不同稀释液对苯磺顺阿曲库铵注射液内毒素测定的影响研究

李雪梅,肖斯婷,曹春然（北京市药品检验研究院,国家药品监督管理局创新药物安全研究与评价重点实验室,中药成分分析与生物评价北京市重点实验室,北京 102206）

苯磺顺阿曲库铵是一种骨骼肌松弛药物，用于手术和其他操作以及重症监护的治疗。作为全麻的辅助用药或在重症监护病房起肌松作用的药物，其可以松弛骨骼肌，使气管插管和机械通气易于进行[1]。临床给药途径主要有静脉单次注射和静脉滴注。对于苯磺顺阿曲库铵注射液的内毒素检查，是保证其安全使用的前提，有效控制其中内毒素的含量尤为重要[2]。

目前对于苯磺顺阿曲库铵注射液的内毒素检查多使用凝胶法，查询相关文献发现，该品种的内毒素检查法的研究中，苯磺顺阿曲库铵对内毒素的抑制作用是被公认的，但对于消除该抑制作用的缓冲剂选择描述却很模糊。为更准确地测定该品种中细菌内毒素的含量，本文采用动态显色法对其内毒素进行测定。根据临床用法用量，将其质量标准中内毒素限值规定为小于3.0EU/mg。为研究苯磺顺阿曲库铵对内毒素的抑制作用，我单位将使用细菌内毒素检查用水为稀释剂和使用镁离子缓冲液稀释剂的实验结果进行比对，发现使用细菌内毒素检查用水作为稀释剂时，其实验方法不成立，特此将苯磺顺阿曲库铵注射液可行的内毒素检查法介绍如下。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂 苯磺顺阿曲库铵注射液，规格：5ml:10mg，样品选择国产某企业生产，批号：G010M，性状：无色透明液体。细菌内毒素检查用水（以下简称BET水），湛江安度斯生物有限公司，批号：1806130，规格：50ml/瓶。镁离子缓冲液，湛江安度斯生物有限公司，批号：2005210，规格：4ml/支。鲎试剂，湛江安度斯生物有限公司，批号：2004280，灵敏度：0.005EU/ml，标示检测限50-0.005EU/ml。细菌内毒素工作标准品，中国食品药品检验研究院，批号：150800-201987，规格：80EU/支；批号：150800-202088，规格：60EU/支。

1.2 仪器 EasyBET细菌内毒素测定系统，型号：BET-48G，生产单位：湛江安度斯生物有限公司，工作状态正常。

2 方法与结果

苯磺顺阿曲库铵注射液内毒素限值为：3.0EU/mg，按其规格：5ml:10mg计算，其浓度为2mg/ml，折合内毒素限值为6.0EU/ml。

2.1 采用灭菌注射用水稀释步骤与测定方法

2.1.1 内毒素标准品的配制 取1支内毒素标准品（60EU/支）+BET水1.0ml→60EU/m l；取0.5 m l（6 0 E U/m l）+B E T 水2.5ml→10EU/ml；取2ml（10EU/ml）+BET水2ml→5EU/ml；取1ml（5EU/ml）+BET水4ml→1EU/ml；取2ml（10EU/ml）+BET水2ml→0.5EU/ml；取1ml（0.5EU/ml）+BET水4ml→0.1EU/ml；取2ml（0.1EU/ml）+BET水2ml→0.05EU/ml；取1ml（0.05EU/ml）+BET水4ml→0.01EU/m l；取2 m l（0.0 1 E U/m l）+B E T 水2ml→0.005EU/ml。

2.1.2 供试品溶液的制备 M V D=L/λ=6.0EU/ml÷0.005EU/ml=1200倍。取0.2ml样品溶液+BET水1.8ml→10倍稀释液；取0.2ml（10倍稀释液）+BET水1.8ml→100倍稀释液；取0.5ml（100倍稀释液）+BET水2.5ml→600倍稀释液；取1ml（600倍稀释液）+BET水1ml→1200倍稀释液。

2.1.3 供试品阳性溶液的制备 取0.5ml（600倍稀释液）+0.5ml内毒素标准品溶液（0.16EU/ml）→1200倍稀释阳性溶液（0.08EU/ml）。

2.1.4 测定方法 将溶解的鲎试剂分装到无热原的仪器专用检测管内，每只检测管内加0.1ml，然后按顺序分别加入0.1ml的内毒素标准品溶液或稀释好的供试品溶液、供试品阳性溶液，阴性孔加入内毒素检查用水，阳性孔加入0.5EU/ml的内毒素标准品溶液，轻轻混匀后放入细菌内毒素测定仪设定位置，仪器自动开始检测。按照中国药典2020年版四部通则1143中光度测定法进行数据统计与结果计算。

2.1.5 采用细菌内毒素检查用水作为稀释剂的测定结果 从实验结果看，样品回收率为28%，小于50%，说明其方法学验证不通过，见表1。

表1 细菌内毒素检查用水为稀释剂的测定结果

2.2 采用镁离子缓冲液稀释步骤与测定方法[1]

2.2.1 镁离子缓冲液（阴性对照）的稀释取10ml镁离子缓冲液+BET水50mlBET水→60ml（6倍镁离子稀释液）；取20ml（6倍镁离子稀释液）+BET水20ml→40ml（12倍镁离子稀释液）。

实验前，采用凝胶法测定镁离子缓冲液的内毒素含量，检查结果显示，镁离子缓冲液的内毒素小于0.015EU/ml，与细菌内毒素检查用水的内毒素要求限值一致。

2.2.2 内毒素标准品稀释 取1支内毒素标准品（60EU/支）+BET水1.0ml→60EU/ml；取0.5ml（60EU/ml）+BET水2.5ml→10EU/ml；取2ml（10EU/ml）+6倍镁离子稀释液2ml→5EU/ml；取1ml（5EU/ml）+12倍镁离子稀释液4ml→1EU/ml；取2ml（10EU/ml）+12倍镁离子稀释液2ml→0.5EU/ml；取1ml（0.5EU/ml）+12倍镁离子稀释液4ml→0.1EU/ml；取2ml（0.1EU/ml）+12倍镁离子稀释液2ml→0.05EU/ml；取1ml（0.05EU/ml）+12倍镁离子稀释液4ml→0.01EU/ml；取2ml（0.01EU/ml）+12倍镁离子稀释液2ml→0.005EU/ml。

2.2.3 供试品溶液的制备 MVD=L/λ=6.0EU/ml÷0.005EU/ml=1200倍。取0.5ml样品+BET水4.5ml→10倍稀释液；取0.5ml（10倍稀释液）+BET水4.5ml→100倍稀释液；取1ml（100倍稀释液）+BET水2ml→300倍稀释液；取2ml（300倍稀释液）+6倍镁离子稀释液2ml→600倍稀释液；取1ml（600倍稀释液）+12倍镁离子稀释液1ml→1200倍稀释液。

2.2.4 供试品阳性溶液制备 取1ml（600倍样品稀释液）+1ml内毒素标准品溶液（1EU/ml）→1200倍稀释阳性溶液（0.5EU/ml）。

2.2.5 测定方法 将溶解的鲎试剂分装到无热原的仪器专用检测管内，每只检测管内加0.1ml，然后按顺序分别加入0.1ml的内毒素标准品溶液或稀释好的供试品溶液、供试品阳性溶液，阴性孔加入12倍镁离子稀释液，阳性孔加入0.5EU/ml的内毒素标准品溶液，轻轻混匀后放入细菌内毒素测定仪设定位置，仪器自动开始检测。按照中国药典2015年版四部通则1143中光度测定法进行数据统计与结果计算。

2.2.6 采用镁离子缓冲液作为稀释剂的测定结果 从测定结果看，以镁离子缓冲液作为稀释剂，在此对苯磺顺阿曲库铵注射液进行细菌内毒素的测定，其方法学验证结果符合实验成立条件，则认为结果准确，见表2。

表2 镁离子缓冲液为稀释剂的测定结果

2.3 结果 苯磺顺阿曲库铵注射液使用细菌内毒素检查用水和镁离子缓冲液作为稀释剂进行细菌内毒素检查结果显示，两种稀释方法的线性回归方程分别为：LgTg=2.6768-0.2684LgC和LgTg=0.42533-0.03972LgC，相关系数分别为：-0.9961和0.9975；两种稀释方法中内毒素标准品和样品不同稀释倍数及干扰管的变异系数均小于10%；两种稀释方法中内毒素的回收率分别为28%和89%。由此可见，采用细菌内毒素检查用水作为稀释剂时，其内毒素回收率低于50%，与《中国药典》规定的回收率应在50%-200%不相符，实验不成立。采用镁离子缓冲液作为稀释剂对样品和标准品进行稀释并测定，其结果回收率为89%，符合实验成立要求。则苯磺顺阿曲库铵注射液在进行细菌内毒素检查时应使用镁离子缓冲液作为稀释剂，实验方可成立。

3 讨论

苯磺顺阿曲库铵注射液对内毒素有抑制作用，补充适量的二价离子可有效消除苯磺顺阿曲库铵注射液对细菌内毒素检查的抑制[3]。镁离子缓冲液是一种辅助剂，用于枸橼酸盐类抗凝剂及一些会导致鲎试验反应溶液中二钾离子缺失的样品的细菌内毒素检查。在使用镁离子缓冲液对样品进行稀释后再根据动态显色法进行检查，结果表明方法可行。

目前对于苯磺顺阿曲库铵注射液的内毒素检测，文献报道中提及可用凝胶法[4]，但有关其采用动态显色法对细菌内毒素进行质量控制的措施却没有提及。在文献[3]报道中，为消除苯磺顺阿曲库铵对内毒素的抑制作用，可使用稀释剂Ⅰ作为溶剂。稀释剂Ⅰ是一种辅助剂，含有一定浓度的二价离子，可饱和枸橼酸盐的螯合反应，维持鲎试剂的正常灵敏度，并有较强的pH缓冲能力，使反应介质保持反应所需的最佳pH。近来湛江安度斯生物有限公司将稀释剂Ⅰ更名为镁离子缓冲液。

目前苯磺顺阿曲库铵注射液的质量标准中，越来越多的企业选择使用与进口品种相同的标准进行内毒素检查，即使用动态显色法，而不再使用凝胶法，但所有涉及苯磺顺阿曲库铵注射液品种的质量标准中，仅写明“采用动态显色法进行内毒素的测定”，但对其实验过程中药品主要成分对内毒素有抑制作用，需采用镁离子缓冲液对样品进行稀释后测定并未写明。故笔者认为，在后续企业的标准提高和该品种的日常检验中，应写明实验过程中采用的稀释剂，以便更好地完善质量标准，对该品种的安全性质量控制有重要的意义和价值[5-22]。