高效液相色谱-串联质谱法测定进口新冠特效药中有效成分的含量

麦晓霞,谭智毅,张海峰,张子豪,徐金梅,颜焯文,肖 前,刘莹峰,郑建国

(广州海关技术中心,广州 510623)

新冠特效组合药帕罗韦德获得美国食品药品监督管理局批准紧急使用授权申请[1],作为治疗COVID-19的口服新型特效药。其后,辉瑞与“药品专利池”(MPP)达成协议,向95个国家和地区的合格仿制药企发放仿制授权。2022年2月,国家药品监督管理局附条件批准帕罗韦德进口注册,用于成人伴有进展为重症高风险因素的轻至中度COVID-19患者[1]。根据2019 版«中华人民共和国药品管理法»规定,国外已上市、国内未获批的药品不再被简单地认为是假药,虽然仿制药不能在中国销售,但较大的需求量仍会促使仿制药通过各种渠道流入市场。随着人们对药品的需求量增大,用药的安全性和有效性日益受到重视。

帕罗韦德是由两种药片组成的复方抗病毒组合药。其中一片是奈玛特韦(150 mg),其是一种新冠病毒的3CL主蛋白酶抑制剂,3CL 主蛋白酶是冠状病毒复制过程中的关键蛋白酶,奈玛特韦通过抑制这种蛋白酶阻止冠状病毒的复制;另一片是利托那韦(100 mg),为HIV-1 蛋白酶抑制剂和CYP3A4(细胞色素P4503A4酶)抑制剂[2],虽然利托那韦对新冠病毒主蛋白酶无活性,但可以抑制CYP3A4介导的奈玛特韦代谢,以帮助其在生物体内保持长时间的高浓度水平和活性[3-4]。因此,复方抗病毒药中奈玛特韦是主要的活性成分,其实际含量直接关系到患者的生命安全。建立进口新冠特效药中奈玛特韦和利托那韦的定量检测方法对于确保进口新冠药物质量和保障消费者安全具有重要意义。

目前国内外关于奈玛特韦和利托那韦的检测技术报道较少,主要是针对HIV 蛋白酶抑制剂利托那韦的测定,奈玛特韦的测定报道较少。相关文献报道了家禽肉类、头发、血浆等基质中利托那韦的检测,其主要采用高效液相色谱-串联质谱法[5-11]、液相色谱法[12-14],但对于市场需求依然较高的新冠特效药有效成分奈玛特韦和代谢抑制剂利托那韦的高效液相色谱-质谱法还未见相关报道。本工作提出了高效液相色谱-串联质谱法测定进口新冠特效药中奈玛特韦和利托那韦含量的方法,方法灵敏度高、快速、准确,可用于进口新冠特效药中奈玛特韦和利托那韦的批量分析。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260 型高效液相色谱仪,Agilent 6410型三重四极杆串联质谱仪,配电喷雾离子(ESI)源和 Mass Hunter 软件数据处理系统;AS20500A 型超声波发生器;Milli-Q 型超纯水机。

奈玛特韦标准储备溶液:1 000 mg•L－1,准确称取适量的奈玛特韦标准物质,用甲醇溶解并定容,配制成质量浓度为1 000 mg•L－1的奈玛特韦标准储备溶液。同法制备利托那韦标准储备溶液。

混合标准溶液:1.0 mg•L－1,分别移取奈玛特韦标准储备溶液和利托那韦标准储备溶液各100μL置于同一100 mL 容量瓶中,用甲醇溶解并定容,配制成质量浓度为1.0 mg•L－1的混合标准溶液。

混合标准溶液系列:移取适量的混合标准溶液,用水逐级稀释,配制成质量浓度分别为2,5,10,20,50,100,200μg•L－1的混合标准溶液系列。

奈玛特韦标准物质的纯度为96.6%,利托那韦标准物质的纯度为99.5%;甲醇为色谱纯;三氯乙酸为分析纯;试验用水为超纯水。

样品来自入境口岸旅客私藏药物,规格:3×10粒装双组分口服复合制剂。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.8μm);柱温35 ℃;进样体积5μL;流量0.2 mL•min－1;流动相A 为0.1%(体积分数,下同)三氯乙酸溶液,B 为甲醇;梯度洗脱程序:0～1 min时,B为40%;1～2 min 时,B 由40%升至90%,保 持5 min;7～8 min 时,B 由90%降 至40%,保持6 min。

1.2.2 质谱条件

ESI源,正离子(ESI＋)模式;多反应监测(MRM)模式;干燥气温度350 ℃;氮气流量7 L•min－1;雾化器压力310 kPa,毛细管电压3 800 V;驻留时间100 ms。

其他质谱参数见表1,其中“∗”代表定量离子。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

取一颗药片样品,称量,记录质量(约0.6 g,精确至0.001 g),研磨粉碎均匀后将样品置于20 mL螺口旋盖玻璃瓶中,加入15 mL 50%(体积分数,下同)甲醇溶液,常温下超声溶解20 min,并转移至25 mL容量瓶内,用50%甲醇溶液多次洗涤螺口旋盖玻璃瓶壁,定容。移取上述溶液10 mL至15 mL塑料离心管中,以转速6 000 r•min－1离心3 min,取上层澄清溶液100μL,转移至100 mL容量瓶中,用50%甲醇溶液定容,过有机微孔滤膜,按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

试验分别采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-含0.1%(体积分数,下同)甲酸的5 mmol•L－1甲酸铵溶液和甲醇-0.1%三氯乙酸溶液作为流动相体系,对20μg•L－1的混合标准溶液进行测定。结果表明:目标物在乙腈-水体系中响应较弱且色谱峰有拖尾现象,在甲醇-水体系中的响应比在乙腈-水体系中的稍强,但峰形仍然有拖尾或前伸,这可能是目标物离子和色谱柱的硅羟基之间存在弱的相互作用导致。在水相中添加缓冲盐或酸性改性剂可有效地改善峰形,甲醇-含0.1%甲酸的5 mmol•L－1甲酸铵溶液体系能较好改善峰形,而甲醇-0.1%三氯乙酸溶液体系不仅改善了峰形,且目标物响应较高。因此,试验选择甲醇-0.1%三氯乙酸溶液体系作为流动相。

2.2 检测器与质谱条件的选择

在相同的色谱条件下,分别采用二极管阵列检测器和质谱检测器对1.0 mg•L－1混合标准溶液进行测定。使用二极管阵列检测器在190～400 nm内对1.0 mg•L－1混合标准溶液进行扫描,两种目标物奈玛特韦和利托那韦的紫外吸收光谱均在210 nm 左右有最大吸收;但标准物质和样品均在205 nm 和225 nm 存在较大的干扰,使基线增高,色谱峰也较多,影响准确定量;ESI＋模式下质谱干扰相对较少,色谱峰明显,因此选择质谱检测器进行检测。

用1.0 mg•L－1(相当于10 ng)混合标准溶液进行测试,在ESI＋模式下以不同传输电压进行一级质谱扫描。结果表明:奈玛特韦和利托那韦最强峰的准分子离子峰为[M＋H]＋,如奈玛特韦正离子[C23H33F3N5O2]＋对应的m/z为500.4,利托那韦正离子[C37H49N6O5S2]＋对应的m/z为721.4;奈玛特韦和利托那韦还易于形成[M＋Na]＋和[M＋K]＋的准分子离子峰,如图1(a)和图1(c),对应m/z分别为522.4,538.4 和743.4,759.4。分别以0～60 e V 的碰撞能量对[M＋H]＋准分子离子进行子离子模式扫描,得到子离子信息和子离子对应的碰撞能量。奈玛特韦分子离子可能易于形成通过酰胺键C－N 或相邻C－C键断裂重排形成的系列子离子,如[C15H22F3N2O2]＋、[C19H31N4O2]＋和[C18H27F3N3O3]＋等离子片段,对应的m/z为319.3,347.4和390.3,见图1(b)。利托那韦也是易于断裂酰胺键C－N 或相邻C－C 键形成重排子离子,如[C13H21N3OS]＋、[C14H21N3O2S]＋和[C23H27N3O3S]＋等离子片段,对应的m/z为268.1,296.1和426.0,见图1(d)。选取响应最大、干扰较少和确定结构的碎片子离子作为定量、定性离子。为得到较好的灵敏度,分别对子离子、碎裂电压、碰撞能量等参数进行优化。奈玛特韦和利托那韦优化后的参数和MRM 色谱图见表1和图2。

图1 奈玛特韦和利托那韦的准分子离子和子离子分布质谱图Fig.1 Precursor ion and daughter ion distribution mass spectra of nirmatrelvir and ritonavir

图2 奈玛特韦和利托那韦的MRM 色谱图Fig.2 MRM chromatogram of nirmatrelvir and ritonavir

2.3 工作曲线和测定下限

配制含有药物填料基质的2,5,10,20,50,100,200μg•L－1的混合标准溶液系列,按照仪器工作条件进行测定。以目标物的质量浓度为横坐标,对应的峰面积为纵坐标绘制工作曲线。结果表明,奈玛特韦和利托那韦的质量浓度在2～200μg•L－1内与对应的峰面积呈线性关系,所得的线性回归方程和相关系数见表2。

表2 线性参数和测定下限Tab.2 Linearity parameters and lower limits of determination

以10倍信噪比(S/N)计算测定下限(10S/N),结果见表2。

2.4 精密度与回收试验

取空白药物样品,加入50%甲醇溶液使样品完全浸泡,定量添加混合标准溶液,使加标水平分别为10,50,200μg•L－1,每个加标水平平行测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表3。

表3 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表3可知,奈玛特韦和利托那韦的回收率为92.5%～115%,测定值的RSD 均小于8.0%。

2.5 样品分析

按照试验方法对通过口岸进口的30批新冠特效药品进行检测,结果表明,9个样品中检出奈玛特韦和利托那韦有效成分,1个样品中均未检出以上两种成分,值得关注的是其他20个样品中只检出利托那韦,未检出奈玛特韦。在若干已检出阳性样品和未检出奈玛特韦的样品中,通过对样品溶液全扫描检出了其他成分,其中出现最多的为奥司他韦,图3(a)为测定某进口新冠药物样品复合制剂A 药片中奈玛特韦和利托那韦的MRM 色谱图,图3(b)为某进口新冠药物样品复合制剂A 药片的全扫描色谱图,检出主要成分为奥司他韦,未检出奈玛特韦。

图3 某新冠特效药品的MRM 色谱图、全扫描色谱图和质谱图Fig.3 MRM chromatogram,full-scan chromatogram and mass spectra of a novel coronavirus specific drug

图3(c)和(d)为样品中奥司他韦的质谱图和子离子质谱图,从子离子片段可知样品的主要色谱峰成分为奥司他韦,其中12个典型药物样品的测定结果见表4。

表4 12个典型药物样品的测定结果Tab.4 Determination results of 12 typical drug samples

本工作提出了高效液相色谱-串联质谱法测定进口新冠特效药中有效成分奈玛特韦及利托那韦含量的方法。该方法具有操作简便、灵敏度高、精密度及准确度好的特点,能满足进口新冠药物中奈玛特韦和利托那韦有效成分的批量测定要求。