共轭亚油酸（CLA）对乳脂肪球粒径和磷脂酰胆碱含量的影响

刘镇滔，康方圆，吴奎显，倪晗，杨彦宾，王月影，杨国宇，韩立强

（河南农业大学动物医学院河南省动物生长发育重点实验室，郑州 450002）

0 引 言

牛奶中的脂肪以水包油乳液的形式存在，称为乳脂肪球（MFG）[1-2]，其直径在0.2～15 μm 不等，平均粒径在2.5～5.7 μm[3]。乳磷脂主要聚集在乳脂肪球膜（MFGM）上，如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺（PE）等[4]。相关研究表明膜磷脂具有提高免疫力、调节代谢、促进大脑发育、预防癌症等生理作用[5-6]。

不同大小的MFG，其磷脂含量和结合蛋白水平各不相同，从而影响牛乳的营养价值和生产加工性能[7]。AVRAMIS C A 等[8-9]发现，小粒径乳脂肪球在制作奶酪时更利于加工和保存。共轭亚油酸（CLA）是在反刍动物产品和肉类中发现的，人类主要通过乳制品来获取CLA[10]。其具有抗癌、抗肥胖、减少脂肪沉积、改变脂肪酸组成、增加肌肉含量、改善肉质等生理作用[11-13]。在生产中，CLA 被认为是造成奶牛低乳脂症（MFD）的机制之一，主要由于反式脂肪酸直接抑制乳脂肪的合成引起[14]。通过前期研究发现CLA可以显著降低牛乳脂肪含量，并且会影响到脂肪球的平均粒径[15]，但是对不同粒径大小脂肪球的影响还不清楚。因此本研究通过对荷斯坦奶牛饲喂CLA，采集其牛乳，通过重力分层分成大粒径和小粒径脂肪球，分析CLA 对不同大小粒径脂肪球的影响及PC含量的变化，为进一步探索CLA 对乳脂肪的调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

共轭亚油酸微囊粉（成分如表1 所示），澳海生物；甲醇、乙腈，J T Baker；异丙醇，MACRON；甲酸，科密欧；甲基叔丁基醚，Merck；脂质组学标准品（纯度≥98%），Sigma。

表1 共轭亚油酸的脂肪酸组成

1.1.2 主要仪器

乳成分分析仪（Foss 120 Milko-Scan），Foss；激光粒度仪（Mastersizer 3 000），Malvern；真空离心浓缩仪，Genevac；气相色谱质谱联用仪（Agilent 7890-5977），安捷伦；超高效液相色谱仪（LC-30A 和CCBM30A），岛津。

1.2 实验设计

1.2 1 实验动物和饲养管理

研究在河南农业大学奶牛场进行。实验所用荷斯坦奶牛，生产性能良好、身体健康且均处于泌乳中期，产后（169±26）d。试验期间采用全混日粮（Toal Mixed Ration，TMR）饲喂。在每天早上6:00 和下午16:00 挤奶2 次。本实验分为2 组，每组各8 头，正常组仅饲喂基础日粮；试验组在基础日粮中添加400 g/d CLA。试验持续8 d，并记录每天试验数据。

1.2.2 牛乳样品采集

在实验第8 天采集牛乳200 mL，分装后一部分采用乳成分分析仪分析常规乳成分，一部分进行重力分层后测量乳脂肪球粒径，然后保存在-80 ℃冰箱进行液相色谱与质谱联用测定磷脂酰胆碱的种类含量。

1.2.3 乳脂肪球的重力分层

根据MESILATI S R 等[14]的方法改进后，采集乳样不超过6 h 且冷藏处理。将70 mL 新鲜乳样加入到100 mL 注射器中，用封口膜密封下部，4 ℃下静置24 h，取下封口膜，使乳样从针孔流出，约每10 mL 时分别进行收集，从下至上分别命名为F1、F2、F3、F4、F5、F6，最上层为F7（奶油层）。最后测量各组中的MFG 粒径大小。

1.2.4 磷脂酰胆碱含量分析

1.2.4.1 磷脂样品的提取

取F1 和F6 层牛乳样本100 μL 加入到2 mL 离心管中，加入800 μL 脂质提取液（V甲基叔丁基醚∶V甲醇=3∶1），混匀后超声30 min, 加入240 μL 超纯水，涡旋1 min 后，4 ℃离心机12 000 r/min 离心15 min，吸取上清液至离心管中，真空离心浓缩仪浓缩至干，再用100 μL 乙腈/异丙醇（V乙腈∶V异丙醇=10∶90）复溶，最后上机LC-MS/MS 分析。

1.2.4.2 色谱质谱条件

色谱柱：Thermo AccucoreTMC30 柱(2.6 μm,2.1 mm×100 mm i.d.)，流速0.4 mL/min，柱温40 ℃，进样量6 μL。流动相：A 相，乙腈/水（V乙腈∶V水=60∶40）；B相，乙腈/异丙醇（V乙腈∶V异丙醇=10∶90）；梯度洗脱程序：0 min 为VA∶VB=4∶1，2 min 为VA∶VB=7∶3，4 min 为VA∶VB=2∶3，9 min 为VA∶VB=3∶17，14 minVA∶VB=1∶9，15.5 min 为VA∶VB=1∶19，17.5 min 为VA∶VB=4∶1。

1.2.4.3 质谱条件

电喷雾离子源（Electrospray Ionization，ESI）温度550 ℃，正离子模式下质谱电压5 500 V，负离子模式下质谱电压-4 500 V。

1.3 数据分析

使用IBM SPSS Statistics26 软件进行数据分析，采用T-Test 分析比较数据差异，以P>0.05 表示无统计学差异，*P<0.05 表示有统计学差异，**P<0.01 表示有极显著统计学差异。

2 结 果

2.1 生产性能及乳成分分析

如表2 所示，对第8 天试验组和正常组的乳样进行比较，结果发现饲喂CLA 对奶牛的产奶量无显著影响（P>0.05）；乳成分中乳脂肪、乳蛋白含量显著下降（P<0.05），而乳糖含量无明显变化（P>0.05）。

表2 生产性能及乳成分分析

2.2 重力分层分析

2.2.1 乳脂肪球分层外观

如图1 所示，对试验组和正常组的第8 天乳样进行重力分层，观察到饲喂CLA 后F7 层（奶油层）明显变薄。对牛乳每10 mL 进行分层后使用激光粒度分析仪进一步测量脂肪球粒径。

图1 正常组与CLA 处理组重力分层

2.2.2 重力分层乳脂肪球粒径参数分析

对重力分层乳样分析脂肪球粒径，结果如图2 所示，横轴表示重力分层层数，纵轴表示粒径大小。对照组和试验组的牛乳粒径随着层数的增加，呈现从F1 层到F7 层逐渐增加的变化趋势。与对照组相比，CLA 处理组中D[3,2]、D[4,3]、DV(10)、DV(50)、DV(90)等粒径参数在F1～F6 各层均显著降低（P<0.05 或者P<0.01）。比表面积（SSA）经CLA 处理后F1～F6 层均显著增加（图2f），其中对照组F1 层SSA 为3 099 m2/kg，而CLA 处理组F1 层SSA 最大达到4 157 m2/kg，F7 层SSA 最小，对照组为1 781 m2/kg，而CLA 组为1 891 m2/kg。

图2 CLA 对重力分层乳脂肪球粒径的影响

2.3 CLA 对不同粒径牛乳中磷脂酰胆碱含量的影响

上述结果表明，经过重力分层后乳脂肪球粒径参数在各层间均有显著差异(P<0.05，P<0.01)，取F1 层小粒径脂肪球和F6 层大粒径脂肪球乳样进行脂质组学分析，结果如图3 所示。与CON 组相比，在F1 层中经CLA 处理后PC（28∶0)、PC（30∶0）、PC（31∶0）、PC（32∶0）、PC（30∶1）的含量显著下降（P<0.05）。在F6 层中变化趋势一样，CLA 组中的21 种PC 化合物如PC（32∶2)、PC（34∶2)、PC（36∶2）、PC（34∶3）、PC（36∶3）、PC（36∶4）、PC（O-40∶1）等含量都显著降低(P<0.05 或P<0.01)。

图3 CLA 对不同粒径牛乳中磷脂酰胆碱含量的影响

3 讨 论

发现在基础日粮中添加CLA 对牛乳乳糖含量、产奶量不造成影响，但显著降低了乳脂肪含量。研究表明，Trans-10,cis-12 CLA 被认定为瘤胃脂肪酸的氢化中间体，对多种哺乳动物的乳脂肪生成起抑制作用[16]，张天颖等[17]在萨能奶山羊中添加CLA 显著降低了羊乳中乳脂含量。VOGEL L 等[18]在奶牛哺乳早期和后期分别饲喂CLA，认为CLA 减少乳脂肪含量与其脂肪酸（FA）从头合成相关。XING Z Y 等[19]在奶牛日粮中添加CLA，与本实验结果一致，均显著降低了乳脂肪含量。表明日粮中添加CLA 可以抑制乳脂肪的合成。在试验中还发现CLA 也影响了乳蛋白的含量，这一点在以前的论文中也有报道，如LOOC J J[20]发现CLA 可降低乳蛋白和非脂乳固体的含量，其机制目前还不清楚，这可能与乳腺分泌时乳脂肪和乳蛋白的合成比例有关。

乳脂肪球作为乳脂的存在形式，其粒径大小与乳脂含量密切相关[21]，给奶牛分别饲喂低精料与高精料日粮，发现低精料日粮处理组的粒径更大[22]。WIKING L等[23]研究了52 头荷斯坦奶牛乳脂球分布与乳脂组成的关系，发现MFG 的平均粒径与奶牛的乳脂肪产量之间存在相关性，乳脂肪含量越少，MFG 平均粒径就越小。为了进一步探究CLA 与乳脂肪球粒径之间的关系，本实验对CON 组和CLA 组的乳样进行重力分层后，分别测定各层之间的乳脂肪球粒径，发现在CLA 处理组中F1 至F6 层中各粒径参数均显著降低，这表明CLA 引起乳脂肪降低的同时，也引起了所有分层脂肪球粒径的减小，表明日粮中添加CLA 可降低MFG 粒径。研究表明，大粒径乳脂肪球与小粒径乳脂肪球相比，粒径更大，SSA 更小[24]。与本实验所测CON 组结果一致，CLA 组SSA 明显变大，符合了小脂肪球SSA 更高的特征。研究发现，MFG 粒径大小会影响牛乳乳品生产和加工[25]。AVRAMIS C A[8]发现当制造埃曼塔奶酪时，小MFG 比大MFG 更能抵抗破裂，并在加工时更好地保持其天然MFGM 微观结构，增加其产量和风味。MFG 的大小与脂质组成密切相关[26]。本研究发现CLA 处理后，牛乳中大粒径（F6 层）和小粒径（F1 层）脂肪球，其粒径降低的同时PC 含量均减少，说明牛乳中PC 含量与乳脂肪球粒径的大小存在一定的联系，也表明CLA 引起的牛乳脂肪下降的主要特征是乳脂肪球粒径减小及PC 含量降低。在细胞内的研究发现，磷脂酰胆碱（PC）作为膜的主要成分，能够影响细胞脂滴[27]，敲除细胞合成PC 的关键酶CCTα 也能影响细胞脂滴的合成，因此CLA 对粒径的作用，可能与奶牛乳腺细胞内PC 调控脂滴的合成有关。

4 结 论

研究通过给奶牛基础日粮中添加CLA，可显著降低乳脂肪含量及乳脂肪球粒径，并且减少了乳脂肪球膜上磷脂酰胆碱的含量。在未来的研究中应该深入了解MFGM 的组成如何随MFG 粒径和乳脂含量的变化而变化，这将对精准生产不同粒径尺寸的MFG 具有重要意义。