胚胎、胎盘发育[31]。此外,Th17/Treg细胞介导的免疫平衡也在妊娠过程中发挥重要作用。Treg细胞可减少母体对胚胎的免疫排斥,具体通过细胞间的直接接触效应及释放IL-10、TGF-β等抑炎因子,从而对免疫耐受有正面生物学效应;而且,母胎界面的Treg细胞亦可抑制Th1、Th17等细胞的活化,并通过旁分泌或自分泌减少促炎因子IL-17的产生,从而抑制炎症、促进母胎免疫耐受[33]。已有研究证实,CE患者子宫内膜存在Treg细胞功能受损、Th17/Treg比例失调,使内膜炎症过度和纤维化[34]。有学者进一步发现,Th17丰度高的CE患者的子宫内膜微生物群在LPS合成的相关途径中显著活跃[8],结合肠道微生物研究中证实LPS可诱导Treg数量减少及Th17和Th1数量增加[35],推测子宫内膜中免疫细胞数量和比例失衡可能也是由类似机制引起的。

另有文献报道,在CE患者宫腔微生物群中含量较高的普雷沃氏菌和加德纳氏菌可促进芳香族氨基酸(如色氨酸)的合成进而上调内膜中促炎因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6)的表达及释放,增强对子宫内膜上皮细胞的破坏和分解,影响免疫细胞的活动,使CE内膜的免疫细胞谱发生改变[9,36]。此外,Chen等[8]研究发现,在CE患者中呈高丰度的叶状杆菌和鞘膜单胞菌与子宫内膜巨噬细胞的浸润程度呈显著负相关,而巨噬细胞在建立内膜的容受性中发挥重要作用。上述研究均表明,子宫内膜菌群微生态与免疫状态之间存在相互作用,这也可能是CE潜在的发病机制之一。

四、微生物感染诱导宿主细胞基因表达异常

蜕膜化是维持子宫内膜容受性的关键生理过程,同时也是决定妊娠成功与否的重要因素。这一步骤需要大量基因参与并且动态有序的表达调节,在自然生殖周期中,健康女性的子宫内膜存在相应基因表达谱的周期性变化,而CE中相应的基因谱表达异常。

Di Pietro等[37]发现较健康女性而言,CE患者在植入窗口期的子宫内膜基因表达谱中参与炎症反应、调控增殖与凋亡相关的基因表达存在显著差异,具体表现为CE组内膜中胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)、B淋巴细胞瘤2基因(BCL-2)和B细胞淋巴瘤-2基因相关X蛋白(BAX)表达上调,白介素-11、CC趋化因子配体4(CCL4)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(CASP-8)表达下调。目前研究已知生长激素发挥生理作用有赖于胰岛素样生长因子(IGF)的参与,在调节细胞生长、增殖及迁移等多种细胞进程中IGF均起着重要作用,其中IGF-1可在子宫内膜增殖期调节雌激素的促内膜生长功能,IGF-2则可调节孕激素在内膜分泌期使其获得容受性及刺激基质细胞分化的作用,这提示体内适当水平的IGF利于胚胎植入和胎盘形成[5]。而胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)参与调控IGF与其受体的结合,具体通过和IGF受体竞争IGF配体上的同一个结合位点而达到抑制IGF信号通路的作用[38]。因此,CE内膜中IGF/IGFBP失衡可能也是导致胚胎植入失败/胎盘形成不良的原因之一。Di Pietro等[39]在另一篇研究中还发现,IGF-1在子宫内膜的表达下调可能依赖于miR-27a-3p介导的转录后调控,提示微小RNA(miRNA)可通过IGF等因子参与CE引起不良妊娠结局的致病过程。事实上,miRNA在转录后水平上是基因表达的负调控因子,其生物学作用与其靶基因编码的蛋白有关[39]。另有学者研究证实,miRNA家族参与LPS的致炎机制,miRNA或通过调控相关炎症通路(如TLR通路、NLR通路)的关键分子从而参与CE的疾病进程[40]。

此外,BCL-2是抗凋亡基因,BAX和CASP-8为促凋亡基因。健康女性的子宫内膜细胞凋亡主要发生在分泌晚期及月经期,是维持正常月经周期和妊娠早期稳态的重要生理机制,该过程与BCL-2、BAX的表达密切相关,其比例改变可能对胚胎着床及胎盘发育过程中的组织重塑产生不良影响[37]。研究显示,BCL-2的过度表达与CASP-8的表达降低有关,CASP-8参与了Fas基因和多种凋亡刺激物诱导的细胞程序性死亡[37]。BCL-2在CE患者中过表达,使其内膜细胞的抗凋亡能力异常增强而不利于妊娠的建立和维持。

近年,基因异常表达在CE中逐步成为研究热点。Jhamat等[41]利用BEEC实验模型研究发现,LPS可改变BEEC的DNA甲基化模式,大部分差异基因表现为低甲基化和基因过表达,其中差异甲基化基因主要是与炎症反应、免疫应答、细胞增殖与凋亡、细胞黏附及细胞外基质重塑等过程相关的蛋白编码基因。由此推测,微生物感染可通过LPS等刺激因素诱导宿主细胞中免疫炎症等相关基因调控区域DNA甲基化模式改变和基因转录持续异常,进而异常调控相关炎症通路、影响炎症介质表达,从而参与CE的发生发展,导致CE患者子宫内膜炎症长期存在及免疫失调。Cicinelli等[42]研究证实,与对照组相比较,CE患者内膜中参与炎症、细胞增殖和凋亡过程的基因表达存在显著差异。

上述研究提示,CE可能主要是由致病微生物感染诱导宿主细胞DNA去甲基化,继而影响参与胚胎植入和妊娠维持等过程中与免疫炎症反应、细胞增殖和凋亡等相关基因的表达,改变内膜的生化、形态及功能,干扰蜕膜化过程,影响内膜的容受性,由此发生生殖障碍。

五、微生物群参与体内激素循环的调节

此外,蜕膜化过程也是在雌、孕激素结合其受体(ERα和ERβ,PRA和PRB)周期序贯作用下发生的[43]。有学者基于实时PCR法检测技术研究发现CE患者蜕膜化受损并与其内膜间质细胞中ERα/β、PRA/B的异常表达有关[44],提示CE可能通过干扰雌/孕激素受体的表达,以拮抗孕激素促使增殖期内膜转化为分泌期的妊娠支持作用,使基质细胞增值潜能高于分化潜能,导致蜕膜化的启功和发育受阻,影响子宫内膜容受性,对胚胎植入和妊娠维持有负面生物学效应。

目前研究认为,宿主微生物群与循环中雌/雄激素、胰岛素以及其他激素之间存在互相作用,并参与女性生殖内分泌疾病的发生发展。有研究表明,肠道菌群中能代谢雌激素的细菌(如拟杆菌、双歧杆菌和大肠杆菌等)分泌的β-葡萄糖醛酸酶能将雌激素解偶联为其活性代谢物,使循环中雌激素水平升高,从而参与子宫内膜异位症的形成[45-46]。已有研究证实,CE患者宫腔内包括双歧杆菌等多种细菌的丰度显著高于非CE者[9],而这些改变是否也通过对体内性激素的影响而干扰妊娠过程,其因果关系及相关机制有待进一步探明。

六、研究微生物群与CE致病机制时亟待解决的问题

在进一步探索宫腔微生物群与CE患者生殖障碍的关系及其作用机制时,还需注意以下几点：(1)CE诊断标准尚不统一,据文献报道至少有7个CE组织病理学诊断标准[47];且目前主流诊断方法(即宫腔镜下子宫内膜形态学检查结合内膜免疫组化)对CE的诊断仍存在一定漏诊率。上述因素均可能导致在不同研究中的CE分组存在一定差异从而影响研究结果。(2)CE患者宫腔微生物群组成尚不明确。针对CE的病原体检测,主要有微生物培养、定量PCR分析、16S rRNA测序等[47]。其中,微生物培养检出率低、耗时长且易被污染,局限性大;定量PCR分析一般只用几种常见的特异病原菌来识别,亦存在局限性;16S rRNA测序可精准鉴别宫腔微生物,但目前尚无关于16S rRNA测序对CE病原体诊断的特异度与敏感度的研究[47]。因此未来仍需更多大样本临床研究以进一步明确CE患者子宫内膜中的微生物组成。(3)宫腔微生物群的状态和组成易受到多种因素[6](如月经周期、激素、年龄、饮食及运动等)的干扰,因此是否有必要具体分析内膜活检时机和研究对象基线情况对CE患者病原体检测结果的影响也是一值得思考的问题。(4)注意临床观察指标的定义、统计学分析的准确性与多样性。鉴于目前关于CE影响生殖健康的机制的研究样本量较小、CE诊断标准不统一及宫腔微生物检出结果差异大等问题,荟萃分析将有助于获得更客观并有说服力的结论。

七、结语与展望

综上所述,病原体感染可使子宫内膜菌群失调及代谢活动改变,以此异常调节内膜微生态,还可以介导LPS等刺激因素激活相关炎症通路,引起大量细胞因子和趋化因子等异常表达,形成子宫内膜炎症微环境和免疫紊乱。此外,微生物感染还能诱导DNA甲基化模式改变,通过异常调控体内免疫炎症反应、细胞增殖和凋亡等途径参与CE的发生发展。而体内性激素水平及其受体表达的改变与菌群致CE病变的关系及其作用机制有待进一步证实。未来的研究还需更多高质量的随机对照试验以深入了解由微生物感染引发CE的具体分子机制及其影响女性生殖健康的具体原因,为发现CE治疗的新靶点提供科学参考,为优化CE患者的临床妊娠结局提供更多可能。