基于代谢组学的早发性卵巢功能不全研究进展

余朝阳，李慕军

(1.广西医科大学第一临床医学院,南宁 530021;2.广西医科大学第一附属医院广西生殖医学研究中心,南宁 530021)

早发性卵巢功能不全(POI)是一种以高促性腺激素低雌激素闭经为特征的生殖内分泌疾病,以不孕和围绝经期症状为常见临床表现,其诊断标准[1]为：年龄<40岁,出现少经或闭经至少4个月;间隔1个月两次测血清基础卵泡刺激素(FSH)>25 U/L。卵巢功能衰退是一个渐进发展的过程,通常认为卵巢储备功能低下(DOR)是卵巢功能障碍的初始阶段,持续发展可转变成POI,而卵巢早衰(POF)被认为是POI的终末阶段[2]。POI的病因具有高度异质性,从自发性到特定原因包括遗传因素如染色体异常、自身免疫性疾病、感染、医源性因素如手术及放化疗等,还有90%被诊断为病因不明[3]。临床上以FSH>25 U/L作为POI的客观诊断标准,但FSH对卵巢储备功能下降的反应并不敏感[4],且目前尚无确切有效的可逆转卵巢功能的药物。此外,由于缺乏雌激素的保护作用,许多远期并发症例如心血管疾病、骨质疏松、认知障碍、神经功能障碍等风险也随之增加。基于POI缺乏诊断标志物以及不可逆的后果,确定可靠的生物标志物和治疗靶点对于POI的诊治至关重要。

代谢组学是对生物体中细胞、组织及体液的低分子量代谢产物进行定性和定量分析,并寻找鉴定生理和病理状态的关键差异代谢物及相关关系的一门学科。相比于转录组和蛋白质组学,代谢组学作为“后起之秀”更能反映生物体表型的变化,代谢物作为分子调控的最终产物也能直接揭示基因和蛋白的功能[5]。目前代谢组学在多囊卵巢综合征、卵母细胞以及胚胎质量评估的研究中已取得一定的进展[6-7]。POI属于生殖内分泌疾病,通过代谢组学可以揭示POI的内分泌代谢特征并筛选具有诊断价值的代谢标志物。因此,本文从代谢组学概述、POI的代谢特征、代谢标志物与代谢通路等方面归纳总结近年来POI的代谢组学研究进展,旨在从代谢角度探索POI的潜在代谢标志物和参与疾病机制的代谢通路,为临床诊疗提供新的见解。

一、代谢组学概述

代谢物的变化与疾病的表型最为相关,因此被认为是研究表型的强大工具[8]。代谢组学的研究方法主要分为靶向代谢组学和非靶向代谢组学。非靶向代谢组学是通过获得样本的所有代谢物表达谱,比较不同组间的样本代谢产物种类与丰度的差异,具有高通量的优点,但缺点是灵敏度低且难以检测低丰度的代谢物,通常用于比较两种生物条件下(如健康vs. 疾病、治疗前vs. 治疗后)代谢物的差异,因此更适合作为一种筛查差异代谢物的工具。而靶向代谢组则是利用标准品对少量目标代谢物进行检测和定量,其优点是可以做到绝对定量,但是通量低,主要用于检测已知具有类似化学结构的代谢物种类如脂质、肉碱、氨基酸等,是一种更精准的定量工具[9]。

代谢组学的分析技术方法主要包括液相色谱-质谱法(LC-MS)、气相色谱-质谱法(GC-MS)以及核磁共振法(NMR)。而目前最常用的是液-质联用的方法,其具有操作简单、适用范围广和灵敏度高等优点,其高灵敏度可用于识别数千种代谢物特性[10]。目前各种分析技术都有其优势和局限性,单一的分析方法难以实现全部代谢物的分析,而多种技术的联用可作为相互补充,从而更全面精准地分析代谢物的表达和特征。

二、POI的代谢特征

女性在围绝经期会因为激素变化导致糖脂代谢紊乱,包括血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平升高和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平降低,以及血糖和胰岛素异常[11]。类似的,POI引起的卵巢功能过早衰退会导致更早更严重的代谢改变,有研究报导POI是缺血性心肌病和心血管疾病的独立风险因素[12]。既往Meta分析提示早绝经(年龄<45岁)和POI均与Ⅱ型糖尿病风险增加有关[13]。

国内外关于POI代谢特征的研究目前缺乏统一的结论。近期国内浙大妇产医院一项包含303名POI患者的病例对照研究显示,与年龄匹配的健康对照组相比,POI女性血清甘油三酯、葡萄糖、尿素水平升高,血清HDL-C和肾小球滤过率水平降低[14]。而来自北京妇产医院的病例对照研究提示POI组与对照组相比甘油三脂、LDL-C以及空腹胰岛素显著升高(P<0.05),但两组间总胆固醇、HDL-C、空腹血糖以及胰岛素抵抗指数差异无统计学意义(P>0.05)[15]。除了糖脂代谢紊乱以外,POI对骨骼健康也有长期的负面影响。研究表明POI会引起骨密度降低,在长期的生活中会增加骨质疏松及骨折的风险[16]。

总之,由于研究人群和检测方法的异质性,各项研究的结果不完全一致,但总体均提示POI会出现不利的代谢改变。

三、基于代谢组学鉴定POI的代谢标志物和富集通路

1.外周血：最近一项关于POI患者的血浆代谢组学研究提示130种差异代谢物主要参与咖啡因代谢、泛醌和其他萜类醌的生物合成等途径[17]。泛醌即辅酶Q10,大量研究表明辅酶Q10可以改善卵母细胞质量和临床妊娠率[18-19]。花生四烯酰酰胺、3-羟基-3-甲基丁酸、二己基壬二酸、18-羟基二十碳四烯酸(18-HETE)、胱氨酸和磷脂酰甘油(PG)(16∶0/18∶1)等6种差异代谢物的曲线下面积(AUC)值大于0.8,被认为是POI的诊断标志物[19]。Chen等[20]关于POF患者的血清代谢组学分析提示,差异代谢物主要富集于ATP结合盒(ABC)转运蛋白依赖通路、蛋白质消化吸收通路、癌症中枢碳代谢通路、矿物质吸收通路、皮质醇合成分泌通路,且ROC曲线表明了6种差异代谢物包括单甲基硫酸酯、核黄素、氧戊二酸、4-羟基苯甲酸、N-乙酰去甲基硫代膦和L-半胱氨酸在区分多囊卵巢综合征(PCOS)和POF方面具有巨大潜力,有望成为PCOS和POF的诊断标志物[20]。Jiang等[21]为了研究POI患者肠道微生物菌群和循环代谢物之间的潜在联系,采用非靶向代谢组学方法分析了健康对照组、POI组以及激素治疗组之间的血清代谢谱,结果提示大多数差异代谢物与血清转化生长因子β1(TGF-β1)水平呈正相关而与雌二醇呈负相关,KEGG提示富集程度最高的代谢通路是ABC转运蛋白[21],这与上述Chen等[20]的研究结果一致。ABC转运蛋白是生物体中最大的跨膜蛋白家族之一,它在线粒体平衡和胆固醇代谢等细胞稳态中发挥重要作用[22],这些转运蛋白的功能障碍与囊性纤维化有关[23];TGF-β1是纤维化的关键驱动因子同时也是过度炎症抑制物,它被认为与纤连蛋白和胶原蛋白的产生有关[24]。POI患者血清TGF-β1水平升高提示机体内纤维化水平较高,而经过激素替代治疗可以逆转这种升高趋势,表明POI患者的肠道微生物群、血清代谢物和血清TGF-β1之间的相互作用可能在POI的发展中起关键作用[21]。曾丽华等[25]进行的POI大鼠外周血代谢组学分析表明,甘油磷脂类、中链脂肪酸类、胆汁酸类等54种代谢物在POI组中表达量升高,而不饱和脂肪酸类、甘氨酸类以及甘油三酯类等39种代谢物在POI组中表达量下降,提示这些差异代谢物可能与POI的发病机制相关。

与其他样本相比,外周血采集是最小创伤的方式,因此在探索POI代谢标准物上具有良好的前景。然而,POI的靶向器官是卵巢,外周血的代谢物变化是否直接反映卵巢功能仍有待进行多样本多组学联合分析(如颗粒细胞、卵泡液),代谢物的诊断潜力仍需进行更大队列的前瞻性验证。

2.卵泡液：Liang等[26]采用靶向代谢组学分析DOR患者和正常对照组的卵泡液中的氧脂蛋白代谢特征,结果提示DOR组卵泡液中的15种氧磷脂代谢产物包括前列腺素F2α(PGF2α)、20-羧基花生四烯酸(20-COOH-AA)、20-羟基二十碳四烯酸(20-HETE)、前列腺素A2(PGA2)、前列腺素D2(PGD2)等显著低于对照组,富集分析提示这15种差异氧化脂质代谢物与花生四烯酸代谢途径密切相关;而Li[27]等的代谢组学研究表明花生四烯酸随着卵母细胞减数分裂的进展而下降,提示卵母细胞质量可能与花生四烯酸酸代谢相关。先前的研究表明人卵泡液中高浓度的花生四烯酸衍生物显著降低了卵胞浆内单精子注射(ICSI)后卵母细胞形成原核的能力[28]。作为细胞信号中间体,花生四烯酸及其衍生物通过调节cAMP激活、Ca2+内流、MAPK和PI3K/Akt通路从而影响细胞的生长、增殖和分化[29]。此外,花生四烯酸调节牛颗粒细胞的存活、基因表达、脂质形成、类固醇产生和细胞内信号通路并对卵母细胞减数分裂其关键作用[27,30],进一步表明卵泡液中的花生四烯酸可直接影响颗粒细胞功能,从而调节滤泡发育和排卵。

Xiao等[31]通过拟靶代谢组学研究六味地黄丸改善DOR患者体外受精结局的作用机制,结果共鉴定了21种潜在的代谢生物标志物,其中DOR组的睾酮、孕酮、磷酰胆碱、癸酰肉碱、六氢吡啶羧酸、13,14-二氢视黄醇、胆碱、丙烯酰胺、异丁酰-l-肉碱等代谢物水平下调,而N-乙酰色氨酸、2-丙烯基1-(1-丙烯基亚磺酰基)丙基二硫化物、二十碳三烯酸、20α-二氢孕酮、17-十八碳烯酸的水平上调。亚麻酸对体外培养的山羊卵母细胞产生有益影响,促进胚胎的发育并调节凋亡基因的表达[32],并且保护体外脂毒条件下成熟的牛卵丘-卵母细胞复合体的发育能力[33];肉碱可以影响线粒体功能,调节牛卵母细胞衍生的旁分泌因子,并增加类固醇激素的产生,从而提高成熟卵母细胞的质量和改善体外胚胎发育[34]。低水平的基础睾酮是卵巢刺激后获取卵母细胞数量低下的重要危险因素,可能对体外受精的妊娠率产生不利影响[35]。这些研究发现同时也提示了卵泡液中这些代谢物的改变可能会影响卵母细胞的质量。

3.动物细胞和组织：除了人的外周血和卵泡液等标本,代谢组学在动物模型和细胞中的研究应用也取得了一定的进展。Zhao等[36]的研究提示POI小鼠卵巢的代谢物水平发生了显著变化,尤其是脂质、甘油磷脂、类固醇和氨基酸,而POI小鼠在接受脐带血干细胞治疗后卵巢功能和代谢物恢复到接近对照组的水平,提示干细胞通过激活PI3K通路,提高游离氨基酸水平,从而改善脂质代谢、降低单糖浓度,进而恢复卵巢功能。鞘氨脂是激活PI3K通路的重要信号分子[37],而丝氨酸是合成鞘氨脂的必要成分[38]。因此,POI小鼠卵巢中丝氨酸的显著减少,可能下调鞘磷脂的产生,进一步抑制PI3K/Akt通路影响颗粒细胞及卵巢功能。Li等[27]通过研究小鼠卵母细胞在不同减数分裂阶段的代谢谱特征,表明花生四烯酸是减数分裂成熟作用的关键靶点,并证明了丝氨酸-甘氨酸-碳途径参与了成熟卵母细胞表观遗传标记的控制。Chen等[39]基于核磁共振代谢组学探索了电针对POF小鼠肝肾代谢及卵巢功能的影响,结果表明经过电针疗法后小鼠肝脏中赖氨酸、葡萄糖、磷胆碱、牛磺酸、甘氨酸和甘油的相对水平升高,而谷氨酸和肌酸的相对水平降低;在小鼠肾脏中乳酸和甘油的相对水平增加,而谷氨酸、肌酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸和赖氨酸的相对水平降低。这些差异代谢物主要与能量代谢和神经递质相关,从而可以推测针刺疗法主要通过调节肝脏和肾脏中能量和神经递质相关的代谢途径来治疗POF[39]。然而,核磁共振代谢组学的局限性在于不能定量检测代谢物,因此在未来还需扩大样本量采用液相色谱-质谱联用技术加以验证。

四、代谢组学的优势与挑战

我们总结了代谢组学在POI各类样本中的应用与研究进展,发现POI中大多数标本(包括血浆、卵泡液和卵巢组织)中的大多数差异代谢物都与脂质和氨基酸相关,脂类和氨基酸代谢紊乱可能参与了POI的病理机制。其次,多项研究提示差异代谢物显著富集于ATP结合盒(ABC)转运蛋白依赖通路和花生四烯酸酸通路,提示这些代谢通路在POI的发生发展中具有不可忽视的作用。

综上所述,代谢组学作为强大的表型工具,具有许多重要的优势：(1)通过研究代谢物的变化可以反映基因及蛋白的功能,差异代谢物所调控的通路可能参与了疾病的发病机制;(2)差异代谢物是生理和病理状态之间的分水岭,可作为疾病诊断和风险预测的生物标志物;(3)相比于转录组学和蛋白组学,代谢组学的样本(生物体液或组织)可以在门诊环境中取得,检测成本更低,有望在临床大规模开展;(4)通过代谢组学可评估药物疗效、毒性及不良反应,还可用于新生儿代谢性疾病筛查、肿瘤靶向治疗及细菌鉴定等领域。

然而,代谢组学研究也面临一定的局限性和挑战：(1)代谢物极易受到机体内部和外部因素影响而发生改变如药物、疾病、采血时机及检测方法等,因此需制定严格的病例和对照纳入标准以及排除标准,尽可能减少研究的异质性;(2)非靶向代谢组学只能作为代谢标志物的初筛,未来需进行更大队列的靶向代谢组学验证评估代谢物的诊断潜能;(3)代谢物组由数千种不同的化学物质组成,这意味着单一的检测方法难以全面地反映样本中代谢物的变化,因此更全面和精确的代谢物鉴定需要多种互补技术和设备的结合。随着高通量技术的快速发展,未来应用多组学联合研究能够更全面地揭示POI的分子调控网络和发病机制,而代谢组学在其中将发挥重要的作用。