毛细管电泳联用电喷雾电离质谱法测定5种植物激素的含量

黄端华 ,李 鑫 ,张 兰∗

(1.福建船政交通职业学院,安全与环境学院,福州 350007;2.福州大学 化学学院,福州 350116)

植物激素可对植物的生长发育起到促进或抑制作用[1]。植物激素包括生长素类、脱落酸、细胞分裂素类、赤霉素类、乙烯等5 大类。吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-丙酸(IPA)、萘乙酸(NAA)、6-苄基氨基嘌呤(BA)和脱落酸(ABA)等5种植物激素是5大类中常被使用的生长调节剂。其中,IAA、IPA和NAA 等属于植物激素中的生长素,应用于农业生产中可调控植株生长、改良性状、提高产量[2-3]。BA 属于细胞分裂素,是一种能够促进胞质分裂的物质,与生长素协同促进植物组织生长,BA 在园艺、农业等领域中的应用最为广泛。ABA 能够促进种子休眠和脱落来维系植物体的生长[4]。通过对植物生长、分裂、脱落等全过程的激素含量分析和动态监测,有助于指导农民合理使用植物激素,同时也能为农作物栽培研究提供数据支撑。

目前,植物激素含量的测定方法主要有液相色谱法及液相色谱-质谱联用法[5-9]、气相色谱法及气相色谱-质谱联用法[10]、毛细管电泳法[11]等。其中,毛细管电泳法由于其用量少、分离快速等优点,在开展植物激素的分析研究中取得了一定的进展[12-14]。有报道采用毛细管电泳-串联质谱法对椰子中的玉米素(Z)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、赤霉素(GA)等进行富集分离[15]。目前,对生长、分裂和脱落等类别植物激素的同时分离和检测的方法未见报道。本工作选取5种含生长、分裂和脱落等类别植物激素IAA、IPA、NAA、BA 和ABA 为研究对象,采用毛细管电泳联用电喷雾电离(ESI)质谱法(CE-ESIMS)测定上述5种植物激素的含量。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

毛细管电泳联用电喷雾电离质谱仪,配1100系列单重四极杆质谱、G1607A 电喷雾接口和1100系列恒流泵;未涂层石英毛细管(90 cm×50μm,375μm);Milli-Q 型超纯水器。

单标准储备溶液:1.000 g•L－1,准确称取IAA、IPA、NAA 和ABA 标准品,分别用乙腈溶解并定容,配制成1.000 g•L－1单标准储备溶液;准确称取BA 标准品,用0.1 mol•L－1氢氧化钠溶液溶解并定容,配制成1.000 g•L－1单标准储备溶液,并储存于4 ℃冰箱。

IAA、IPA、NAA、BA 和ABA 标准品的纯度均大于98%;乙腈为色谱纯;其他试剂均为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 电泳条件

未涂层石英毛细管柱,进样压力5 kPa,进样时间2 s,毛细管卡盒内温度为25 ℃;运行缓冲液为pH 6.0 的乙酸-乙酸铵缓冲液,浓度为15 mmol•L－1;有机改进剂为2%(体积分数)乙腈溶液;分离电压为22 kV。

1.2.2 质谱条件

ESI源,负离子(ESI－)模式;雾化气(氮气)压力69 kPa,干燥气流量6.0 L•min－1,温度150 ℃;鞘流液为含0.11%(体积分数,下同)乙酸的50%(体积分数,下同)异丙醇溶液,流量设为3.0μL•min－1,由恒流泵传送;全扫描(SCAN)数据采集模式,扫描范围 质荷比(m/z)200～400;选择离子监测(SIM)数据采集模式,IAA、IPA、NAA、BA、ABA的定量离子分别为m/z176,190,187,226,265。

1.3 试验方法

准确称取8.0 mg生根粉样品,用水溶解并定容至250 mL容量瓶中。分析前用水稀释30倍,并用0.22μm 滤膜过滤后进样。

2 结果与讨论

2.1 电泳条件的选择

电泳运行时,分离电压会影响分离组分整体的分离时间,电压越大分离越快,但过高电压也会导致较高的焦耳热。综合考虑分离时间、灵敏度等因素,选择22 kV 为分离电压。

由于ESI-MS的离子源容易受不挥发性缓冲盐的污染,也可能因为缓冲盐的干扰影响样品离子的生成,因此在ESI-MS系统中常选择乙酸、甲酸、乙酸铵、氨水等挥发性的组合体系来控制酸度。结合研究对象IAA、IPA、NAA、BA 和ABA 的pKa值(分别为4.75,6.15,4.23,6.15,4.80),采用酸性的缓冲体系即乙酸-乙酸铵缓冲液作为运行缓冲液,分别考察了运行缓冲液的酸度、浓度及其有机改进剂对测定结果的影响。

2.1.1 运行缓冲液的酸度

试验考察了运行缓冲液乙酸-乙酸铵缓冲液的酸度(pH 分别为4.0,5.0,6.0)对5种植物激素分离的影响,结果见图1。

图1 乙酸-乙酸铵缓冲液的酸度对5种植物激素分离的影响Fig.1 Effect of acidity of acetic acid-ammonium acetate buffer solution on separation of five plant hormones

由图1 可知:当乙酸-乙酸铵缓冲液的pH 为4.0时,待测组分中的ABA 和IPA 不能实现分离;当乙酸-乙酸铵缓冲液的pH 为5.0时,IAA 分离时间较长;当乙酸-乙酸铵缓冲液的pH 为6.0时,所有组分均能实现分离且分离时间较短。因此,试验选择pH 6.0的乙酸-乙酸铵缓冲液。

2.1.2 运行缓冲液的浓度

试验考察了pH 6.0的乙酸-乙酸铵缓冲液的浓度(10,15,20,25 mmol•L－1)对5种植物激素峰面积的影响,结果见图2。

图2 乙酸-乙酸铵缓冲液的浓度对5种植物激素峰面积的影响Fig.2 Effect of concentration of acetic acidammonium acetate buffer solution on peak area of five plant hormones

结果表明,当pH 6.0的乙酸-乙酸铵缓冲液的浓度为15 mmol•L－1时,BA 和IPA 的峰面积显著大于其他浓度的,同时5种待测组分能够实现基线分离。因此,试验选择pH 6.0的乙酸-乙酸铵缓冲液的浓度为15 mmol•L－1。

2.1.3 有机改性剂

在电泳分析中等极性和弱极性的有机组分时,使用有机改性剂能够通过改变待测组分的溶解性或改变毛细管内壁的表面性质来改善灵敏度和分离性能。试验选择乙腈溶液作为有机改性剂,考察其体积分数分别为0,2%,4%,6%时对5种植物激素峰面积的影响,结果见图3。

图3 有机改性剂对5种植物激素峰面积的影响Fig.3 Effect of organic modifier on peak area of five plant hormones

结果表明,乙腈的添加改善了各待测组分的响应值,其中对BA 影响较为显著,当乙腈的体积分数为2%时获得最佳的结果。因此,试验选择添加乙腈的体积分数为2%。

2.2 鞘流液组成及流量的选择

试验考察了鞘流液中异丙醇的体积分数(30%,40%,50%,60%,70%)对质谱响应的影响,结果发现,当异丙醇的体积分数为50%时能够获得较好的峰形和较强的质谱响应。在50%异丙醇溶液中尝试添加乙酸,并考察了乙酸的体积分数(0.038%,0.075%,0.11%,0.15%)对质谱响应的影响,结果显示乙酸的体积分数为0.11%时,质谱响应强。因此,试验选择含0.11%乙酸的50%异丙醇溶液为鞘流液。

进一步考察了鞘流液的流量在2.0～5.0μL•min－1内对质谱响应的影响。结果表明,鞘流液的流量为3.0μL•min－1时,质谱峰形和响应优于其他流量的,因此试验选择3.0μL•min－1为鞘流液流量。

2.3 毛细管电泳谱图

在仪器工作条件下,5种植物激素的总离子流图和选择离子流图见图4。

图4 5种植物激素的总离子流图和选择离子流图Fig.4 Total ion chromatogram and selected ion chromatograms of five plant hormones

2.4 标准曲线和检出限

取适量的单标准储备溶液,用运行缓冲液逐级稀释,配制成NAA 质量浓度为0.05,0.50,1.00,2.00,4.00,8.00,10.00 mg•L－1,BA、ABA、IPA、IAA 的质量浓度均为0.10,0.50,1.00,2.00,4.00,8.00,10.00 mg•L－1的混合标准溶液系列。按照仪器工作条件进行测定,以5种植物激素的质量浓度为横坐标,质谱响应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。所得线性范围、线性回归方程、相关系数见表1。

表1 线性参数和检出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

按照3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),结果见表1。

2.5 精密度试验

取混合标准溶液,在仪器工作条件下连续分析5次,计算5 种植物激素峰面积的相对标准偏差(RSD)。结果显示,NAA、BA、ABA、IPA 和IAA峰面积的RSD 依次为4.3%,3.9%,3.0%,3.9%,3.3%,均小于5.0%,说明进样重现性良好。

2.6 样品分析和回收试验

按照试验方法处理实际生根粉样品,进样分析3次。结果显示,样品中检出NAA,质量浓度为0.078 mg•L－1,经计算得到生根粉样品中NAA 的质量分数为73.1 mg•g－1。在上述处理好的生根粉样品中,分别添加0.500 mg•L－1和5.00 mg•L－1两个浓度水平的混合标准溶液,进行加标回收试验。每个浓度水平平行配制3份,在仪器工作条件下分析,计算回收率,结果见表2。

表2 回收试验结果Tab.2 Results of test for recovery

由表2 可知,5 种植物激素的回收率为92.4%～114%,说明方法准确度良好。

本工作采用CE-ESI-MS测定多种多类植物激素的含量,优化了电泳分离条件和质谱检测条件,并成功地将方法用于生根粉中植物激素的检测。该方法结合了毛细管电泳的分析时间短、分离效率高和质谱的灵敏度高和结构解析能力强的优点,实现了样品中组分的快速定性和准确定量分析,有望在农作物栽培育种和生长调节剂使用领域得到推广应用。