乳源酵母种类及对乳制品作用的研究进展

但霞，李玲，黄钰涵，曾庆坤

（1.广西壮族自治区水牛研究所，南宁 530001；2.广西水牛乳工程技术研究中心，南宁 530001）

0 引 言

酵母是食品、医药等工业生产中使用较广泛的发酵真菌，能够合成各种酯类、生物酶、蛋白等多种物质。在传统的工业生产中，酵母一直被视为乳制品的腐败菌类，同时，因牛奶中含有乳糖，而大部分酵母并不能直接利用乳糖，故牛奶不是酵母最理想的发酵基质，其在乳制品中发酵能力不及乳酸菌。但近年来不少研究表明，酵母参与乳制品发酵，特别是在干酪成熟过程中发挥着重要作用，比如促进奶酪的成熟、赋予奶酪、开菲尔等特殊的风味，以及抑制有害微生物等[1-2]。随着居民生活水平的不断提升，我国乳制品消费逐年走高，除液态乳外，人均奶酪消费量也从2017年的不足0.1 kg 提升到2021 年的0.31 kg，市场规模更是突破百亿元，成为消费增速最快的乳制品，拥有巨大的市场潜力。消费者对乳制品的多元化需求也日益增加，深入开展乳源酵母的研究可为乳制品生产开发带来更多可能。

1 酵母参与发酵的乳制品种类

1.1 奶酪

奶酪被誉为奶中黄金，世界上有超过1 400 种奶酪。这些奶酪按外观类型可分为新鲜奶酪、花皮奶酪、涂抹成熟奶酪、生硬奶酪、熟硬奶酪和蓝纹奶酪；按制作方法又可分为酸凝型奶酪和凝乳酶型奶酪；按发酵类型可分为自然发酵型和人工接种发酵型奶酪[3]。传统的奶酪采用生奶制作，微生物菌群复杂，从而造成了产品质量的不稳定，近代的巴氏灭菌和微生物技术使奶酪产品均一性大大提高，让奶酪规模化生产成为可能[3]。

酵母是奶酪次生菌群的重要组成部分，是第一个在奶酪表面定居的微生物，奶酪的低pH 值、低水分、高盐以及需要低温成熟和贮藏等生理特性有利于酵母的生长。大多数酵母菌的生长依赖于乳酸、柠檬酸和其他有机酸的同化，酵母代谢乳酸后产生的水和二氧化碳提升了pH 值，pH 值的增加则成为了奶酪成熟的标志。同时，酵母参与奶酪成熟过程中的蛋白质水解、脂解、剩余乳糖发酵等过程，最终改变了奶酪的风味、外观以及质构等特性[1,4]。然而大部分奶酪制作并不直接接种酵母，生奶和奶酪制作环境可能是奶酪成熟期酵母的重要来源[5]。

1.2 开菲尔

开菲尔（Kefir）起源于俄罗斯北高加索地区，是一种由乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等多种微生物共同发酵的酸性、黏性、低酒精含量的乳制品饮料，在我国西藏、内蒙古地区也有较长的食用历史。开菲尔粒的形成始于开菲尔乳杆菌（Lactobacillus kefiranofaciens）和酵母菌（Saccharomyces.spp)的自聚集行为，随后开菲尔乳杆菌开始附着在颗粒表面并生产生物膜，并与牛奶中的其他生物和成分共聚集形成颗粒。开菲尔因其多种益生功能，包括降压、降胆固醇、抗糖尿病、抗癌、抗炎、抗氧化、抗过敏和免疫调节特性，被食品技术专家协会（Institute of Food Technologist，IFT）称为“2021 年需要关注的9种食品趋势”之一[6-7]。研究发现其在发酵24～48 h 后获得最佳抗菌性能[8]。JALALI F 等[9]发现开菲尔能够诱导急性白血病细胞凋亡并抑制其增生，有治疗白血病的潜力。此外，开菲尔还能通过直接接触法去除谷物表面的黄曲霉毒素G1（Aflatoxin G1，ATG1）[10]。传统的开菲尔是由鲜奶通过自然发酵而成，依托现代化食品生产技术，国内外已有多个开菲尔酸奶产品上市，并且不断有功能型的开菲尔发酵乳产品相继面世。然而，现有的产品多数基于单菌株发酵，传统发酵法的工业放大生产在开菲尔粒多次重复发酵后，其功能活性显著降低，菌落组成也发生了改变[2]，因此，对开菲尔产品的研究和开发还有待更深入地探索。

1.3 马奶酒

马奶在中国北方已有上千年的饮用历史，生马奶含有丰富的营养，其成分跟人乳非常相似[11]。马奶传统的食用方式则是发酵成为酸马奶酒（koumiss 或kumis），其发酵工艺主要有乳酸发酵和酒精发酵2种。发酵温度是该工艺生产的关键因素，夏季最适宜发酵温度为25～26 ℃，冬季则为28～30 ℃[12]。MENG Y等[13]基于高通量测序（HTS）的微生物学分析表明：酸马奶中乳酸菌、醋酸菌和多种酵母菌为发酵优势菌群，且哈萨克斯坦酵母和假丝酵母2 个属的真菌提供了酸马奶的挥发性化合物合成。MU Z 等[14]鉴定了中国多个代表的地区的酸马奶酵母菌群，马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus），单孢哈萨克斯坦酵母（Kazachstania unispora）以及酿酒酵母菌群生长量最高。酸马奶及其分离的多种菌株都被证实有益生功能，因其能够提高机体免疫力，成为蒙医的一种传统疗法[15]。早在1858 年，俄国医生N V POSTNIKOV发现用酸马奶治疗肺结核病人的有效性，并决定将酸马奶引入医疗实践，现有研究也证明酸马奶在降胆固醇、降压、改善动脉血管硬化、抗癌等方面有积极的作用[11,15]。但马奶产量较小，产区较为分散，奶源质量和制作方法的不同使其具有较大的地域差异，且酸马奶酒的生产大部分依靠传统手工，品质参差不齐[16]。酸马奶跟开菲尔一样属于复合菌群发酵，因而难以进行工业化生产，且其酒精度低，不易保存，易引发食品安全问题[17]。因此，探索酸马奶功能的形成机制，改善其生产方式是目前的研究方向。

2 主要的乳源酵母菌种类

由于乳制品中酵母可代谢糖含量少，因而限制了在其上生长的酵母种类，目前分离发现主要的酵母种属有德巴利酵母（Debaryomyces.spp），地丝菌属（Geotrichum.spp），克鲁维酵母（Kluyveromyces.spp），假丝酵母（Candida.spp），毕赤酵母（Pichia.spp）和耶氏酵母（Yarrowia.spp）。其中乳糖阳性酵母克鲁维酵母和戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）在盐化后的奶酪中酵母菌群占主导地位，而德巴利和克鲁维酵母在一些乳制品中能够占到酵母种群的60%以上[5,18-19]。图1 根据文献整理了各种常见奶酪中发现的酵母种类。7 大类型的奶酪中均有分布的是汉森德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica），其次是克鲁维酵母，除蓝纹和霉菌奶酪外的奶酪中均有分离到，这得益于该菌株的乳糖降解能力。假丝酵母属是分布最普遍的种属，各个类型的奶酪中均含有不同种的假丝酵母菌株，DONNELL Y[3]报道称在生产巴氏杀菌软奶酪和半硬奶酪的过程中使用假丝酵母辅助培养，其味道和香气更接近于从生奶奶酪中获得的味道。腌制型奶酪的菌群最为丰富，这是由于奶酪生产过程会浸泡在含盐的卤水中，湿润且带有营养的卤水成为酵母的聚集地，多样化的菌群对奶酪的风味也有显著的影响[20]。在此着重介绍5 种乳制品中常见的酵母。

图1 不同奶酪中酵母的种类[2]

2.1 汉森德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)

该菌属于半子囊菌纲，酵母菌目和酵母菌科，对碳底物有广谱同化能力，如葡萄糖、木糖、鼠李糖、蔗糖、海藻糖、阿拉伯糖、麦芽糖、棉子糖、核糖、半乳糖、甘油、甘露醇、葡萄糖醇、肌醇、柠檬酸、琥珀酸等，但尚未发现其能同化乳糖[21]。此酵母在奶酪酵母菌群中的占比最大[20]，这是由于该菌株有较强的耐冷、耐旱和耐盐能力，它可以在高达4 mol/L NaCl 的高盐条件下生存，因此常分离于高盐发酵食品和海水中[22]。德巴利酵母的耐盐机制主要通过3 个应激反应来协同实现：首先，在高盐胁迫下，酵母细胞膜不饱和脂肪酸和磷脂含量增高，从而提高细胞膜的流动性和缩小细胞膜上的孔径，减少胞内外液质交流，阻止胞内甘油的流失；其次，德巴利酵母的质膜蛋白编码基因（DhENA1）在高盐刺激下高表达，使质膜蛋白的ENA-ATPase 加快挤压或者转运胞内的Na+和K+，以维持胞内离子平衡，保护细胞不受高盐影响；最后，在高渗透甘油信号通路（HOG）应激反应下，刺激酵母甘油脱氢酶基因GDP1、GDP2高表达合成大量甘油，转运蛋白STL1基因高表达加速转运甘油，与细胞膜协同提高胞内甘油含量，增加酵母在高渗透环境中的抗渗透压能力[23-25]。因其优异的耐盐特性，德巴利酵母成为同化乳酸、产生碱性化合物（如氨）从而增加奶酪pH 值的主要贡献者[20]。

德巴利酵母在果蔬采后病原体防治上也表现良好，可帮助木瓜、猕猴桃等水果实现采收后果实炭疽病的生物防治[26-27]。食源性的德巴利菌产生的真菌毒素对致病性念珠菌有抑制作用[28]，可用于防止发酵食品中不良微生物的扩散[29]，例如与迷迭香叶联合使用均可作为生物防治剂，抑制干腌发酵香肠工业加工过程中赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）的产生，还能抑制青霉菌的生长[30-31]。该酵母抑菌机制主要分4 种：①产芳香醇降低致病菌黏附力；②产蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶活性介导植物病原真菌的细胞壁降解；③接种在植物上后能刺激植物产生抗菌素；④分泌抗真菌挥发性化合物来抑制青霉菌的生长[32]。此外，该菌还被证实具有较强的排砷能力，能减少水稻的重金属砷的污染[33]。

2.2 克鲁维酵母(Kluyveromyces.spp)

包括乳酸克鲁维酵母和马克思克鲁维酵母2 个种，这2 种酵母的糖同化谱广泛，且能降解乳糖。近年来2 种克鲁维酵母在工业生产中备受瞩目，这是因为其能够产生β-半乳糖苷酶和乳糖透性酶，且不受克雷布特效应（Crabtree effect）的影响，可实现高浓度发酵[34]，同时还有极强的耐热特性和快速生长的能力，生产效率高。其中马克思克鲁维酵母可参与大约50 种异源蛋白的高效合成（其中包括一种嗜热酶）[35-39]，特别是乳糖酶以及生物乙醇的高效生产[34]。此外，在酒类发酵中，马克思克鲁维酵母也表现良好，在龙舌兰、葡萄酒、黄酒等多种酒类发酵中都为酒带来了优质的风味特性[40]。

良好的乳糖降解能力使克鲁维酵母能够定殖于各种发酵乳制品，也使其与乳酸菌一起参与了奶酪成熟的初期阶段，对奶酪风味有较大的影响[41]。研究表明，约5 log CFU/g 浓度的克鲁氏菌酵母辅助发酵可增强奶酪挥发性芳香化合物的形成[1]。克鲁维酵母也具有较强的渗透压耐受能力来适应奶酪的高盐环境，其机制是通过增加GPD1表达来增加甘油合成，增加STL1表达来增加从细胞外环境输入的甘油，并通过减少通道蛋白FPS1表达来减少甘油外流，从而增加菌株生存能力[42]。但2 种克鲁维酵母也存在耐受差异，GONALVES D 等[5]通过对葡萄牙不同奶酪样微生物菌群的比较发现马克思克鲁维酵母主要分布在冬季样品中，乳酸克鲁维酵母主要分布在春季样品中，并且在奶酪成熟和最终的感官特性中发挥重要作用，这也从侧面说明马克思克鲁维酵母更耐低温。

2.3 白地霉(Geotrichum candidum)

白地霉有明显的霉菌菌落形态，最初被划分为霉菌，一直到1983 年，这一类菌株才被划分至酵母属[43]。白地霉形态多样，拥有丰富的酶系统和多样化的代谢途径，因而具有较强的风味物质发酵能力，广泛用于白酒酿造、奶酪发酵等食品以及有机物合成行业。在乳制品生产中，白地霉同样有较强的风味物质发酵能力，能分解奶酪含硫氨基酸，如蛋氨酸，产生令人满意的大蒜或卷心菜香气。著名的法国软质奶酪布里（Brie cheese）和新鲜的羊绒奶酪就是接种白地霉发酵而成。研究还发现白地霉是5 种常见奶酪酵母菌中唯一能产生S-甲基硫酯的酵母菌，而甲基硫酯是多种风味物质的前体；李智昊等发现白地霉也是云南开菲尔粒风味物质的主要贡献者[44-45]。

奶酪中的苦味源自于酪蛋白的水解肽，特别是含有脯氨酸的肽，以及N 端含有赖氨酸和精氨酸的肽。白地霉可以产生氨基肽酶，降解相关肽链从而减少奶酪产生的苦味，BOUTROU R 等[43]也指出，白地霉在奶酪中它的作用主要是水解肽而不是水解蛋白[3,45]。

2.4 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

酿酒酵母是第一个用于食品工业的酵母菌株，也是目前研究最多的单细胞真核生物，它具有已知的遗传和生理背景、多维度的基因工具可用性、高密度和大规模发酵的相容性，可优化多种产品的发酵途径，因而广泛运用于食品、酿造、医药、合成等生产中[46]，如独立合成类黄酮、类二苯乙烯和生物碱家族中有价值的次生代谢物[47]、各种酒类发酵等。

酿酒酵母也是乳制品中普遍存在的菌种，通过对西藏开菲尔的测定发现酿酒酵母是其中最大的优势菌，且在不同发酵条件、不同发酵剂的接种样中的菌群数量没有显著变化[48]；GUO L 等[49]通过对内蒙古酸马奶的菌群研究发现酿酒酵母和克鲁维酵母为其中的优势真菌种群。但酿酒酵母普遍不能利用乳糖，所以在乳制品中主要靠代谢氨基酸、有机酸、其他糖类等物质生存。

2.5 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)

解脂耶氏酵母在多种类型的奶酪和开菲尔中均有分离，该酵母因其显著的脂肪分解能力而受到关注，被广泛运用于工业生产中。王永丽[50]通过在奶酪里接种德巴利酵母和解脂耶氏酵母发现，两种酵母在奶酪中会相互促进生长，增加奶酪的香味和蛋白酶活性，同时降低了奶酪的硬度。CENTENO J A 等[51]发现约5 lg CFU/g 的解脂耶氏酵母能够改变奶酪风味轮廓，并有助于提升意大利奶酪的质量。近年来，解脂耶氏酵母已被工业化地用于合成多种萜类化合物，例如柠檬烯、芳樟醇、α-法尼烯、角鲨烯、β-胡萝卜素、番茄红素和虾青素等[52]；还能利用蓖麻油为底物合成γ-癸内酯[53]。袁围等在发酵甘油生产丙酮酸上取得较大突破，他们利用基因工程技术使解脂耶氏酵母在96 h 发酵时间内丙酮酸产量达到了110.4 g/L。不少研究表明，解脂耶氏酵母是奶酪中生物胺的主要生产者，包括酪胺、尸体胺、腐胺和2-苯乙胺，但在对奶酪等产品的检测中并不能检测到生物胺[1]，因此适当的控制酵母发酵是可以提升乳制品的风味和品质。

3 酵母菌对乳制品的影响

3.1 对乳制品风味的影响

酵母有较强的脂肪酶、蛋白酶合成能力，能够分解乳制品中的大分子蛋白和脂肪形成游离脂肪酸（Free fatty acids，FFAs） 和游离氨基酸（Free amino acids，FAAs）。FAAs 和FFAs 在发酵或者成熟过程中的进一步代谢产生了对奶酪等乳制品香气很重要的风味化合物。FAAs 的分解代谢，特别是支链氨基酸、芳香族氨基酸和硫类氨基酸，主要产生醛类、醇类、羧酸类和硫类化合物；FFAs 则参与了风味化合物产生的合成反应，如二次醇类、羧酸类、酯类、内酯类和酮类，因而不同酵母因为酶谱的不同会形成不同的香气风格[54]。LI Y 等[55]实验发现接种酿酒酵母、克鲁维酵母的奶酪均有较强的水果、苹果和菠萝香气，经测定酵母产生了丁酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯等酯类，以及3-羟基-2-丁酮、2-庚酮和2-戊酮等风味物质，2-庚酮等化合物可提供微甜的酯蜡香气，给奶酪更饱满的风味。ZHANG 等[56]也发现德巴利酵母显著提高了奶酪琼脂中醛类和高级醇类的最终浓度，合成2-苯乙醇（玫瑰味）、2-甲基丁醛和2-甲基丙醛(麦芽味、坚果味)，给奶酪带来了更丰富的香气；LI S 等[57]通过比较不同酵母发酵奶酪风味发现马克思克鲁维酵母发酵的奶酪风味质地较佳，乳酸克鲁维酵母能产生玫瑰和蜂蜜的甜味。奶酪中的挥发性硫化物主要来源于蛋氨酸的降解和前体物质甲硫醇的转化，ARFI K 等[58]发现酵母和亚麻短杆菌联合产生挥发性硫化物的能力显著提高。

3.2 对乳制品结构和外观的影响

酵母等真菌可以降低奶酪的硬度和咀嚼力，李莹等[59]在对Cheddar 奶酪添加酿酒酵母发酵时发现：添加酵母越多，奶酪硬度越低。酵母还能改变奶酪的结构，Gabrielly 等通过不同的接种方式发现，接种乳酸克鲁维酵母和戴尔有孢圆酵母后奶酪形成了孔洞；而白地霉则会引起软质羊奶酪产生皱皮[1]。

酵母还能改变奶酪的颜色，特别是涂抹型奶酪表面会呈现红色或者橙色，这是由于表面生长的酵母和细菌产生的色素[60]。BERTUZZI A S 等[54]通过实验发现德巴利酵母与细菌结合可能会改变奶酪的颜色，并使切达奶酪凝乳粒生产出具有不同香味的新型奶酪。ALMUDEN A V 等[41]从西班牙羊奶酪中分离了酵母，发现只有属于耶氏酵母属的分离株能够在添加了不同浓度酪氨酸的奶酪琼脂上产生色素，后深入研究发现该酵母可分解酪氨酸产生棕色色素[61]，例如，解脂耶氏酵母还能代谢酪氨酸使蓝纹奶酪变成褐色。

3.3 对乳制品菌群的影响

酵母在乳制品中生长，通过降解乳酸释放维生素和氨基酸等生长因子，从而促进了细菌种群的生长。有些酵母自溶后也可以促进乳酸菌生长[62]，因此在乳制品中酵母和乳酸菌是相互促进的。HONG J Y 等[48]通过对开菲尔乳的研究也证实了添加酵母后开菲尔乳杆菌的丰度显著增加。酵母还可以通过代谢乳酸生成二氧化碳和水，使奶酪pH 值缓慢上升，而pH 升高后能有效地抑制某些霉菌等有害微生物的生长。同时酵母发酵过程中会产生大量的蛋白酶，分解奶酪蛋白质产生碱性物质，可以中和一些乳酸使奶酪pH 上升[55]。此外，酵母代谢产生的有机酸、挥发性物质等也可抑制或消除导致质量缺陷的有害微生物[1]，延长产品的保质期。

4 乳源酵母益生作用

如表1 所示，相对于传统乳酸菌类益生菌，酵母也有诸多益生优势。由于其耐受力强、对抗生素不敏感、可以用于抗生素相关腹泻的治疗以及安全性高等特点[63]，已经成为潜在的肠道益生菌替代选择。多篇研究表明，从乳制品中分离的部分酵母有较强的益生作用，如HONG J Y 等[48]证实从开菲尔中分离的一株酿酒酵母β-葡聚糖产量高，对肠道细胞的黏附能力强，有作为肠道益生的菌潜力，SHAMEKHI S 等[64]发现一株酿酒酵母可诱导结肠癌细胞凋亡；毕赤酵母可以提高大鼠模型的血浆抗氧化活性，降低血脂水平[65]。马克思克鲁维酵母CIDCA 8154 具有抑制肠道炎症和细胞氧化应激的作用，布拉迪酵母（Saccharomyces boulardii）CNCM I745 能刺激免疫球蛋白分子和众多细胞因子的释放，影响免疫细胞的发育[66]。研究发现大量的酵母菌菌株能在胃肠道运输中存活，并可能影响人体中的微生物平衡，且测试酵母对70%的人体病原微生物、霉菌和致病菌有抑制作用，特别是毕赤酵母和克鲁维酵母，能够同时抑制多个致病菌种群，说明酵母也可以作为人体菌群调节的作用载体[61]，如菌株马克思克鲁维酵母S-02-5 抗氧化能力强，并被证明可作为对抗肠道炎症过程的益生菌[67]。

表1 酵母作为益生菌的优势

研究发现酵母细胞壁糖成分，特别是β-葡聚糖（来自酵母细胞壁中间层的多糖)，是其在体外和体内模型中具有强大的抗癌和抗肿瘤特性的主要原因[64]。报道称德巴利酵母产生的异麦芽糖低聚糖（isomaltooligosaccharide, IMOs)可调节机体免疫[68]，能诱导相比布拉迪酵母更高水平的人类树突细胞IL-10/IL-12分泌[69]。德巴利酵母也是优秀的肠道益生菌，有研究表明，母乳喂养期间新生儿肠道中德巴利酵母种群最多，而断奶后酿酒酵母种群最多[28,66,70]，这是因为IMOs是可以刺激结肠双歧杆菌和乳酸杆菌在大鼠和人体内生长的低聚糖之一[29]。由此可见酵母作为肠道益生菌的应用潜力。

5 展 望

研究表明，酵母在乳制品中分布广泛，且对乳制品的风味、质地和颜色的形成等发挥着重要作用，但从现阶段的工业生产来看，酵母的使用尚未得到普及，开发程度处于较低的水平，这就说明酵母在乳制品中的影响一直是被低估的。因此，应加强对乳源酵母的研究，明确酵母在乳制品中的发酵规律和特性，进一步探索酵母在乳制品发酵过程、改善其风味特征、防治有害微生物、延长产品保质期方面的作用，加大酵母在乳制品生产中的应用空间，打破乳酸菌单一发酵生产的局面，进一步推进乳制品种类和生产工艺的研发。