卵巢储备功能减退相关基因及组学研究进展

周立飞，郑琳璐，李林青，王文艺，李建磊，，张萍萍，孙艳美，李亚丽*

(1.河北省人民医院生殖遗传科,石家庄 050000;2.华北理工大学研究生学院,唐山 063210;3.河北北方学院研究生学院,张家口 075000;4.河北医科大学研究生学院,石家庄 050000)

卵巢储备功能减退(DOR)作为女性最常见的不孕症之一,通常是由于卵巢储备功能下降导致的治疗周期取消率高和受精率低[1]。据统计,DOR在年轻女性中的发病率为10%,并且在不孕妇女中所占比例逐年增加,是造成女性不孕症的重要原因之一,但DOR的发病机制至今尚未明确,可能与年龄、遗传因素、自身免疫因素、医源性(手术、放疗、化疗)等有关[2]。DOR主要以卵泡发育成优质卵母细胞的潜能下降为特征,临床主要表现为不孕、月经不调、围绝经期综合征和受精能力减弱等,因其卵巢对外源促性腺激素的反应力低和妊娠丢失率高的特点是女性生殖内分泌领域的一大挑战。目前对DOR的诊断标准为：周期第2～5天卵泡刺激素(FSH)>10 U/L,抗苗勒管激素(AMH)水平<0.5～1.1 ng/ml,或小于5个2～10 mm的早期窦状卵泡[3]。近年来随着技术的发展,基因组学、代谢组学和蛋白质组学对DOR的发病机制研究中取得了一定的进展,疾病的发生与发展是动态变化的。现就近年来有关DOR病因学的研究进行综述,以期为早期诊断、干预和治疗DOR患者提供新思路。

一、与DOR发生相关的基因

1.FMR1基因：FMR1基因位于性染色体Xq27.3上,其5′端UTR区(CGG)n的重复数在前突变(50～200)的个体患DOR的风险增加,主要是未被翻译的mRNA与其相关蛋白形成包涵体的蓄积会影响女性的卵巢功能。一项研究发现,在性腺中高度表达的多功能RNA结合蛋白Sam68在颗粒细胞中被隔离,很可能是通过与扩增的CGG重复转录物的相互作用导致可用于卵泡刺激素受体(FSHR)前体转录物加工的游离Sam68减少,引起FSHR转录物成熟的失调,从而导致卵巢对FSH刺激反应性降低[2,4-5]。FMR1的基因突变与卵巢功能障碍相关,一般通常为月经规律、卵巢储备功能下降、卵泡数量减少、生育力减退[4]。FMR1重复序列的分布因种族而有差异,西方国家DOR患者中携带FMR1前突变的患者较多,然而在亚洲国家携带者较少。在一项关于DOR女性的AMH水平与FMR1基因CGG重复数的研究中,证实在DOR的患者中,似乎FMR1基因CGG重复数≥35次女性的AMH随年龄的增长比CGG重复数<35次者下降得更快[2,4]。这种基因检测方法可能未来会被应用于识别DOR患者,为未来预防和治疗DOR提供新思路。

2.HFM1基因：HFM1基因是卵巢早衰(POF)的候选基因,也被称为POF9,位于染色体1q22,由39个外显子组成,编码在生殖系细胞中特异表达的减数分裂解旋酶1(HFM1),最早在卵巢早衰(POF)患者中报道。有研究者在一个有DOR且体外受精-胚胎移植(IVF-ET)妊娠结局差的家系中发现了HFM1基因的两种新的复合杂合子剪接变异[6]。在一项特异性敲除小鼠卵母细胞中HFM1的研究中,证实了HFM1基因对小鼠卵巢卵泡储备耗竭和生育力的作用,特别是在被敲除的小鼠卵母细胞中容易观察到异常纺锤体、染色体排列不齐、皮质肌动蛋白帽丢失、小鼠卵巢卵泡储备耗竭加速和极体排出失败的现象,进一步的研究表明,HFM1可能参与MAPK信号通路调控纺锤体迁移和不对称分裂[7]。更重要的是,一项通过植入前遗传学检测评估整倍体率的研究显示,与卵巢储备正常(NOR)不孕妇女相比,DOR女性的非整倍体胚胎百分比升高23 %,这也是导致胚胎停滞的原因之一[8]。

3.GREM1基因：GREM1是生长分化因子9(GDF9)的下游基因,由卵巢颗粒细胞(GCs)分泌,是在卵泡发育信号通路中发挥交互作用的重要调节分子,位于染色体15q13-15q15,由2个外显子及1个内含子组成[9]。最早被确定为骨形态发生蛋白的拮抗剂在恶性肿瘤中报道,通常会因启动子高甲基化而沉默,参与多种肿瘤的进展,其中在乳腺癌组织中发现GREM1上调,诱导上皮间质转化[10]。GREM1参与调节与胚胎发育相关的GDF9和骨形态发生蛋白15(BMP15)的平衡,GDF9、BMP15和BMP6目前被认为是负责排卵期间卵丘GCs扩增的卵母细胞调控的最佳候选分子,这对于体内正常卵母细胞发育发挥重要的作用[11]。为了研究GREM1是否参与DOR的发病及多卵巢GCs的影响,研究者在年轻DOR女性的卵丘细胞中发现GREM1基因表达下调[12]。随后研究者证实了GREM1通过调节GCs扩展过程影响卵泡发育和卵巢储备功能,GCs扩展相关基因的表达随着外源性GREM1蛋白浓度的增加而提高,且有浓度依赖性[9,12]。虽然因果关系尚不清楚,但这些观察结果可能反映了GDF9或其他卵丘生理学卵母细胞分泌介质的潜在缺陷,值得进一步挖掘研究。GREM1基因可能为未来预防和治疗DOR提供新的靶点。

因此FMR1、HFM1、GREM1基因与女性生殖和DOR密切相关,但具体相关机制需进一步挖掘。最近,通过全外显子测序技术在POF家族中确定了一系列新基因包括STAG3、GDF9、MCM8、SGO2和NUP107[13]。有关DOR遗传因素的研究虽取得了一定的进展,但相关机制仍不清楚,目前仍有一些候选基因有待发现,需开展更为深入的研究和探索。

二、与DOR发生相关的RNA

1.长链非编码RNA(lncRNAs)：是长度超过200个氨基酸但不编码蛋白质的在人类生理、病理调节过程中起重要作用的功能性RNA分子,其中一些lncRNA被确定在卵泡的形成和发育中起着重要的作用[14]。在一项病例对照研究中,通过收集、检测DOR与NOR不孕患者GCs中的lncRNA,筛选出与DOR相关的466个差异表达的lncRNA,其中有244个lncRNA表达上调,222个lncRNA表达下调。这些差异表达的lncRNA与细胞黏附、蛋白质消化吸收、胚胎发育和甲状腺激素信号通路等有关,与DOR疾病的发展密切相关[15]。但这些lncRNA如何调控DOR的机制尚不清楚,还需要进一步反复研究和验证。

2.微小RNA(miRNA)：miRNA是由22～24个核苷酸组成的一类小的非编码RNA,在细胞增殖和卵泡发病机制中起着重要的作用,广泛参与正常和疾病状态[16]。最近在DOR与NOR患者GCs差异表达的研究发现,DOR妇女GCs中miR-484水平升高,并伴有人类GCs中Yes相关蛋白亚型1(YAP 1)水平降低和人类GCs功能受损以及miR-484在GCs中的表达水平与基础FSH水平呈正相关;随后实验发现,用si-YAP1转染的GCs呈现出更高的氧化应激损伤以及早期和晚期凋亡细胞百分比增加,这些结果与过表达miR-484的GCs的表型一致;推测YAP 1是miR-484在GCs中的直接靶点,miR-484通过YAP 1介导的线粒体功能和凋亡调节GCs功能,从而降低卵巢储备功能[17]。吕清媛等[18]在卵巢储备功能异常(DOR、POF)患者血浆差异表达的研究中发现,miR-15b、miR-22的表达显著下降,二者可能与DOR的病情发展有着密切的联系,但在卵巢病理、生理中的机制尚不明确,需要进一步深入分析。Wei等[19]研究中发现DOR的高龄女性miR-221-3p的表达显著低于NOR的年轻女性,随后实验进一步阐明了FOXO1是miR-221-3p的直接靶基因,miR-221-3p的下调可能上调FOXO1表达,通过促进卵巢GCs凋亡而促进DOR的发病机制。此外,miRNA还通过影响GCs在女性生殖系统疾病如多囊卵巢综合征(PCOS)和卵巢早衰(POF)中发挥重要作用,系统地鉴定GC特异性miRNA将有助于研究者更好地了解卵巢疾病相关的潜在机制,从而为进一步研究GCs和卵泡的功能奠定基础。

外泌体是直径约30～150 nm由多种细胞分泌的,在免疫应答、胞间通讯、RNA转运和细胞间物质交换中发挥巨大作用的膜性囊泡[20]。一项通过研究DOR患者和NOR患者的卵泡液外泌体miRNA的差异表达发现,与NOR组相比,DOR患者卵泡液中存在80个有明显表达差异的miRNA,其中hsa-miR-4792、hsa-miR-184等31个miRNA表达上调,hsa-miR-136-3p、hsa-miR-296-3p、hsa-miR-335-5p等49个miRNA表达下调,其对相关靶基因预测发现与脂多糖介导的信号通路和卵泡或卵母细胞发育相关通路有关[21]。因此我们推断外泌体miRNA通过与靶基因靶向结合在DOR中发挥着重要作用,但其涉及的生物学通路需要进一步深入研究。

三、与DOR发生相关的代谢组学研究

氧化应激是DOR患者生育力下降的主要原因之一。卵泡液是卵母细胞的微环境,在卵母细胞的成熟及胚胎发育过程中起着重要的作用。

有研究者比较了DOR患者与正常妇女卵泡液中脂质代谢产物的差异表达情况,结果发现这些差异代谢物主要富集在胆碱代谢、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染和叶酸生物合成中[22];另有研究发现DOR组脂肪酸、2-羟色酮、孕酮-3-葡萄糖醛酸苷的表达显著降低,2-羟雌酮是雌激素及其衍生物的有机化合物,存在于所有脊椎动物中,具有刺激细胞生长,并阻断可能致癌的更强雌激素的作用[23-25];还有研究比较了DOR与NOR卵泡液中的氧化脂质差异,结果发现DOR患者卵泡液中有15种氧脂素代谢产物含量低于NOR组,这些差异氧化脂质代谢产物中有9种与获卵数和受精率有关,有8种与FSH水平呈负相关,有1种与优质胚胎数呈正相关,但均与花生四烯酸代谢途径密切相关[24],研究者由此认为在这些氧脂素代谢物中,花生四烯酸代谢发生了可能与卵母细胞发育有关的显著变化,导致DOR患者生育能力下降。何瑞芬等[26]采用非靶向代谢组学分析技术对18例DOR患者和18例NOR患者的卵巢GCs进行了代谢组学研究,鉴定出的差异代谢物与炎症反应和类固醇物质有关,可影响类固醇合成通路,进而引起类固醇物质合成丰度下降,从代谢水平阐明了类固醇激素对疾病的相关性。

脂质代谢物的发现为DOR的发病机制提供了新的线索,为反复移植失败患者卵泡液中的代谢变化提供了新的检测途径和治疗靶点。

四、与DOR发生相关的蛋白质组学研究

1.血液蛋白质组学：一项确定非肥胖DOR患者血清视黄醇结合蛋白4(RBP4)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)浓度与卵巢储备之间关系的横向研究中,发现了DOR患者血清RBP4水平降低,血清hs-CRP水平升高,而且血清RBP4水平与AMH水平呈正相关[27],因此得出了氧化应激在DOR中起作用的事实,维生素A参与了DOR患者卵巢储备的恢复的可能性,为卵巢储备调节的潜在机制提供了新的见解。

2.卵泡液蛋白质组学：卵泡液中含有生物活性分子影响着卵母细胞质量、受精和胚胎发育。卵泡液蛋白质组学的研究描绘了一种新的分子生化过程,在描述生物标志物的轮廓方面具有重要影响,为分析人类卵泡液提供了一种新思路,可用于卵母细胞质量评估和改善体外受精-胚胎移植技术结局[28]。

在一项卵巢低反应性蛋白质组学分析的研究中,发现了66种差异表达蛋白下调、65种差异蛋白上调,其中3种蛋白质(妊娠区蛋白、肾素和含sushi重复蛋白SRPX)的差异表达被认为具有统计学意义[29];随后有研究还发现了卵巢低反应组的血管生长因子表达增加,但卵泡液中血管生长因子的水平与胚胎质量呈负相关[30]。有研究者分析了DOR患者与正常受试者卵泡液中的差异表达蛋白质,发现了31个差异表达蛋白,包括10个上调蛋白、21个下调蛋白,这些差异表达蛋白主要与细胞增殖和细胞信号通路有关;后来研究还发现了DOR患者卵泡液中人前列腺酸性磷酸酶(PAP)水平降低和CD5抗原样蛋白(CD 5L)水平升高[31]。

这些差异表达蛋白的发现为卵母细胞质量的测量提供了新的思路。但目前关于DOR患者的卵泡液蛋白质研究还远远不足,我们期待建立更加完整的卵泡液蛋白质网络,为发现新靶点进而为靶向治疗提供新依据。

3.卵巢GCs蛋白质组学：近期有研究者进行了一项比较行卵胞浆内单精子注射(ICSI)的DOR患者与正常女性卵巢GCs中介导细胞凋亡的蛋白水解酶3(caspase-3)、细胞色素c和热休克蛋白70(Hsp 70)的表达水平与妊娠结局的前瞻性研究[32],发现在DOR组中,Hsp70表达水平与D3优质胚胎数呈正相关、与雌二醇水平呈负相关,而细胞色素c的表达水平与D3优质胚胎的数量呈负相关;卵丘-卵母细胞复合物中卵丘细胞扩展较差患者与凋亡蛋白表达水平升高、抗凋亡蛋白表达水平降低以及有或无DOR妇女的ICSI临床结局较差相关。

有必要进行更多的组织病理学和遗传分子学研究,以探讨不同的凋亡相关生物标志物在接受ICSI治疗的妇女卵巢GCs中的功能作用。

4.T淋巴细胞蛋白质组学：有研究者比较了DOR患者与NOR患者中的T淋巴蛋白的差异表达,结果发现DOR患者卵泡内CD8+T细胞数量增加,CD8+/CD4+T细胞比例升高,趋化因子配体5(CCL 5)和γ干扰素(IFN-γ)水平升高,这些变化可能涉及GCs的凋亡、卵母细胞质量降低和卵泡闭锁[33]。随后在GCs与CD8+T细胞体外共培养实验研究中发现,CD8+T细胞抑制GCs增殖并通过内在的细胞凋亡途径促进其凋亡,同时凋亡的GCs产生并释放大量的CCL5,而CCR5与GCs相互作用,将CD8+T淋巴细胞重新吸引至卵泡[33-34]。

有关T淋巴细胞蛋白在DOR发病进程中如何发挥作用还有待进一步研究,为DOR的临床诊断和治疗提供新的生物标志物和潜在的药物靶点。

综上所述,目前蛋白质组学在DOR疾病中的应用主要集中在探索发病机制、删选诊断标记物等方面,差异表达蛋白主要影响了细胞增殖和细胞信号通路,研究所用的样本主要是血液、卵泡液、GCs、淋巴细胞和组织等。

五、结论与展望

近年来,基因组学、代谢组学和蛋白质组学被越来越多地应用于生殖疾病的病因学研究,取得了丰硕的研究成果。首先,目前DOR发病机制的研究主要集中在生物分子水平上,基因层面的研究少而分散,许多基因参与的具体方式尚不明确;其次,蛋白质组学的应用尚存在较多困难与挑战,在蛋白质组学技术的选择上存在着较大差异,这会导致不同研究成果出现的可能。就现有研究而言,缺乏大数据、大样本的理论证据,但相关证据依然加深了我们对DOR病因学的认识和了解。临床中多采用调节雌孕激素来增加获得卵母细胞的数量,已有褪黑激素具有抗DOR活性从而保护卵母细胞质量的报道[35],但具体机制仍需进一步深入研究;虽然没有直接检测卵巢储备的方法,但多采用一些生物标志物,如AMH、FSH和抑制素B(INH B)作为临床实践中生殖潜力的预测因子[36]。然而,因个体差异,因DOR原因导致女性不孕的比例依旧很高。鉴于DOR的发生对患者本人和辅助生殖结局的影响,深入进行DOR确切发病机制的研究仍然是辅助生殖领域的热点和难点。