羊乳酪蛋白2 种不同膜分离方法比较研究

李欣雨，孟毅，贺宝元，周妍，魏怡，连严慧，张磊，土双静，薛海燕

（1.陕西科技大学食品科学与工程学院，西安 710021；2.陕西科技大学轻工科学与工程学院，西安 710021；3. 陕西金牛乳业有限公司，陕西 渭南 714000）

0 引 言

羊乳成分被公认为最接近人乳[1]，因其自身超高的营养价值和独特的风味被誉为“奶中之王”[2]，因此羊乳成为了婴幼儿配方奶粉的良好原料[3]。要实现羊乳成分的母乳化调配通常需要降低羊乳总蛋白的含量，减少酪蛋白增加乳清蛋白以此来改善二者比例，所以羊乳中分离酪蛋白是组分化生产羊乳的关键[4]。目前，分离酪蛋白最常见的方法为酶法沉淀和酸法沉淀，但酶法和酸法分离酪蛋白容易受到pH 和温度的影响，使得酪蛋白的持水性较差，盐离子浓度的增加也会减弱酪蛋白的乳化性和乳化稳定性[5]。膜分离技术是在分子水平上不同粒径分子的混合物在透过半透膜时，实现选择性分离的技术[6]。膜分离技术是物理过程，所以具有能耗低、效率高、操作条件温和、对热和酸的敏感性较低等优点，适合于处理热敏物质[7]。通过膜分离技术制备的酪蛋白胶束粉的天然结构不会被破坏，溶解度更好，同时乳清粉的变性程度也较低[8]。利用膜分离技术生产的羊乳清粉，其营养价值高，功能性优良，可广泛用于婴幼儿配方奶粉、功能性食品等领域[9]，截留液中的酪蛋白也可用于生产干酪制品。

国内，张雨萌等[10]通过膜分离建立了牛羊乳酪蛋白和乳清蛋白的分离效果对比研究；李志宾等[11]利用膜分离提取牛乳中乳清蛋白，在一定程度上保护了乳清蛋白中的生物活性成分；陈建行等[12]通过比较100 nm和40 nm 孔径的陶瓷膜对酪蛋白和乳清蛋白的分离效果，发现40 nm 孔径的陶瓷膜能够更好得到清澈透明的乳清。ZULEWSKA J 等[13]在50 ℃的条件下得出，聚合物膜与陶瓷膜相比对血清蛋白的截留率更高；HURT E 等[14]在50 ℃条件下将牛乳用陶瓷膜恒压微滤，使得乳清蛋白的脱除率达到98.3%[15]，而目前有关羊乳的膜分离技术研究还较少。

本研究采用不同孔径的中空纤维膜和卷式有机膜对脱脂羊乳进行分离，其中截留液可用于制作酪蛋白胶束粉或者干酪产品，渗透液则可用于制备高品质的乳清蛋白产品[15]。对微滤过程中膜通量、料液组分构成、pH 值、电导率值、颜色、脱除率和膜的污染与清洗等方面进行分析，评估量化膜截留酪蛋白的能力。并对透过液和截留液分别进行浓缩、喷雾干燥，期望能够获得纯度较高的酪蛋白胶束粉，为工业化生产羊乳基料提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜液态羊乳，陕西金牛乳业有限公司；小牛皱胃酶，上海源叶生物科技有限公司；浓盐酸（分析纯），南昌市昌九化工厂；无水氯化钙，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；十二烷基硫酸钠（SDS），美国Amersham 公司；β-巯基乙醇，普洛麦格（北京）生物技术有限公司；N,N,N',N'-四甲基乙二胺，上海源叶生物科技有限公司；考马斯亮蓝R-250，加拿大Bio Basic 公司；浓盐酸，北京化学试剂厂；冰醋酸，广州化学试剂厂；无水硫酸钾，天津科密欧公司；无水硫酸铜，天津天力化学试剂公司；四甲基乙二胺（TEMED），美国Sigma 公司。

1.2 仪器与设备

高速冷冻离心机（HC-3018R），安徽中科中佳科学仪器有限公司；电导率仪，上海般特仪器制造有限公司；pH 计（PB-10），赛托利斯科学仪器（北京）有限公司；卷式有机膜过滤装置，同舟纵横（厦门）流体有限公司；中空纤维素膜，美国通用电气公司；移液枪（Transferpette），德国BRAND 公司；蛋白质电泳仪，南京新校园生物技术研究所；稳压电源，鸿宝电气股份有限公司；半自动凯式定氮仪（KN780），阿尔瓦仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 膜过滤操作、样品pH 值和电导率的测定

1.3.1.1 膜参数及切向流过滤原理

膜基本参数如表1 所示。

表1 膜基本参数

切向流过滤与直流过滤原理不同，其原理如图1所示，过滤速度能在相对长的一段时间里保持在一个较高的水平，可以实现连续化运行，工业生产过程主要使用切向流过滤。

图1 切向流

1.3.1.2 中空纤维膜过滤操作流程

首先将800 mL 脱脂鲜羊乳加入物料罐中，打开电源后开泵，设备运行30 s 后调节进口压力阀（137.9 kPa)，设备继续运行1 min 平稳后开始计时收集所需样品。在透过液管下端放置第一个烧杯收集透过液1 min，之后每间隔2 min 更换烧杯收集1 min，将收集液按顺序进行编号1.2.3……。每个时段收集结束，立即测定每一个烧杯中透过液的体积、pH 和电导率，同时再将每个烧杯中的透过液混匀以观察颜色。物料罐中的膜上截留液回流至物料罐混合均匀后立即测定pH 和电导率，测定后立即倒回物料罐混匀，每2 min 循环一次。循环操作直至物料罐中样品达到物料罐最小容纳体积量（200 mL）时关泵。

1.3.1.3 卷式有机膜过滤操作流程

首先将4 000 mL 脱脂鲜羊乳加入物料罐中，打开电源后开泵，设备运行30 s 后调节进口压力阀（25 kPa)，设备继续运行1 min 平稳后开始计时收集所需样品。在透过液管下端放置第一个烧杯收集透过液1 min，之后每间隔2 min 更换烧杯收集1 min，将收集液按顺序进行编号1.2.3……。每个时段收集结束，立即测定每一个烧杯中透过液的体积、pH 和电导率，同时再将每个烧杯中的透过液混匀以观察颜色。物料罐中的膜上截留液回流至物料罐混合均匀后立即测定pH 和电导率，测定后立即倒回物料罐混匀，每2 min 循环一次。循环操作直至物料罐中样品达到物料罐最小容纳体积量（200 mL）时关泵。

利用pH 计和电导率仪直接测量各溶液的pH 和电导率，使用前分别在室温下进行仪器校正。

1.3.2 料液蛋白质含量分析

采用凯式定氮法，对脱脂乳、截留液和渗透液中的总氮、非蛋白氮和非酪蛋白氮含量进行测定。总氮含量参照文献[16]测定，此方法测定的值包括蛋白氮和非蛋白氮；按照GB/T21704—2008《乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定》方法测定非蛋白氮含量[17]；按照王宜生[18]方法对非酪蛋白氮含量进行测定。按式（1）～（4）计算各蛋白含量：

1.3.3 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）蛋白质鉴定与分析

利用凝胶电泳测定各个阶段的截留液和透过液中蛋白质类型及大致含量。分离胶的质量分数为12.5%，将截留液（稀释10 倍）、透过液和脱脂乳（稀释5 倍），按照1∶1 的比例加入2×SDS 裂解液，摇匀后于恒温器95 ℃加热1 min，离心后取10 μL 点样，电泳结束后用考马斯亮蓝对凝胶进行染色，脱色至胶背景透明用凝胶成像仪进行拍摄。

1.3.4 膜通量、浓缩倍数与脱除率的计算、膜的污染与清洗

膜通量的计算公式：

式中：F为膜通量，L/(m2·h)；V为渗透液的体积，L；J为膜面积，m2；t为过滤时间，h。

浓缩倍数的计算公式：

式中：M为脱脂羊乳的质量，kg；m为过滤过程中某个时间渗透液的质量，kg。

膜对乳清蛋白脱除率的计算公式：

式中：M1为渗透液中乳清蛋白的质量，g；M2为脱脂乳中乳清蛋白的质量，g。

膜对酪蛋白脱除率的计算公式：

式中：M1为截留液中酪蛋白的质量，g；M2为脱脂乳中酪蛋白的质量，g。

纯水通量衰减系数（WFD），可衡量膜的污染程度，值越大表示膜污染程度越高。

式中：J0和Jt分别为膜过滤前及过滤后只用水清洗一次后的纯水通量，L·m-2·h-1。

纯水通量恢复系数（WFR），用于衡量膜的清洗效果。

式中：JQ和J0分别表示膜过滤前和清洗后的纯水通量，L·m-2·h-1。

1.4 数据处理

各实验均重复进行3 次，结果表示为±s。利用SPSS 18.5 和Origin Pro 9.1 软件对实验数据进行统计处理与绘图分析。采用方差分析法进行差异显著性比较。

2 结果与分析

2.1 不同孔径中空纤维膜羊乳蛋白分离效果对比

2.1.1 不同孔径中空纤维膜所得透过液外观比较

为了充分对比3 种孔径中空纤维膜对脱脂乳中乳蛋白的分离效果，试验过程中对这几种膜所得渗透液进行了外观对比。由图2 可知，100、300 ku 和750 ku中空纤维膜渗透液分别呈清澈透明的黄绿色、轻微白色混浊和严重白色混浊，渗透液呈现黄绿色是含有VB 的缘故，ZULEWSKA J 等[19]研究发现透过液中的白色浑浊是由于部分酪蛋白发生渗透所造成的。

图2 不同孔径中空纤维膜所得透过液外观

2.1.2 不同孔径中空纤维膜羊乳蛋白分离效果定性分析

由图3 可以看出，100、300、750 ku 这3 种孔径的中空纤维膜对酪蛋白和乳清蛋白的分离效果是不同的，其中100 ku 的膜在过滤后酪蛋白和乳清蛋白均被截留，透过液中不含乳清蛋白，表明该孔径并没有将其分离，只是进行了浓缩；300 ku 的膜在过滤后可以看出有少量的乳清蛋白存在于透过液中，同时截留液中依然存在部分乳清蛋白，表明酪蛋白和乳清蛋白并未完全分开；750 ku 的膜可以将酪蛋白和乳清蛋白有效地分离，大部分的乳清蛋白均被透过，只有极少部分的乳清蛋白存于截留液中，表明该孔径的膜过滤效果较好。综上所述，750 ku 的中空纤维膜能够有效地将酪蛋白和乳清蛋白分离。

图3 中空纤维膜乳蛋白分离SDS-PAGE

2.1.3 不同孔径中空纤维膜羊乳蛋白分离效果定量分析

由表2 可以看出，随着中空纤维膜孔径的增大，酪蛋白占真蛋白的比例在截留液中有所增加，在透过液中减小；清蛋白占真蛋白的比例在截留液中减小，在透过液中增加。结合蛋白质的电泳定性分析，实验选择750 ku 的中空纤维膜可以兼顾截留酪蛋白和有效滤除乳清蛋白。

表2 3 种中空纤维膜乳蛋白分离样品的蛋白质含量

2.1.4 中空纤维膜截留液与透过液pH 和电导率的测定

由图4（a）和（b）可知随着时间的延长截留液的pH升高，透过液的pH 降低。这是由于在过滤中H+透过膜进到透过液中导致透过液pH 降低，截留液pH 增加。

图4 中空纤维膜截留液与透过液pH、电导率随过滤时间的动态变化

电导率能够及时反映液体物料体系中电解质的多寡，是动态跟踪膜过滤过程的良好指标。由图4 的（c）和（d）可知，截留液的电导率随时间逐渐降低，而透过液的电导率则增大。这是由于在过滤中Na+、K+、P3-等离子透过膜进到透过液中导致透过液电导率上升，截留液电导率下降。这与李启明等[20]的研究结果一致，牛乳中的Na+、K+、Cl-等一价离子几乎全部在乳清相中，呈可溶性状态。

2.2 不同孔径卷式有机膜羊乳蛋白分离效果对比

2.2.1 不同孔径卷式有机膜所得透过液外观比较

为了充分对比2 种孔径卷式有机膜对脱脂乳中乳蛋白的分离效果，试验过程中对这几种膜所得渗透液进行了外观对比。由图5 可知，0.1 μm 和0.45 μm 卷式有机膜渗透液呈清澈透明的黄绿色和轻微白色混浊的黄绿色，这说明0.45 μm 膜过滤时有酪蛋白透过。

图5 不同孔径卷式有机膜所得透过液外观

2.2.2 不同孔径卷式有机膜羊乳蛋白分离效果定性分析

由图6 所示，脱脂乳在0.1 μm 的卷式有机膜过滤后酪蛋白几乎全部被截留，同时大部分的乳清蛋白均被透过；0.45 μm 的膜过滤后，有一部分的酪蛋白进到了透过液中，表明该孔径的膜偏大。综上所述，0.1 μm 孔径的卷式有机膜能够有效的将酪蛋白和乳清蛋白分离。

图6 卷式有机膜乳蛋白分离SDS-PAGE

2.2.3 不同孔径卷式有机膜羊乳蛋白分离效果定性分析

由表3 可知，当卷式有机膜的孔径增大时，截留液中酪蛋白占真蛋白的比例增加，乳清蛋白占真蛋白的比例减小；透过液中酪蛋白占真蛋白的比例明显增加，乳清蛋白占真蛋白的比例明显减少。结果表明，0.1 μm 的膜可以有效截留酪蛋白并滤除乳清蛋白。

表3 2 种卷式有机膜乳蛋白分离样品的蛋白质含量

2.2.4 卷式有机膜截留液与透过液pH 和电导率的测定

如图7（a）和（b）所示，随着过滤时间的延长，截留液的pH 逐渐上升，透过液的pH 逐渐下降。截留液pH 在5.8～7.4 之间，透过液pH 在6.2～6.6 之间，变化趋势较小，这是由于分离过程中离子变化导致的。

图7 卷式有机膜截留液与透过液pH、电导率随过滤时间的动态变化

如图7（c）和（d）所示，截留液与透过液的电导率呈现相反的趋势，随着分离时间的延长，截留液电导率逐渐降低，透过液电导率逐渐增加，截留液电导率在6.16～6.32 间进行波动，透过液电导率在6.25～6.50间波动，两者的变化浮动都比较缓慢，0.45 μm 膜分离的截留液与透过液均略高于0.1 μm。电导率变化趋势与中空纤维膜一致。

2.3 膜通量的比较

由于酪蛋白和乳清蛋白直径有很大差异，因此可以通过膜技术对其进行分离。膜过滤过程中，随着时间的推移，截留液中固形物含量和料液黏度不断增加，膜表面浓差化现象加剧且膜过滤的阻力增加，导致膜通量下降[21]。由图8 可知，100、300、750 ku 的中空纤维膜初始膜通量分别为25.6、26.4、21.97 L/(m2·h)，使用后膜通量为9.2、10.1、10.9 L/(m2·h)；0.1 μm 和0.45 μm 的卷式有机膜初始膜通量为29.5 L/(m2·h) 和42.9 L/(m2·h)，使用后膜通量为20.1 L/(m2·h)和34.1 L/(m2·h)。卷式有机膜形成“二次膜”的速度小于中空纤维膜。由表2～3可知，750 ku 的中空纤维膜和0.1 μm 的卷式有机膜过滤效果较好。综上所述，0.1 μm 的卷式有机膜即能有效地分离乳蛋白又能较慢的形成滤饼层。

图8 中空纤维膜与卷式有机膜通量变化

2.4 膜的清洗与污染

在整个过滤过程中经过不断的稀释，滤饼层逐渐形成，中空纤维膜和卷式有机膜的膜通量由最初的142、435 L/(m2·h)降至51.5、262.5 L/(m2·h)，这是因为在膜表面形成了一层滤饼，增加了渗透液体的阻力，说明膜受到了一定程度的污染。稀释过滤后对2 种膜分别进行了1 mol/L NaOH 清洗、pH=3 磷酸清洗和0.3 %次氯酸钠与NaOH 混合清洗。污染与清洗情况如表4 所示，由表4 数据可知750 ku 中空纤维膜的纯水通量衰减系数（63.7%）大于0.1 μm 的卷式有机膜的纯水通量衰减系数（39.7%），说明在过滤过程中中空纤维膜的污染速度较快，污染程度较高。同时可以看出，以上的3 种清洗方法中，次氯酸钠与NaOH 混合清洗后中空纤维膜的纯水通量恢复系数为88.5%；卷式有机膜的纯水通量恢复系数为97.1%，清洗效果优于其他2 种清洗方法，膜通量得到了很好的恢复。综上所述，0.1 μm 的卷式有机膜用次氯酸钠与NaOH 混合的方法清洗膜通量恢复效果最佳。

表4 不同阶段纯水通量变化

2.5 最佳膜分离效果比较

由表5 可知，750 ku 中空纤维膜过滤后，透过液中羊乳酪蛋白脱除率为98.8 %，截留液中乳清蛋白脱除率为82.7 %；0.1 μm 卷式有机膜过滤后透过液中羊乳酪蛋白脱除率为99.6 %，截留液中清蛋白脱除率为82.7 %。与徐殊等[22]采用100 nm 陶瓷膜所分离酪蛋白和乳清蛋白相比，分离效果更佳。膜法分离能够有效的截留酪蛋白，可用于奶酪的生产。透过液中清蛋白/酪蛋白的比值都大概为11，比原料乳中的0.22 提高了50 倍，该乳清蛋白与酪蛋白的比例满足婴幼儿配方奶粉的应用要求。比较2 种膜分离过程中膜通量的变化来看，0.1 μm 卷式有机膜出现“二次膜”的速度较慢，污染程度更低，清洗后膜通量恢复率更大，表明其更易于清洗和恢复。与传统的酶法和酸法提取酪蛋白相比，膜法所得的酪蛋白中不含残留的凝乳酶、发酵剂、乳酸等，更加绿色环保，所以0.1 μm 卷式有机膜更适于工业化应用。

表5 最佳膜分离效果比较

3 结 论

将2 种不同材质的中空纤维膜（100、300、750 ku）与卷式有机膜（0.1 μm、0.45 μm）进行比较分析后发现，750 ku 中空纤维膜和0.1 μm 卷式有机膜既能将酪蛋白较好的截留，又能有效的将乳清蛋白透过，2 种孔径膜通过实验得到的平均膜通量值分别是25.7 和25.2 L/(m2·h)。比较膜的污染与清洗结果，0.1 μm 卷式有机膜纯水通量衰减系数（39.7%）小于750 ku 中空纤维膜系数（63.7%），说明该卷式有机膜污染慢，污染程度低，通过3 种膜清洗方案比较，发现次氯酸钠与NaOH 混合液清洗的效果最佳，使750 ku 中空纤维膜的水通量恢复系数达到88.5%，0.1 μm 卷式有机膜的纯水通量恢复系数达到97.1%。综上所述，0.1 μm 卷式有机膜是最适合分离乳蛋白的膜。