乳铁蛋白改善高脂饮食大鼠肝脏胆固醇积累的作用研究

吴昀宣，李德明，何宇然，徐加英，童星，秦立强

（1. 苏州大学公共卫生学院，江苏 苏州 215123；2.苏州大学放射医学与防护学院，江苏 苏州 215123；3.苏州大学苏州医学院实验中心，江苏 苏州 215123）

0 引 言

当前，全球肥胖患病率大幅上升。肥胖不仅与胰岛素抵抗、高血压和心血管疾病等代谢性疾病发病率升高密切相关，也是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的重要诱因。目前药物治疗代谢性疾病的手段较少，且存在不良反应。因此，针对肥胖的发病机制进行营养干预，对延缓肥胖的发生发展和降低肝脏胆固醇积累风险具有重要意义。

乳铁蛋白（Lactoferrin，Lf）是一种主要存在于乳汁、唾液和胆汁中的糖蛋白，属于转铁蛋白家族。Lf最丰富的来源是乳汁，特别是初乳[1]。Lf 具有许多生理功能，如抗氧化、抗炎、抗病毒和抗菌作用等[2]。Lf在调控脂肪细胞发育代谢中发挥重要作用[3]，动物实验发现Lf 能降低高脂饲料（HFD）喂养动物的体重和血脂/肝脂水平[4-7]。脂代谢异常和肝脏胆固醇积累是肥胖的重要特征之一[8]。胆固醇的转化和代谢必须在肝脏完成，主要由内源性胆固醇合成、外源性胆固醇吸收以及机体内胆固醇的外排3 个方面进行调控[9]。人体主要依靠将胆固醇转化为胆汁酸来实现胆固醇的外排，肠道中的胆固醇大多数又通过肠肝循环回流至肝脏并被肝脏重吸收，即胆固醇逆转运（Reverse cholesterol transport, RCT）[9]。体内胆固醇平衡通过转录调节网来维持，肝X 受体（LXRs）分为LXRα和LXRβ2 种亚型，是配体激活的转录因子，属于核受体超家族中的一员。LXRs 与其它核受体超家族成员一起促进胆固醇贮存、转运和分解代谢[10]。本研究以HFD 喂饲大鼠，从LXRα 及其相关基因调节的角度探讨Lf 干预改善肝脏胆固醇积累的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

乳铁蛋白，Hilamr 公司；总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride, TG）试剂盒，南京建成生物工程研究所；动物饲料，戴茨生物科技（无锡）有限公司；引物合成，苏州金唯智生物科技有限公司；逆转录和PCR 试剂盒，翌圣生物科技上海有限公司；DMI8 型显微镜，徕卡显微系统(上海)贸易有限公司；离心机，艾本德（上海）国际贸易有限公司。

1.2 动物和分组

30 只5～6 周龄的雄性SD 大鼠购于浙江维通利华实验动物技术有限公司，饲养于（22±2）°C 的恒温和60%相对湿度，12 h 的日/夜循环的SPF 动物房中。适应性饲养1 周后，随机分为3 组：（1）CON 组，喂饲标准饲料AIN-93G；（2）HFD 组，喂饲高脂饲料（脂肪供能比60%）诱导肥胖模型；（3）HFD+Lf 组，将HFD 中0.4%酪蛋白替换成Lf（委托戴茨生物科技（无锡）有限公司加工）进行饲喂。本研究在HFD 喂养的同时进行Lf 干预，观察其预防效果。在16 周的干预过程中，自由进食饮水，每周记录体重及摄食量。实验经苏州大学动物福利委员会审核批准（202102A077）。

1.3 收集肝脏和小肠标本

干预结束前12 h 禁食，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后腹腔腹主动脉取血离心得血清，迅速分离肝脏和肠组织。取部分肝脏置于10%福尔马林溶液固定，用于组织病理学观察；部分肝脏和生理盐水清洗干净的回肠末端转移到冻存管，于-80 °C 冰箱中保存。用于肝脏脂肪测定和胆固醇代谢相关基因水平测定。

1.4 肝脏TC 和TG 测定

取冷冻保存的肝脏组织，冰浴研磨，离心（2 500 r/min，10 min）取上清，按试剂盒说明书操作测定TG 和TC水平。

1.5 肝脏组织病理学观察

取10%福尔马林溶液固定的肝脏组织，进行常规包埋、切片（4 μm）和苏木精-伊红（HE）染色。切片在显微镜（100 倍和200 倍）下观察并采集图像，并进行脂肪变性评分和NAFLD 活动度评分（NAS）[11]。NAS得分在10 倍镜下任取5 个视野，由肝细胞脂肪变、小叶内炎症和肝细胞气球样变3 方面综合评分。NAS>4分可诊断非酒精性脂肪肝。

1.6 PCR 检测基因表达

取冷冻保存的肝脏及回肠，提取cDNA 后用逆转录试剂盒逆转录为mRNA，按照qPCR 说明书将其与上下游引物及PCR 反应液混合后离心上机，采用2-ΔΔCt 法计算结果，GAPDH 为内部对照。用熔解曲线分析来评估扩增的特异性。所用引物序列Forward Primer（5’to 3’）及Reverse Primer（5’to 3’）分别为：GAPDH:CTCTCTGCTCCTCCCTGTTC,CGATACG GCCAAATCCGTTC;LXRα:TGCCCACTTTACTGA GCTGG,TCTCCAGAAGCATCACCTCG;ABCA1:GG GCTCCTCCCTGTTTTTGA;TCTGAGAAACACTG TCCTCCTTT;ABCG1:ATCATGCGGGACTCGGTA CT,AGAACAGGAAGCCGGAGTTG;ABCG5:CTTAG GTAGCTCAGGCTCAGG,GCCGTTCACAAACACT TCCC;NPC1L1:GTGGCCCCCATAAGGATGAG,AT ACGCTGCTAGACCCCCTT。

1.7 统计分析

数据以均数（Mean）±标准差（SD）表示，用SPSS 26.0 软件（美国SPSS 公司）进行统计分析。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA），然后使用Bonferroni的事后检验进行多重比较。P<0.05 表示2 组间具有统计学差异。

2 结果与讨论

2.1 Lf 对体重、肝脏脂肪含量的影响

干预第16 周时，与CON 组比较，HFD 组大鼠体重显著增加，体重增加超20%，因此HFD 喂饲成功诱导了大鼠肥胖。与HFD 组相比，HFD+Lf 组大鼠的体重显著降低了13%，如图1（a）。相应地，HFD 组大鼠肝脏TG 和TC 含量也显著升高，而Lf 干预抑制了HFD 诱导的肝脏TC 和TG 含量的增加，如图1（b）及图1（c）所示。结果提示Lf 干预具有降低体重和肝脏脂肪含量的作用。

图1 各组大鼠体重、肝脏TG 及TC 含量

2.2 Lf 对肝脏形态学结构的影响

肥胖通常伴有肝脏的脂肪变性，病例组织学是诊断NAFLD 和判断其预后的金标准。肝脏HE 染色后CON 组大鼠的肝细胞形态和结构正常，HFD 组则观察到许多大小不均的脂滴空泡堆积、大泡性脂肪变性和微泡状脂肪变性，显示HFD 诱导了大鼠肥胖和肝脏脂肪堆积。但是HFD+Lf 组的空泡的数量和体积减小，如图2（a）所示。半定量分析进一步显示HFD+Lf组显著降低了HFD 组中升高的steatosis 评分和NAS评分，如图2（b）及图2（c）所示。表明Lf 干预可以改善大鼠肝脏脂滴积累，改善肝脏脂肪变性。AOYAMA Y[12]的研究也发现，Lf 可以显著降低高脂喂养的Cx32ΔTg大鼠肝脏的NAS 评分和纤维化面积，从而缓解其脂肪性肝炎。

图2 各组大鼠肝脏HE 染色以及脂肪变性评分和NAFLD 活动度评分

2.3 Lf 对肝脏胆固醇代谢相关基因表达的影响

LXRα 在肝脏中大量存在，脂肪、肠等组织也普遍存在和表达。LXRα 主要通过参与RCT，促进胆固醇在肝脏中的代谢，促进胆固醇在小肠中的排泄并阻止其外周细胞的摄取等途径，发挥其降低胆固醇的作用[10]。结果发现与CON 组相比，HFD 组大鼠肝脏LXRα 的mRNA 表达水平，有下调趋势，但是HFD+Lf 组LXRα 的mRNA 表达水平显著高于HFD 组，如图3 所示，表示其在Lf 调节胆固醇代谢中发挥作用。在肝脏中，LXRα 通过上调胆固醇转运体（ABCA1、ABCG1、ABCG5）介导外周组织细胞胆固醇流出从而调节RCT 过程[10]，我们也发现Lf 上调了ABCA1、ABCG1 和ABCG5 的mRNA 的表达水平，其中ABCA1 和ABCG5 具有统计学差异，如图3 所示。LXRα 和SREBP 互为拮抗分子，共同维持胆固醇代谢的平衡，SREBP2 是调控胆固醇从头合成的转录因子，并能作用于低密度脂蛋白受体，使细胞摄取更多胆固醇[13-14]，HFD 组大鼠肝脏SREBP2 的mRNA 表达水平显著高于CON 组，HFD+Lf 组逆转其上调，表达水平显著低于HFD 组，如图3 所示，即Lf 显著下调了SREBP2 基因的转录水平，从而降低胆固醇的从头合成并促进胆固醇外排。另外，LXRα 还是调节胆汁酸代谢的核受体，用高胆固醇饲料喂养LXRα 敲除小鼠，不能上调胆汁酸代谢经典途径的限速酶CYP7A1，从而导致肝脏胆固醇积累[15]。我们前期的研究发现Lf 干预高脂高胆固醇膳食喂养小鼠8 周后，增加了粪便中总胆汁酸和结合型胆汁酸含量[6]。结合本研究的发现，我们可以推测，Lf 可能通过调节LXRα增加了胆汁酸排泄，通过下调SREBP2 减少胆固醇的合成，进而减少了肝脏胆固醇积累。

图3 肝脏胆固醇代谢相关基因的表达

2.4 Lf 对肠道胆固醇代谢相关基因表达的影响

在小肠中，LXRα 的激活通过基底侧ABCA1 增加高密度脂蛋白合成，并通过ABCG1 及ABCG5 促进胆固醇外排和经肠道的胆固醇分泌。与CON 组相比，HFD 组大鼠回肠末端LXRα 的mRNA 表达水平有下调趋势，但是HFD+Lf 组LXRα 的表达则显著高于HFD 组。与HFD 组比较，ABCA1、ABCG1 和ABCG5的表达水平则显著上调，如图4 所示。因此，Lf 上调小肠LXRα、ABCA1、ABCG1 和ABCG5 的mRNA 水平，从而促进胆固醇外排。另外，HFD 组大鼠肠道胆固醇吸收相关蛋白NPC1L1 的mRNA 表达水平显著高于CON 组，HFD+Lf 组的表达水平显著低于HFD 组，如图4 所示。LXRα 能通过抑制NPC1L1 直接抑制胆固醇吸收[9]。同时，Lf 下调了NPC1L 的基因表达，从而抑制了胆固醇吸收。Lf 是乳清蛋白的重要组成成分，我们前期的研究也发现乳清蛋白能显著上调HFD 喂养小鼠的肠道LXRα 和ABCG1 蛋白表达，增加胆固醇外排[16]。

图4 肠道胆固醇代谢相关基因的表达

3 结 论

综上所述，Lf 干预缓解了HFD 导致的肝脏脂肪积累，这可能与Lf 上调肝脏和肠道的LXRα、ABCA1和ABCG5 的mRNA 水平，下调肝脏SEBP2 及肠道NPC1L1 的mRNA 表达水平，从而促进胆固醇的外流，并减少肠道胆固醇的吸收有关。