A2 奶的研究进展及其上游奶源的筛选培养

吴宇银，刘安琪，李庆雷，陈志伟,4

（1.山东理工大学农业工程与食品科学学院，山东 淄博 255000；2.山东理工大学生命与医药学院，山东 淄博 255000；3.山东高速生物工程有限公司，济南 250100；4.山东理工大学食品与营养科学研究院，山东 淄博 255000）

0 引 言

牛乳蛋白质主要有酪蛋白和乳清蛋白两大类，酪蛋白由α-、β-、κ-和γ-组成，其中β-酪蛋白约占总蛋白的40%[1]，其显著特点是帮助婴幼儿成长发育和提高对矿物质的吸收。β-酪蛋白主要存在2 种基因变异体，A1 基因型和A2 基因型，与之相对应的是A1 牛奶和A2 牛奶[2]。A1 和A2 型β-酪蛋白的蛋白质结构存在差异，正是这种差异使A2 型β-酪蛋白比A1 型更接近天然母乳中的蛋白质，成为牛奶蛋白成分研究的热点。

2016 年，首次在临床研究中证明了人类饮用含A2 的A1 奶和只饮用A2 奶的影响差异[3]。从此国内乳品行业开始逐鹿A2 乳品领域，直至目前A2 奶已成为国内各乳品企业研发的新方向，也已打破了新西兰A2 牛奶公司对国内A2 奶粉配方的科技垄断[4]。A2 奶开发的进展，也促进了A2 奶牛畜牧领域的变革。本文介绍了A2 奶的特性及优点、检测方法，关注人类健康，简述上游奶源的研究趋势，对A2 奶在乳品行业引领潮流的原因进行多方面分析，为了解A2 奶发展情况提供参考。

1 A2 奶的研究进展

1.1 A1 与A2 型β-酪蛋白的差异性

最初，自然界中并没有A1 型β-酪蛋白的存在，它是由A2 型β-酪蛋白基因突变产生的，在后续的自然迭代和养殖中没有进行指向性的筛选，导致A1 型β-酪蛋白成为主导，因此A2 基因型被看作原始β-酪蛋白基因型[5]。从纯营养的角度来看，普通牛奶在蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和矿物质方面与A2牛奶相似[6]。A1 型和A2 型β-酪蛋白之间的唯一区别是位置67 处的氨基酸类型，其中A1 型在该位置上结合组氨酸，A2 型结合脯氨酸[7]。由于氨基酸的差异，A1型β-酪蛋白在消化和吸收后，将产生由7 个氨基酸组成的肽段，即β-酪啡肽-7（β-casomorphin-7，简称BCM-7）；A2 型β-酪蛋白在消化后会产生一个由9个氨基酸形成的肽段β-酪啡肽-9（β-casomorphin-9，简称BCM-9）[8]。

A1 和A2 型β-酪蛋白在结构上存在氨基酸的差异，且有研究表明，饮用A1 型牛奶会提高冠心病的发病率并降低身体的免疫功能，增加患心血管疾病的风险，如心脏病、动脉粥样硬化和I 型糖尿病[9-10]，饮用A2型牛奶可减少胃肠道炎症反应[11]。而A2 型β-酪蛋白具有改善婴儿的消化功能的潜力，能够促进机体对营养物质的吸收[12]。表明A2 奶与普通A1 奶相比，对人体的消化负担更小，满足多种人群乳品营养需要。

1.2 普通牛奶中的不利影响因子

BCM-7 全称为阿片肽β-酪啡肽-7，其序列特征为H-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-OH，分子式：C41H55N7O9，分子质量为789.9 g/mol，它可以潜在地影响神经、内分泌和免疫系统中的许多阿片类受体[13]。研究表明，含有A1 型β-酪蛋白的普通牛奶在消化过程中产生的BCM-7 能够被人体直接吸收。BCM-7 是一种外啡肽，具有很高的阿片活性，与μ-型阿片受体有良好的亲和力[14]。研究发现，BCM-7 物质的出现会影响胃肠消化运转和髓过氧化物酶活性，从而导致人体不适[15]。基于目前的研究结果，已经有很多国家的厂商开始对奶牛种群进行筛选并制造A2 型牛奶及其奶制品，为消费者提供更加适合自身体质消化的食品选择。

1.3 A2 奶中β-酪蛋白检测方法

掌握A1、A2 型牛奶的区分方法可以更深刻的了解2 种牛奶本质结构上的不同，以及其检测作用位点的差异。针对人体肠胃消化吸收能力的不同，帮助人们选择更加适合自身肠胃消化的牛奶，对促进人体营养吸收和生长发育有很大的帮助。

目前，在蛋白质层面上，常见的β-酪蛋白分型检测方法包括酶联免疫试剂盒法、液相色谱-高分辨串联质谱法、毛细管区带电泳法、中红外光谱和化学计量学等[16-19]。在基因层面上，借由生物分析技术检测β-酪蛋白分型的方法有LNA 探针法和Rh Amp 检测法等[20-21]。这些方法均有一定适用范围和优缺点，如表1 所示，而基因层面与蛋白质层面的检测相比，具有高通量、快速准确、成本较低等优点，可提高β-酪蛋白分型效率，也可以应用于牛群的基因分型。

表1 β-酪蛋白的检测方法

1.4 A2 奶在食品领域的应用

从物理化学角度来看，与A1 型β-酪蛋白相比，A2 型β-酪蛋白的疏水性较低，形成的胶束较小[22]。有报道称，A2 型β-酪蛋白使牛奶具有较差的凝乳酶凝固特性[23]。NGUYEN H T H 等[24]报告称，与A1 牛奶制成的凝胶相比，A2 牛奶制成的酸性牛奶凝胶具有更低的弹性模量，更高的孔隙率和更薄的蛋白质链。

酪蛋白酸钠是牛奶中主要蛋白质酪蛋白的钠盐，是一种安全无害的增稠剂和乳化剂，被广泛使用在乳制品中。此外，它含有人体所需的全部必需氨基酸，具有很高的营养价值，能够作为营养强化剂食用。YACINE H 等[25]利用小角度X 射线散射探测了分别从A2 和A1A2 奶（普通牛奶）中获得的酪蛋白酸钠粒子的内部结构及界面性质，结果表明酪蛋白酸钠的黏度会随着酪蛋白酸钠浓度的增加而增加。从A2 和A1A2 奶中获得的酪蛋白酸钠的结构和界面性质并无明显差异，这可能是虽然A1 和A2 型β-酪蛋白有差异，但酪蛋白酸钠的数量差异可能不足够大到改变酪蛋白酸钠的行为差异。

NGUYEN H T H 等[24]研究了β-酪蛋白A2 变体与A1 变体对牛奶钙分布、酸性凝胶和发泡特性以及酸性乳凝胶微观结构的影响。研究表明，含β-酪蛋白表型A2A2 的牛奶具有较高比例的游离离子钙，增强了泡沫的形成能力，需要更长的凝胶化时间。与A1A1 奶相比，A2A2 奶凝胶在发酵结束时的储存模量显著降低。与A1A1 乳凝胶相比，A2A2 乳凝胶中具有更多孔的微观结构和更薄的蛋白质链导致凝胶强度更低。这可能支持乳制品生产商开发具有不同功能特性的新型乳制品。

此外，现阶段乳品企业对婴幼儿A2 奶粉配方的研究较多，其中A2 牛奶公司更是A2 奶的领军“人物”。之后，快速发展的A2 乳品领域无疑成为了许多乳品企业的选择，而随着实力雄厚的乳品企业的不断涌入，反过来又使A2 奶市场规模不断扩大，吸引了越来越多的关注。这不仅推动了有关A2 奶物理结构特性的研究，也推动了A2 奶作用于动物体影响其生理指标的科学研究，为A2 奶的营养作用机制提供更完善、更明确的理论支撑。

1.5 A2 奶的优点及其市场发展

普通牛奶中的β-酪蛋白以A1 型酪蛋白为主，若牛奶中的β-酪蛋白全是A2 型，则该牛奶就是所谓的“A2 奶”。中国人饮用牛奶后出现胃肠道失调的症状约占90 %。亚洲人出现乳糖不耐受的症状是较为普遍的，表现为饮用牛奶后会引起不同程度的腹胀、腹痛、腹泻等胃肠不适[3]。后来有研究表明，A2 奶更近似于母乳，易于被人体吸收，可以缓解乳糖不耐受症状，改善腹胀、肠道噪音和消化舒适等。

随着乳品行业的发展，A2 型β-酪蛋白乳制品将成为乳制品消费的新热点，这使得A2 型β-酪蛋白乳制品也转变为乳品企业的“战场”，成为国内外乳品企业竞争更为激烈的项目[8]。继A2 公司之后，惠氏（Wyeth）、达能（Danone）、君乐宝（Junlebao）、飞鹤（Feihe）、伊利（Yili）、雅培（Abbott）、新希望（New Hope）等知名乳企也推出了新的A2 蛋白奶粉产品。除此之外，下游乳品企业的需求增长推动了上游A2 型奶牛畜牧业在A2 奶源领域的发展布局[4]。推动了A2 奶源建设牧场，且更多新建牧场在规划时就考虑到A2 基因奶牛的筛选和育种。

2 A2 奶与人体健康

2.1 A2 奶可降低Ⅰ型糖尿病发病率

Ⅰ型糖尿病，旧称青少年糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病，是一种代谢紊乱综合征，主要是由于通过免疫介导胰腺β细胞的破坏造成的[26]。在针对不同年龄段饮用牛奶人群的调查中发现，婴幼儿对于牛奶的依赖要远高于成年人，且他们的肠道中更易吸收BCM-7[27]，使部分研究聚焦于牛奶与Ⅰ型糖尿病之间的相关性。研究人员针对不同国家和地区牛奶的发病率和消费量进行调查，尝试确定牛奶是否会诱发Ⅰ型糖尿病，在这些研究中，有认为A1 奶更易引发Ⅰ型糖尿病的结论[28-30]，但也存在一些相反的结论[31-32]。ELLIOTT R B 等[33]在相关的动物实验中发现，以A2奶饲养的小鼠，其I 型糖尿病的发病率低于用A1 奶饲养的小鼠。ELLIOTT R B 等[34]的其他研究表明，A2型β-酪蛋白可改善Ⅰ型糖尿病发病率，但关于其在人体内作用的临床研究尚未开展，暂时不能证明A2奶消化吸收后的产物与Ⅰ型糖尿病存在直接相关性。

2.2 A2 奶有助于调节情绪

乳汁是哺乳动物早期生命中营养的主要来源，戒掉乳汁和引入固体食物的过程，被称为断奶过程。AYA O 等[35]研究表明，断奶可能通过调节发育中的肠-脑轴来影响中枢神经系统的成熟，导致动物情绪发生变化。经过LUTZ P E 等[36]的研究，对断奶年龄的大鼠进行了高亲和力μ-阿片受体[37]（μ-opioid receptors，MOPrs）和催产素受体[38]（Oxytocin receptors，OTrs）的定量放射自显影结合，选择这些受体是因为其对断奶引起的变化很敏感，并参与了情绪调节机制。结果表明A1 奶显著增加了大鼠的应激诱导静止，使得MOPrs 和OTrs 的脑区域特异性改变，以及尿生化档案的改变。此外，尿肠道微生物代谢物与大脑代谢物的改变密切相关。这些发现表明，在断奶后饮用含有A1 型β-酪蛋白的牛奶可能通过一种可能的肠-脑轴机制影响情绪[35]，而在断奶后饮用A2 奶则不会对应激诱导静止行为产生负面影响，也不会诱导MOPrs 密度的脑特异性变化，且可以有效调节断奶后大鼠的情绪。

一项自闭症儿童的研究结果表明，自闭症儿童尿液中BCM-7 的含量远高于正常儿童，且BCM-7 的浓度与患病情况的严重程度呈正相关[39]。但目前还未有与人相关的临床研究来证明A2 奶可调节情绪。

2.3 A2 奶可改善肺部炎症

牛奶的主要消化过程主要在胃肠道中进行，因此多数研究集中在A1、A2 型β-酪蛋白的消化影响[40]。SUN 等[2]的一项研究表明，饮用A1 型β-酪蛋白的牛奶会恶化胃肠道症状。在小鼠模型中，喂食来自A1A1和A1A2 奶牛的β-酪蛋白增加了Th-2 驱动的肠道炎症[9,41]。但SHIKHA Y 等[42]的研究探讨了牛奶中A1和A2 型β-酪蛋白变异作为导致小鼠模型过敏性气道疾病的因素。A1A1 奶喂养小鼠支气管肺泡灌洗液和血清中IL-4 和IL-5 水平显著升高，IgE 和IgG 水平也显著升高。同时，淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的扩张增加，导致支气管周围炎症。A1A2 奶粉喂养小鼠的表型为中间型，而A2A2 奶喂养小鼠的表型与对照组匹配，即未呈现炎症。从相关研究中可表明，A1 奶对肺有促炎症缺陷，导致表型与典型的过敏性哮喘表型密切匹配，但A2 奶不会出现此类症状。可惜的是还未有临床研究证明A1 奶会直接引发人体肺部炎症，而A2 奶不会出现此状况。

3 A2 型奶牛的培养及筛选

3.1 A2 型奶牛养殖现状

目前，许多海外乳品企业已开始生产和销售A2 乳制品，且A2 型β-酪蛋白畜群已成为主要的奶源[43]，但国外尚无关于A2 型畜群生产和养殖的研究报告。

国内奶牛的基因筛查工作已经开始，大规模的育种和养殖工作也已逐步推进。其中，山东奥克斯畜牧种业有限公司已对A2 型β-酪蛋白荷斯坦种公牛进行定向培育工作，建立了种母牛群和种公牛群A2 型β-酪蛋白基因型鉴定方法，筛选获得A2 型β-酪蛋白奶牛种群，结合奶牛群体改良（Dairy Herd Improvement，DHI）测定、计划选配、靶向培育出具有高产A2型β-酪蛋白遗传基础的种公牛[44]。有很多牧场根据β-酪蛋白多态性来选择牛群，为了在牛群中选育出纯合A2A2 型个体，研究人员可采用各种不同的方法，如PCR-SSCP 法[45]、KASP 法、Taq Man 法等。对奶牛的分类培育养殖，有利于乳企通过加工工艺制作出不同风味且易消化吸收的A2 型乳制品，全面满足不同体质人群对牛乳营养的需求。

3.2 A2 型奶牛基因分型方法

3.2.1 单链构象多态性法

单链构象多态性PCR（Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products, PCR-SSCP）是一种基于DNA 构象差异检测点突变的方法。如果相同长度的单链DNA 的碱基序列不同，则形成的构象就会不同，从而形成单链构象多态性。

单链DNA 片段呈现复杂的空间折叠构象，这主要是通过分子内相互作用（如碱基配对）来维持的。当某一碱基改变时，其空间构象会受到不同程度的影响，导致构象发生变化。在聚丙烯酰胺凝胶中具有不同空间构象的单链DNA 分子的抗性是不同的。在已知基因型（A1A2、A2A2）的参考样品中，PCR 产物为234 bp的17 %聚丙烯酰胺（丙烯酰胺∶双丙烯酰胺=100∶1）凝胶上同时检测所有变体的效果最好[46]。这些结果通过对直接从聚丙烯酰胺凝胶中切下的等位基因特异性SSCP 条带进行测序得到证实。因此，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）可能对具有不同构象的分子非常敏感，进而非常灵敏地将其分离出来。

3.2.2 竞争性等位基因特异性PCR（KASP）法

引物混合物是由2 个正向引物和1 个反向引物组成的，2 个引物具有2 个公共标签和链接的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）位点。进行第1 轮PCR 扩增，将DNA 模板与引物混合物中的相应引物结合，扩增完成SNP 鉴定。然后进行第2轮PCR 扩增，以扩增等位基因末端的特异性标记序列。最后进行第3 轮PCR 扩增，随着PCR 扩增，与特异性序列对应的检测引物呈指数级增长，检测到相应的信号。根据2 种不同的荧光基团和聚类效应，确定SNP 分型[47]。

3.2.3 Taq Man 法

Taq Man 法的基本原理是在PCR 扩增过程中添加一对引物和一个特定的荧光探针，荧光探针的5'端与报告基团连接，3' 端与淬灭基团连接[43]。探针完成后，发射荧光信号的报告基团被淬灭基团吸收，经PCR 扩增后，5'-3' 定义的Taq 酶的酶活性可以切断探针酶的降解，使报告基团与荧光猝灭反应分离，使荧光监测系统能够接收到荧光信号，即对于每条AMPL DNA 链，都能想成一个荧光分子，荧光信号的积累与PCR 的扩增形成同步产品，这样就可以达到突变检测的目的。新的Taq Man MGB 探针可实现定量遗传分析和SNP 分析，具有区分A1 或A2 型个体的高灵敏度。

4 总结与展望

目前，国内A2 奶研发仍处于初步阶段，但经过国内各乳品企业对A2 奶的创新发展，已经推动其上游奶源布局发生变动。为促进国内A2 乳业更好、更健康、更长远的发展，国内乳品企业仍需通过提升研发及检测水平、提高产品质量、丰富产品类型，来降低A2 奶的生产成本，同时做好A2 奶的科普宣传工作，提升消费意识。此外，要利用好天然牧场地区的优势，对A2 基因型奶牛进行筛选、培育和饲养，因地制宜生产天然A2 奶，采用先进发展A2 奶生产地区带动后发展地区的合作模式，多方面、全方位满足人们对乳制品营养摄入的需求。